LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

Summary

هنا نستخدم مكتبة LentiPlex الإنسان المجمعة التقليدية وأساليب التسلسل الجيني لتحديد أهداف تعزيز بقاء الخلية. نحن لشرح كيفية إعداد وdeconvolute شاشة LentiPlex والتحقق من صحة النتائج.

Abstract

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو آلية جوهرية الخلوية لتنظيم التعبير الجيني. تسخير قوة فطرية لهذا النظام يتيح لنا ضربة قاضية لمستويات التعبير الجيني في فقدان دراسات وظائف الجينات.

هناك طريقتين رئيسيتين لأداء رني. الأولى هي استخدام الصغيرة RNAs والتدخل (siRNAs) التي تم توليفها كيميائيا ، والثاني يستخدم قصيرة القاسي الرناوات (shRNAs) المشفرة داخل البلازميدات ^1. يمكن transfected الأخير في الخلايا مباشرة أو حزم جسيمات في تكرار lentiviral غير كفء. المزايا الرئيسية لاستخدام shRNAs lentiviral هو سهولة إدخالها في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، وقدرتهم على الاندماج في جينوم ثابت لفترة طويلة الأجل واختيار الجينات ضربة قاضية ، ومدى فعاليتها في إجراء عالية الإنتاجية من الشاشات فقدان الوظيفة. لتسهيل هذا وضعنا LentiPlex المجمعة shRNA المكتبة.

وMISسيون مكتبة LentiPlex shRNA الإنسان مجمع بركة الجينوم على نطاق lentiviral المنتجة باستخدام عملية الملكية. مكتبة يتكون من بنيات shRNA أكثر من 75،000 من الهيئة تستهدف جمع 15000 + ² الجينات البشرية. يتم اختبار كل مكتبة للتمثيل shRNA قبل الافراج المنتج لضمان تغطية قوية المكتبة. وتقدم المكتبة في شكل جاهز للاستخدام في lentiviral التتر ما لا يقل عن 5 × 10 ⁸ مل / TU عبر فحص P24 وقبل مقسمة إلى عشرة subpools حوالي 8000 shRNA يبني كل منهما. كما يتم توفير التضخيم وتسلسل الاشعال لتحديد الهدف المصب.

أثبتت الدراسات السابقة نشاط انتيتومور المتآزر لTRAIL عندما يقترن باكليتاكسيل A549 في الخلايا ، وسرطان الرئة الخلية البشرية السطر ^{3 ، 4.} في هذه الدراسة تثبت أننا في تطبيق مكتبة LentiPlex shRNA المجمعة لإجراء سريعا شاشة اختيار إيجابية للجينات تشارك في السمسة سو A549 الخلايا عند تعرضها للتريل وباكليتاكسيل. حاجز واحد واجه كثير من الأحيان مع شاشات عالية الإنتاجية والتكلفة وصعوبة في deconvolution ، ونحن من التفصيل أيضا نهجا فعالا من حيث التكلفة النسائل المتعددة باستخدام التسلسل التقليدي.

Protocol

إعداد LentiPlex الشاشة المجمعة

لتحديد تسلسل shRNA الفائدة ، فمن الأهمية بمكان إقامة مثل هذه الشاشة أن غالبية خلايا استقبال واحد فقط shRNA بناء. باستخدام منخفضة وزارة الداخلية (تعدد العدوى) ، وانخفض إلى حد كبير من احتمال integrants متعددة لكل خلية. ومع ذلك ، تنبيغ الكفاءة ، وبالتالي المطلوب موييس ، يعتمد بشدة على نوع من الخلايا المستهدفة. وبالتالي ، فمن الضروري أن يتم تحديد وزارة الداخلية الأمثل من قبل أن تبدأ الشاشة في نوع من الخلايا الجديدة.

