إنشاء فيروس ابشتاين بار النمو وتحولت خطوط الخليوي Lymphoblastoid

Summary

نحن تصف طريقة لتحويل خطوط الخلايا المولدة باستخدام باء فيروس ابشتاين بار. نوضح أيضا فحص الرواية التي يمكن أن تحدد الخلايا B المتجهة إلى الخضوع لتحول في أقرب وقت بعد ثلاثة أيام من العدوى.

Abstract

إصابة الخلايا B مع فيروس ابشتاين بار (EBV) يؤدي إلى تخليد الانتشار واللاحقة ، مما أدى إلى إنشاء خطوط الخلايا lymphoblastoid (LCL) في المختبر. منذ مصابون خفية LCL مع EBV ، لأنها توفر نظام نموذجي للتحقيق EBV كمون الفيروس وباء خلية يحركها الانتشار وتكون الأورام ^1. وقد استخدمت LCL تقديم المستضدات في مجموعة متنوعة من المقايسات المناعية ^{2 ، 3.} بالإضافة ، يمكن استخدامها لتوليد LCL الاجسام المضادة البشرية ^{4 ، 5} وتوفر مصدرا غير محدود من المحتمل عندما يقتصر الوصول إلى المواد الأولية البيولوجية ^{6 ، 7.}

وقد وصفت مجموعة متنوعة من الأساليب لتوليد LCL. وشملت الأساليب في وقت سابق ان استخدام مثل mitogens راصة دموية نباتية ، lipopolysaccharide ⁸ و ⁹ الفتلاق mitogen لزيادة كفاءة EBV بوساطة تخليد. في الآونة الأخيرة ، استخدمت الآخرين immunosupprوكلاء essive مثل السيكلوسبورين A لتثبيط الخلايا T بوساطة قتل الخلايا المصابة ب ^{7 ، 10-12.}

طول كبيرا من الوقت من EBV العدوى إلى إنشاء خطوط الخلايا محركات شرط لطرق أسرع وأكثر موثوقية للEBV يحركها نمو الخلية B التحول. باستخدام مزيج من عيار EBV عالية وكيلا للمناعة ، ونحن قادرون على نقل العدوى باستمرار ، وتحويل ، وتوليد LCL من خلايا B في الدم المحيطي. يستخدم هذا الأسلوب يمكن البرهنة على كمية صغيرة من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى ان عدد المصابين بهذا المرض في المختبر مجموعات من الخلايا. وجود CD23 مع EBV في حضور FK506 ، ومناعة الخلايا التائية. تقليديا ، يتم رصد نمو الخلايا المتكاثرة التي كتبها B تصور مجموعات من الخلايا المجهرية حوالي أسبوع بعد الإصابة بفيروس EBV. ويمكن رؤية كتل من LCL بالعين المجردة بعد عدة أسابيع. نحن تصف مقايسة لتحديد مبكرة اذا EBV بوساطة زالتحول rowth ناجحة حتى قبل أن يمكن البرهنة مجموعات من الخلايا المجهرية. وجود CD23 CD58 ^{+ مرحبا} الخلايا كما لوحظ في أقرب وقت بعد ثلاثة أيام من العدوى تشير إلى نتائج ناجحة.

Protocol

1. EBV الأسهم إعداد

1. ثقافة فرعية المتنامية باطراد B95 - 8 خلايا (آي تي سي سي # CRL 1612 ؛ 13) في الخلايا 3 × ⁵ / 10 مل في 75cm ² قارورة الثقافة الأنسجة باستخدام تقنية معقمة. وتزرع في الخلايا التي تحتوي على 1640 RPMI كاملة المعطل للحرارة بنسبة 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، البنسلين / الستربتوميسين في 100U/ml و 100 ميكروغرام / لتر ، على التوالي ، وباء الامفوتريسين عند 0.5 ميكروغرام / لتر عند 37 درجة مئوية في وجود 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون _2.
2. ثمان وأربعين ساعة في وقت لاحق ، والخلايا في resuspend RPMI كاملة جديدة 1640 الخلايا في 1 ⁶ × 10 / مل. للحث على إنتاج الفيروس ، وتحفيز الخلايا مع خلات 20ng/ml phorbol tetradecanoyl (TPA) لمدة 1 ساعة في الحاضنة القياسية ₂ CO. غسل الخلايا ثلاث مرات مع RPMI 1640 لإزالة طن سنويا.
3. Resuspend الخلايا في الحجم الأصلي للRPMI كاملة 1640 (من 1.2) ووضع في قارورة CO ₂ الحاضنة لمدة 96 ساعة. وقد تبين أن هذه الطريقة لإنتاج التتر عالية من المساواة الفيروسات المعدية⁶ جسيمات.
4. الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في فصل EBV المحتوية طاف الثقافة من الخلايا. تصفية طاف من خلال مرشح 0.45 ميكرون ، قسامة ، وتخزينها في -70 درجة مئوية لمدة أكثر من عام.
   بديل هو الحصول على طاف B95 - 8 من الخلايا التي تحتوي على EBV من ATCC (VR - 1492) واستخدامها في التخفيف الموصى بها من قبل آي تي ​​سي سي.

2. عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC)

1. تعادل 10 مل من الدم المانحة الى حقنة heparinized أو أنبوب الدم heparinized. تمييع الدم PBS مع 20 مل في درجة حرارة الغرفة في أنبوب مخروطية 50 مل.
2. الأساس الذي تقوم عليه الدم المخفف مع 15 مل المتوسطة Hypaque Ficoll فصل الخلايا اللمفاوية. الطرد المركزي في ز × 225 بدون فرامل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
3. إزالة الغلالة الشهباء ونقل في أنبوب جديد 50 مل المخروطية. زيادة حجم إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني وتدور في 600 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
4. بوص قبالة طاف. غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق بيليه في برنامج تلفزيوني مل 50 و الغزل في ز × 600 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. يغسل مرتين بطريقة مماثلة.
5. تغسل Resuspend الخلايا في 1 مل من RPMI كاملة. 5 ميكرولتر من استخدام الخلايا لإعداد تخفيف 10/01 في الزرقاء التريبان. عدد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات.
6. ضبط مستوى الصوت باستخدام RPMI كاملة في 25 سم ² الأنسجة قارورة الثقافة للحصول على تركيز خلية من 2 × 10 مل / ^6.

3. العدوى بفيروس EBV

1. إضافة FK506 (AG العلمية) إلى تعليق خلية من 2.6 إلى تركيز النهائي من 20 نانومتر. دورق مكان في CO ₂ في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
2. ذوبان الجليد من على وجه السرعة قسامة EBV. إزالة قارورة من الحاضنة وEBV إضافة إلى الخلايا في 10/01 التخفيف. عادة ، وهذا يوفر وزارة الداخلية التخفيف من 5-10. قارورة دوامة لخلط ووضعه تستقيم في CO ₂ حاضنة في 37 درجة مئوية.

علما عشرفي الخطوة 4 ، يقوم على التنبؤ بنتائج ناجحة ، هو خطوة اختيارية. إذا الخطوة 4 هو المراد تنفيذها ، وسوف تحتاج لاحتضان an قارورة إضافية من الامم المتحدة وإصابة PBMC في الخلايا ^{6 ×} 2 / 10 مل والسيطرة عليها.