1. تنبيغ من الخلايا المستهدفة مع بعثة LentiPlex shRNA مجمع المكتبة

1. وسوف تستخدم وزارة الداخلية الفعلية تختلف عن أنواع مختلفة من الخلايا. وإذا كان يتطابق المطلوب فلا بد من زيادة عدد اللوحات وفقا لذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه عادة لا يكون من المفيد الجمع بين subpools مختلفة. والحفاظ على الفصل بين المساعدات subpools في عملية deconvolution. ضمان propeص وسم كل طبق نسيج الثقافة مع عدد subpool التي يتم تطبيقها خلال تنبيغ. ينصح المنخفض وزارة الداخلية للحد من احتمال integrants متعددة لكل خلية.
2. اليوم 1 -- بذور العدد المناسب من عيار 60 ملم الأطباق مع خلايا كافية للحصول على 70 ٪ ~ confluency في اليوم التالي (10 حمامات في المجموع ، كل أجريت في ثلاث نسخ = 30 الأطباق المجموع). لدراستنا ، كانت أطباق المصنفة 60 ملم مع 6 × 105 خلايا A549 لتحقيق confluency من 70 ٪ قبل تنبيغ. هذا يضمن أن الخلايا لا تزال في مرحلة النمو الأسي. ومعدلات النمو تختلف من نوع من الخلايا ، ويجب أن تحدد قبل بدء الشاشة.
3. يسمح للخلايا التي يحتضنها الالتزام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ _2.
4. (اختياري) تشمل اثنين من عيار 60 ملم إضافية عن الأطباق تنبيغ مع shRNAs مراقبة سلبية. تسمية الأطباق "السيطرة على" لSHC001H و "باء التحكم" لSHC002H.
5. اليوم 2 -- تنبيغ عشره مع الخلايا والجزيئات LentiPlex الفيروسية. يوم تنبيغ ، ذوبان الجسيمات lentiviral على الجليد.
6. نقل الجزيئات المذابة إلى تدفق الصفحي هود والحفاظ على الجليد إذا لم يتم استخدامها على الفور.
7. حساب مقدار كل فرد الفيروسية تجمع الفرعي لإضافة إلى الخلايا للحصول على وزارة الداخلية من 1 في جميع الأطباق ثقافة الخلية.
   1. على سبيل المثال : 1 × 10 ⁶ خلية / صحن ؛ عيار الفيروسية = 5 × 10 ⁸ TU / مل ؛ والمطلوب من 1 وزارة الداخلية. ط) 1 × 10 ⁶ خلية / طبق × (وزارة الداخلية من 1) = 1 × 10 ^{6 وحدات} حاجة transducing (TU) الثاني) 1 × 10 ⁶ TU / (5.0 × 10 ⁸ TU / مل) تم الحصول عليها من جيم وينبغي إضافة = 2 ميكرولتر من محلول المخزون lentiviral إلى الطبق المناسب. تخفيف كمية محسوبة من الفيروس في 100-300 ميكروليتر من وسائل الإعلام كاملة من أجل ضمان توزيع أفضل للفيروس عندما تضاف إلى الخلية طبق الثقافة.
8. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا ما قبل المصنف. إضافة الإعلامية الكاملة CONTAining حل بروميد hexadimethrine إلى كل طبق. أوصت تركيز النهائي من بروميد hexadimethrine في وسائل الإعلام هو 8 ميكروغرام / مل. استخدام بروميد hexadimethrine أقل إذا وجدت أن تكون سامة للخلايا التي تستهدفها.
9. إضافة إلى الجسيمات shRNA lentiviral الأطباق المناسبة وفقا للتصميم تجريبية محددة سلفا. بلطف دوامة لوحات توزيع بالتساوي الفيروس عبر الخلايا.
10. احتضان 18-20 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب في جو من 5 ٪ CO _2.
11. (اختياري) كرر 3-8 في وزارة الداخلية متطابقة مع SHC001H (فارغ ناقلات shRNA التحكم) في السيطرة على الصحن وSHC002H (تدافعت shRNA التحكم) التحكم في صحن باء علاج هذه الأطباق بشكل مطابق للأطباق التجريبية في كافة مراحل التجربة.
12. اليوم 3 -- تغيير وسائل الإعلام. نضح المحتوية على الفيروس وسائل الإعلام وإضافة وسائط جديدة كاملة (بدون hexadimethrine الميثيل). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل.

2. علاج مطليالخلايا التي تحتوي على مكونات علاجية / كاشف

1. يوم 4 -- وسائل الإعلام نضح من الآبار وإضافة وسائط جديدة تحتوي على مكونات علاجية في تركيز الأمثل. كما هو الحال مع الظروف والثقافة ، وسوف تختلف العلاجات وينبغي أن تحدد تركيزات مناسبة وفترات مسبقا. في دراستنا ، استخدمنا 100 نانوغرام / مل من TRAIL و 1 ميكرومتر من باكليتاكسيل. تم علاج الخلايا لمدة 48 ساعة.
2. وينبغي أن الخلايا على قيد الحياة إلى إعادة المصنف T75 القوارير وسمح لتوسيع حتى ما يقرب من 100 ٪ متموجة.
3. (اختياري) في نهاية التحديد ، تفقد التحكم الطبق ألف وباء التحكم الطبق طبق الطبق ألف وباء ويجب على كل المستعمرات أقل من واحد على الأقل من الأطباق مكتبة المجمعة. إذا كان هناك ارتفاع غير متوقع لعدد من المستعمرات في الطبق ألف ، قد إما من عملية تنبيغ أثرت على مسار المتصلة النمط الظاهري المطلوب أو الضغط الانتقائي يكون مطلوبا ليست قوية بما فيه الكفاية ، وإعادة الأمثل للمقايسة. إذا B الطبق يحتوي على الكثير من المستعمرات، ثم قد تعبير عن shRNA والانخراط في مسار رني يكون لها تأثير على النمط الظاهري في المصالح. إذا كان هذا هو الحال مع تكرار SHC001H ، للتأكد من أن التأثير ليس محددة لSHC002H.