4. تحديد السكان تكاثر الخلايا (خطوة اختيارية)

1. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة : PBS + 5 ٪ FBS. تخزين عند 4 درجات مئوية.
2. جعل الأضداد التالية يمزج في 50 ميكرولتر حجم كل لتلطيخ الخلايا في الخطوة 4.6. وينبغي بذل التخفيفات في الضد العازلة التي تحتوي على نظام مراقبة الأصول الميدانية للمفتش 1mg/ml الماوس (سيغما) لمنع غير محددة وملزمة من قبل الأجسام المضادة.
   1. واحد ملطخة PE الأضداد المضادة للCD23 مترافق (1 / 50 التخفيف)
   2. واحد ملطخة FITC الأضداد المضادة للCD58 مترافق (1 / 50 التخفيف)
   3. واحد ملطخة PE - Cy5 الأضداد المضادة للCD19 مترافق (1 / 50 التخفيف)
   4. الثلاثي الملون لCD58 ، CD23 ، CD19 و (1 / 50 تمييع لكل منهما)
   5. واحد ملطخة السيطرة PE isotype مترافقالمتطابقة الضد لCD23 - PE (في نفس تركيز مكافحة CD23 الضد)
   6. واحد ملطخة FITC مترافق isotype الضد تحكم مطابقة لFITC - CD58 (في نفس تركيز مكافحة CD58 الضد)
   7. واحد ملطخة PE - Cy5 السيطرة isotype مترافق الضد مطابقة لCD19 - PE - Cy5 (في نفس تركيز مكافحة CD19 الضد)
   8. الثلاثي ملطخة جميع الأضداد isotype السيطرة على ثلاثة.
   مخزن مؤقتا يمزج في 4 درجات مئوية في الظلام.
3. في ثلاثة أيام من التعرض لمرحلة ما بعد EBV ، برفق القارورة دوامة الحصول على تعليق الخلية أكثر اتساقا. إزالة 2ml من قارورة في أنبوب إيبندورف 2ml. تدور في أنبوب microcentrifuge في 3000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
4. نضح خلايا وطاف في resuspend العازلة FACS في 5 × ^6-1 أكتوبر ⁷ × 10 خلية / مل.
5. إزالة eight aliquots 50μl في أنابيب إيبندورف فرد أو 96 - V - جيدا وحة القاع. تدور أنابيب أو لوحة في 1500 س زلمدة 3 دقائق.
6. تجاهل أنابيب طاف ودوامة / لوحة. Resuspend الخلايا في كل أنبوب / جيد في 50 ميكرولتر من FACS العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة المناسبة التخفيفات أعد في 4.2.
7. احتضان أنابيب / لوحة على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. خلايا الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق ، وإزالة طاف ، وإضافة 200 ميكرولتر من FACS العازلة. الطرد المركزي وإزالة الخلايا مرة أخرى لإكمال طاف يغسل. كرر اثنين من أكثر يغسل.
8. خلايا Resuspend في 200 FACS ميكرولتر العازلة والحصول على البيانات باستخدام تدفق عداد الكريات ، والحصول على 20000 / الأحداث الأنبوب.
9. تحليل البيانات باستخدام WinMDI (مجانية لتحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية على جهاز الكمبيوتر). بوابة على الخلايا الحية باستخدام التشكيلات مبعثر إلى الأمام والجانب. ثم ، والخلايا الحية بوابة للتعبير عن CD19 ⁺ (B علامة الخلية) بعد مقارنة مع الخلايا ملطخة الضد isotype تحكم مطابقة لمكافحة CD19 الأجسام المضادة. مؤامرة CD19 ⁺ باء الخلايا الحية مع كثافة مضان لCD23 على محور س وكثافة مضان لCD58 على المحور الصادي. تحديد CD23 CD58 ^{+ +} والخلايا عن طريق مقارنة EBV المعرضة للخلايا ملطخة المتطابقة السيطرة isotype الأضداد. وجود خلايا CD23 CD58 ^{+ مرحبا} في EBV المعرضة للثقافة (الشكل 2C) يتنبأ ثمرة نجاح EBV المصابين نمو الخلايا المتحولة. في المقابل ، CD23 CD58 ^{+ مرحبا} الخلايا لا تظهر عندما لا تتعرض الخلايا لEBV (الشكل 2A) أو تعرضت لسلالة غير تخليد من EBV (الشكل 2B). وقد CD23 CD58 ^{+ مرحبا} الخلايا أثبتت تجريبيا على الخضوع لانتشار الأسلحة النووية ووضع في وقت لاحق LCL (14).