3. Deconvolution من السكان الخلية النسائل المتعددة

1. حصاد السكان غير متجانسة من الخلايا من كل وعزل الحمض النووي subpool الجيني. في محاكمتنا ، تم غسلها الخلايا لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني وكان معزولا قبل trypsinized الجينومية باستخدام الحمض النووي GenElute الثدييات الجينوم Miniprep عدة والبروتوكول المرفق (سيغما الدريخ ، G1N70). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أي مجموعات أخرى لتنقية الجيني التي تتوفر حاليا في السوق لعزل الحمض النووي. من المهم أن تتبع توصيات بروتوكول للمبلغ بدءا من الخلايا المستزرعة.
2. PCR التضخيم من الأهداف. انتعاش قالب shRNA الداخلي تمكن من التضخيم تجمع بأكمله من إدراج shRNA من السكان الخلية المحددة ، أو استرجاع indiviالمزدوجة قوالب shRNA من المستعمرات التي كانت التقطت بشكل فردي وتوسيعه. بعد التضخيم من إدراج shRNA من السيطرة وتحديد الخلايا المستهدفة ، يمكن أن تكون متسلسلة المنتجات PCR.
3. وهذه الخطوة الأمثل باستخدام PCR التضخيم سيغما للخرسانة الجاهزة ، رقم الكتالوج P2893. ويمكن استخدام الكواشف الأخرى لتضخيم ، ولكن الظروف الدراجات و / أو تركيز المغنسيوم قد تحتاج إلى تعديل لتضخيم ناجحة. يتم تضمين الاشعال التضخيم في 20 ملي تركيز مع عدة LentiPlex.
4. إعداد تفاعل PCR كما هو موضح في الجدول رقم 1. إضافة العناصر المدرجة في الترتيب. المبالغ المذكورة هي للتفاعل one 50 ميكرولتر. لمزيد من ردود الفعل ، وجدول المكونات الرئيسية مزيج من قبل عدد من ردود الفعل المطلوب ، وتشمل الفائض بنسبة 10 ٪. كمية الحمض النووي القالب الموصى به هو 5-10 نانوغرام.
5. فمن المستحسن أن رد فعل لأحد القالب يتكون من بعثة shRNA الإنسان مكافحة ناقلات الإيجابية المخفف للappropriate التركيز. التضخيم ناجحة مع هذا القالب يشير إلى أن مكونات فحص PCR والدراجات ظروف ملائمة. ملاحظة : لمنع التلوث المرحل من العينات التجريبية والكواشف ، يقترح أن تضعف سيطرة الإيجابية في مكان منفصل حيث يتم تعيين من ردود الفعل اللاحقة حتى PCR.
6. حفظ البرنامج PCR المدرجة في الجدول 2 في thermocycler الخاص.
7. لكل عينة ، والجمع بين 3 تفاعل PCR ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من الأصباغ وelectrophorese جنبا إلى جنب مع 5 ميكرولتر من DirectLoad ™ PCR سلم غليان منخفضة 100 ، رقم الكتالوج D3687 على agarose هلام 1 ٪ لتأكيد وجود غليان amplicon 309.
8. وكانت المنتجات المستنسخة باستخدام PCR TOPO عدة الاستنساخ TOPO - TA ، بعد بروتوكول الشركة المصنعة (Invitrogen ، K4575 - 01) : Subcloning من amplicons PCR. والنتيجة هي التي تحتوي على واحد في كل منتج PCR النواقل.
9. تم عزل 250 المستعمرات البكتيرية الفردية (يتضمن كل فرد amplicon PCR) ، وتنموn في 2 مل من الثقافات LB مع 100 ملغ / مل أمبيسيلين. ثم تم استخراج DNA البلازميد باستخدام GenElute البلازميد Miniprep مجموعة (سيغما الدريخ ، PLN70).
10. تنقية DNA البلازميد كان يتفاعل مع EcoRI وelectrophoresed لتأكيد وجود للإدراج.
11. وكانت عينات من الحمض النووي ثم التسلسل البلازميد وإدراج shRNA تحديدها باستخدام تسلسل shRNA LentiPlex قاعدة بيانات البحث المتوفرة مع مكتبة LentiPlex.

4. تحديد الهدف والتحقق من صحة

1. تسلسل shRNA يبدأ مع 3 - 5' - GAAACACCGG. أدخل المقبلة على الأقل 10 ولكن أقل من 21 النيوكليوتيدات وتسلسل الاستعلام في المربع بحث في تسلسل shRNA المغلقة نموذج بحث قاعدة بيانات Access.
2. حدد نوعا من shRNA المجمعة. اختياريا ، حدد subpool الذي تم العثور على التسلسل.
3. الآن انقر على زر "البحث عن الفعالية المحتملة" لإجراء البحث. هذا يجب التعرف على تسلسل المقابلة shRNA جنة الحقيقة والمصالحة (ق) التي تتطابق مع اله تسلسل البيانات. مزيد من المعلومات حول تسلسل shRNA جنة الحقيقة والمصالحة (ق) ويمكن تحديد الأهداف الجين المقابل وجدت بسهولة في سيغما الدريخ لجين المفضلة لديك : http://www.sigma.com/yfg
4. وينبغي التحقق من صحة الهدف الجينات التي تم تحديدها من خلال تكرار تجربة الفرز الأصلي مع استنساخ TRC الأصلي زائد اثنين على الأقل shRNAs الإضافية التي تستهدف نفس الجين باستخدام shRNA 1-1 شكل جيد. ويضرب عرض حقيقي نفس النمط الظاهري في معظم الآبار.