5. التوسع والحفظ بالتبريد من LCL

1. التصور من الخلايا المجهري ضوء : لمدة أسبوع بعد الإصابة EBV ، ومجموعات من الخلايا مرئية بواسطة المجهر الضوئي. الشكل 3 يوضح مثالا لمجموعات مجهرية في وقت مبكر (الشكل 3B) في قارورة.
2. كما تقدم الوقت ، والتكتلات المجهرية بحيث تصبح أكبر كتل مرئيةظاهريا في القارورة. ويبين الشكل 3C أكبر مجموعات من الخلايا التي وضعتها في LCL المجهر الضوئي.
3. تغذية الخلايا : مضاعفة حجم المتوسطة الثقافة في قارورة الثقافة في يوم 12. في وقت لاحق ، وتوسيع الثقافة عن طريق زيادة حجمه 2-3 أضعاف باستخدام RPMI كاملة.
4. وينبغي تحديد دورية الخلايا المغذية على أساس معدل نمو الخلايا. عندما يتحول إلى اللون الأصفر مستنبت ، فهو عموما الوقت ليحل محل وسائل الإعلام على النحو الوارد أعلاه. عادة ، وهذا يحدث مرة واحدة في الاسبوع. ومع ذلك ، قد تكون بعض خطوط الخلايا تحتاج إلى تغذية أكثر أو أقل بشكل متكرر. توسيع الثقافة إلى 75-100 مل على مدى الأسابيع القليلة المقبلة.
5. الحفظ بالتبريد : عند أسفل تجميد الخلايا والخلايا الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف بيليه وresuspend خلية في المتوسط ​​تجميد الباردة التي تحتوي على 90 ٪ FBS وdimethylsulfoxide 10 ٪ في 1 × 10 ⁷ خلية / مل. أنبوب مكان في النيتروجين السائل.

6. ممثل النتائج :

ومن المتوقع نتيجة ناجحة من وجود خلايا CD23 CD58 ^{+ مرحبا.} وينبغي أن حوالي 2-3 ٪ من الخلايا الحية في يوم 3-4 بعد التعرض لEBV يكون هذا الملف (الشكل 2C). فرعية أخرى من السكان CD23 ⁺ ، CD23 ^-- ، CD58 ⁺ و CD58 ^-- لاحظ الخلايا بعد التعرض لانتشار EBV تظهر الحد الأدنى من ^14. برنامج الأمم المتحدة للخلايا المصابة (الشكل 2A) والخلايا المعرضة لEBV من الخلايا HH514 - 16 (الشكل 2B) ، بايواء سلالة غير تخليد من EBV ، لا تثبت CD23 CD58 ^{+ مرحبا} الخلايا.

قد تصور أيضا الخلايا عن طريق الفحص المجهري لرصد ضوء نتائج ناجحة : كما ذكر سابقا ، في غضون أسبوع بعد العدوى EBV ، مجموعات صغيرة من الخلايا في قارورة مرئية بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 3B). مع مرور الوقت وتتحول إلى خلايا LCL ، والتكتلات المجهرية تصبح أكبر (الشكل 3C) بحيث كتل مرئية ظاهريا في القارورة.

ق ق = "jove_content">
الشكل 1. سير العمل لجيل والحفظ بالتبريد من خطوط الخلايا lymphoblastoid. هو طرد الدم المحيطي من خلال التدرج Ficoll. ويتعرض PBMC موجودة في معطف الشهباء من الانحدار الذي أنشئ لFK506 تليها إضافة EBV. تزرع EBV المعرضة للخلايا عند 37 درجة مئوية في وجود ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₂ لإقامة وتوسيع لاحقا LCL الحفظ بالتبريد.