5. ممثل النتائج

هو مفصل مثالا على الشاشة سير العمل LentiPlex المجمعة في الشكل 1. وسمح للخلايا Transduced التي انتشرت في وجود تريل وباكليتاكسيل لتوسيع حتى القوارير ومتموجة. وكان حصاد DNA الجينومية ويخضع لتضخيم PCR والاستنساخ كما هو موضح في الشكل رقم 1 ألف ، قبل تقديمها لتحديد تسلسل وshRNA كما هو موضح في فيقوتم اعادة التسلسل 1 جيم 250 استنساخ ، 25 من هذه الحيوانات المستنسخة التي كانت ممثلة متعددة وكانت ممثلة في 225 المتبقية فقط 1 واستنساخ ولم تكن هناك متابعة في هذا الوقت.

وكما هو مبين في الشكل 2 ، تمثل الجينات مرشح عدة بما في ذلك TBX3 ، PPP2CA ، والتي AKT2 استنساخ متعددة. عامل النسخ تي مربع ، وبدا في TBX3 ما مجموعه أربعة الحيوانات المستنسخة ، وتورطت في الهجرة الورم ^5. وقد تجلى PPP2CA downregulation للحفاظ على نمو الخلايا LNCaP مثقف في ظروف نقص الاندروجين من خلال تخفيف الاندروجين الحرمان الناجم عن اعتقال خلية دورة ومنع موت الخلايا المبرمج ^6. AKT2 هي السيرين RAC بيتا / ثريونين البروتين كيناز والجين الورمي المفترضة أظهرت أن تلعب أدوارا عدة في تطور مرض السرطان ^{7 و 8.}

* تركيز النهائي من ² ملغ ⁺ سوف يكون الحل في 3 مم ؛وتساهم 1.5 ملم من خرسانة الجاهزة طق و 1.5 ملم من محلول كلوريد المغنيسيوم.
الجدول 1. تفاعل PCR الشروط Lentiplex

الجدول 2. PCR التضخيم Lentiplex البرنامج

الشكل 1. (أ) LentiPlex المجمعة الشاشة ، (ب) سير العمل deconvolution النسائل المتعددة ، و (ج) تحديد الأهداف shRNA.

ألف LentiPlex المجمعة الشاشة أولا ، وخلايا البذور ، ثم تضاف subpools shRNA ، (10 حمامات في المجموع ، كل أجريت في ثلاث نسخ ، لمدة 30 الأطباق المجموع). المقبل ، مع علاج مكون العلاجية / كاشف (في حالتنا ، TRAIL والسلطة الفلسطينيةclitaxel ، على التوالي). ثم ، reseed الخلايا على قيد الحياة في قوارير ، والسماح للتوسع. حصاد السكان غير متجانسة من الخلايا من كل وعزل الحمض النووي subpool الجيني.

باء deconvolution النسائل المتعددة. نفذ PCR لتضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على إدراج shRNA. المنتج هو PCR موحدة في الحجم ، ولكن في تسلسل النسائل المتعددة منذ gDNA القالب كما النسائل المتعددة. غير المستنسخة PCR المنتج في النواقل وتحولت بعد ذلك إلى البكتيريا المختصة.

جيم تحديد الأهداف shRNA. مستعمرات معزولة فردية ويتم استخراج DNA البلازميد. كل استنساخ يحتوي على ناقلات الاستنساخ مع جزء واحد PCR الفردية. هضم الحمض النووي البلازميد لتأكيد وجود لإدراج ومتسلسلا. يتم التعرف على إدراج shRNA باستخدام تسلسل shRNA LentiPlex قاعدة بيانات البحث.

الشكل 2. هل يمكن تحديدوقد تم تحديد الجينات didate. الجينات المرشحة ال 25 التي كان يضرب متعددة. وكان المرشح جينات فقط 1 225 ضرب وتواصلت لا. الرجاء انظر الجدول 1 التكميلية لانهيار استنساخ الجينات الفردية لكل مرشح.

الجدول التكميلي 1. فرد جنة الحقيقة والمصالحة التي تم تحديدها من الحيوانات المستنسخة مكتبة النسائل المتعددة التسلسل الجيني معرف مشاهدة الكشف عن النسخ.