الشكل 2 : تحديد عدد السكان فرعية من الخلايا B من المتوقع أن يخضع الانتشار بعد التعرض لEBV. الامم المتحدة المصابة PBMC (A) أو المعرضين للPBMC EBV المستمدة من الخلايا HH514 - 16 (B) أو من B95 - 8 خلايا (C) في حضور FK506 كانت تحصد في اليوم 3. تم صبغ الخلايا مع ملون تألقي ، مترافق الأجسام المضادة الموجهة ضد CD23 ، CD19 ، CD58 و. بعد تبوب على الخلية الحيةق ، من الامم المتحدة وإصابة (أ) و EBV يتعرض - (B و C) CD19 ⁺ B تم فحص الخلايا للتعبير عن CD23 CD58 و. ولاحظ سكان فرعية من الخلايا باء معربا عن مستويات عالية من CD58 و CD23 (CD23 CD58 ^{مرحبا +)} ، إلا في الخلايا المعرضة للتحول المختصة EBV (المشتقة من الخلايا B95 - 8) ، وصفت.

الشكل 3. التصور مجموعات الخلايا في الخلايا المصابة EBV. وعولج PBMC مع FK506 والمصابين EBV. الامم المتحدة المصابة (أ) و EBV يتعرض - (B) تم فحص خلايا أسبوع واحد بعد العدوى عن طريق الفحص المجهري النقيض المرحلة (تكبير 10X). ويظهر في خمسة أسابيع الخلية lymphoblastoid القديمة في خط جيم

Discussion

الطريقة الموضحة في هذه الورقة يولد LCL من الدم الطرفية المانحة مع تخليد السريع والحفظ بالتبريد مرات. من خلال استخدام FK506 ، ومناعة الخلايا التائية ، والتتر عالية من الفيروسات المعدية ونحن قادرون على تعزيز انتشار الخلايا المصابة ب EBV من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. هذه التدخلات جعل الأسلوب هو موضح أكثر كفاءة ، مما أدى إلى التوسع السريع للخلايا لتجارب لاحقة.

تقليديا ، وقد تم رصد تحول النمو من خلال التصور لمجموعات من الخلايا بواسطة المجهر الضوئي حوالي أسبوع بعد التعرض للEBV ^{6 و 15.} ومع ذلك ، تجميع الخلايا ليس مؤشرا محددة تحول النمو EBV بوساطة. لقد أثبتنا سابقا تحديد ثابت من السكان الخلايا المتكاثرة عبر التدفق الخلوي ¹⁴ ، وتوفير وسيلة دقيقة ومحددة لتحديد نتائج ناجحة في وقت مبكر ثلاثة أيام الخلفإيه التعرض للخلايا B لEBV.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
	شركة	فهرس العدد
الأمفوتريسين B	فيشر Bioreagents	بي 928-250
Dimethylsulfoxide	سيغما	D 2650
مصل بقري جنيني ، الحرارة المعطل	سيغما	F 4135
Ficoll فصل الخلايا اللمفاوية وسائل الاعلام Hypaque	Mediatech	25-072
FK506	AG العلمية	F 1030
مفتش من المصل الماوس	سيغما	أنا 8765
الماوس المضادة للCD23 الإنسان مترافق إلى PE	Pharmingen دينار بحريني	555711
الماوس isotype IgG1 مترافق إلى PE	Pharmingen دينار بحريني	554680
الماوس المضادة للCD58 الإنسان لمترافق FITC	بيرس الحرارية برأسيةientific	MA1 - 82159
الماوس isotype IgG1 مترافق لFITC	Pharmingen دينار بحريني	550616
الماوس المضادة للCD19 الإنسان لمترافق PE - Cy5	Pharmingen دينار بحريني	555414
الماوس isotype IgG1 مترافق لPE - Cy5	داكو	X 0955
البنسلين / الستربتوميسين	Gibco	15140-122
RPMI 1640 وسائل الإعلام	سيغما	R 8758
Tetradecanoyl phorbol خلات (TPA)	Calbiochem	407952
FACS العازلة (1X الفوسفات التخزين المؤقت مالحة + 5 ٪ مصل بقري جنيني)