Discussion

في هذه الدراسة ، فإننا نقدم شاشة الجينوم واسعة لتحديد الجينات المسؤولة عن السمسة A549 من الخلايا التالية باكليتاكسيل / تريل العلاج. استخدام نهج المجمعة في شاشة الجينوم على نطاق يقلل من الوقت والتكلفة والاستثمار في المعدات التي ترتبط عادة مع الشاشات التقليدية التي تم حشدها. حاسمة بالنسبة لنجاح التجارب الشاشة هي الأمثل يؤديها سلفا. يجب أن تكون الظروف تنبيغ وزارة الداخلية تحدد تجريبيا.

وينبغي اختيار الأسلوب يسمح للاختيار من الخلايا القوية التي تعرض النمط الظاهري المطلوب (على سبيل المثال ، والبقاء التعبير سطح البروتين ، الخ). والاستفادة المثلى من هذه المعلمات تقليل عدد ايجابيات كاذبة الكشف عنها.

هنا ، كان حصادها gDNA من سكان الجزء الأكبر من الخلايا المحددة ثم TOPO المستنسخة لتحديد إدراج shRNA الفردية. كان من الممكن تحسين واحدة لهذه التجربة لتحديد الخلايا الحية لاستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لضمانيتم جمع إلا أن الخلايا الحية. وسيتم التحقق من الأهداف التي حددها تنبيغ مع shRNAs محددة الهدف في مقايسة الفرز. ويضرب عرض النمط الظاهري صحيحا في معظم الآبار.

مكتبة LentiPlex مجمع يتسم بالمرونة في تطبيقها. وهو متوافق مع مجموعة واسعة من التطبيقات المصب ، ويمكن استخدامها مع استراتيجيات الاختيار إما إيجابية أو سلبية. تبعا للظروف الفرز ، ويتم إنجاز deconvolution لإدراج shRNA عبر PCR / الاستنساخ ، ميكروأري ، أو الجيل القادم التسلسل ^{9 و 10} وبينما هو راسخ في قوة وسرعة من هذه التقنيات لdeconvolute شاشات رني ، واحدة مع القلق وميكروأري الجيل القادم من أساليب التسلسل هو توافر الموارد المعلوماتية الحيوية والمعارف اللازمة لتحليل وتفسير النتائج بشكل صحيح التجريبية. يمكن أن تكون تكاليف هذه التقنيات المرتبطة في كثير من الأحيان يكون عائقا أمام القيام شاشات الجينوم واسعة. APCR / استنساخ النهج القائم ، في حين انها لم تكن بقوة ميكروأرس وتسلسل الجيل المقبل من هو بديل فعال وبتكلفة أقل.

اجيلنت يقدم الآن مجموعة والمخصص اعتمادا على مكتبة shRNA TRC لتقديم المزيد من المساعدات في شاشات LentiPlex. هذه الخيارات تسمح للباحثين استخدام LentiPlex لدراسة مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	كتالوج رقم
صفيف LentiPlex المجمعة	سيغما الدريخ	SHPH01
خلايا A549	ATCC	CCL - 185
TRAIL	سيغما الدريخ	oductDetail.do؟ lang = ar في T5694 و N4 = ٪ 7CSIGMA وN5 = SEARCH_CONCAT_PNO ٪ 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> T5694
باكليتاكسيل	سيغما الدريخ	T7402
توبو TA الاستنساخ كيت	Invitrogen	K4575 - 01
Jumpstart من طق للخرسانة الجاهزة	سيغما الدريخ	ONCAT_PNO 7CBRAND_KEY ٪ & F = SPEC "P2893>
GenElute عدة Miniprep البلازميد	سيغما الدريخ	PLN70
EcoR1	نيو انغلاند Biolabs	R0101
hexadimethrine بروميد	سيغما الدريخ	H9268