Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة

Summary

غضاريف تطوير القحفي على اتصال وثيق مع أنسجة أخرى ، ويصعب التلاعب في الحيوانات الحية. نحن نستخدم electroporation لتقديم الأدوات الجزيئية أثناء نمو الهيكل العظمي القحفي مع تجاوز آثار الجنينية المبكرة. وسوف تسمح لنا هذه المقاربة لاختبار كفاءة المرشح جزيئات في الجسم الحي.

Abstract

Electroporation وسيلة فعالة لإيصال الحمض النووي وغيرها من الجزيئات المشحونة في الأنسجة عند نقاط زمنية محددة وفي أماكن محددة. على سبيل المثال ، تم استخدام electroporation مع النجاح الكبير لدراسة التنمية العصبية وشبكية العين في القيطم والدجاج والفأر ^1-10. ومع ذلك ، فمن المهم أن نلاحظ أنه في كل هذه الدراسات والمحققين لا تستهدف الأنسجة الناعمة. لأن نحن مهتمون في التنمية القحفي ، وتكييفها لدينا طريقة لاستهداف اللحمة المتوسطة في الوجه.

وجدنا أننا عندما بحثت في الأدب ، لدهشتنا ، وتقارير عدد قليل جدا من نقل الجينات في الأنسجة الغضروفية ناجحة. وكانت غالبية هذه الدراسات دراسات العلاج الجيني ، مثل تسليم سيرنا أو البروتين إلى خطوط الخلية مكون للغضروف ، أو النماذج الحيوانية من التهاب المفاصل ^11-13. في الأنظمة الأخرى ، مثل الدجاج أو الماوس ، وقد electroporation اللحمة المتوسطة من الوجه تحدي (communicat الشخصيةالأيونات ، دائرة التنمية الجمجمة ، بوكل). افترضنا أن electroporation في الأنسجة الغضروفية وprocartilaginous في القيطم قد يعمل على نحو أفضل. في دراساتنا ، وتبين لنا أن نقل الجينات في غضاريف الوجه يحدث بكفاءة في المراحل المبكرة (28) ، وعندما تتكون يزال منشم الوجه الأنسجة اللينة قبل التمايز الغضروف.

القيطم هو نظام للوصول للغاية لتحليل الفقاريات التنمية القحفي. هياكل القحفي بسهولة أكثر وضوحا في القيطم مما كانت عليه في أي نموذج الفقاريات الأخرى ، في المقام الأول لأن الأجنة المخصبة القيطم خارجيا ، مما يسمح للتحليل في المراحل المبكرة ، وتسهيل التصوير العيش في قرار خلية واحدة ، فضلا عن إعادة استخدام الأمهات ^14. بين النماذج الفقاريات النامية خارجيا ، القيطم هو أكثر فائدة للتحليل القحفي من الزرد ، والقيطم اليرقات تكون أكبر وأسهل في ديssect ، ومنطقة نامية الوجه هو أكثر يسرا لتصوير ما يعادل أكثر من منطقة في الأسماك. بالإضافة إلى ذلك ، القيطم تطويريا هو أقرب للإنسان من الزرد (~ 100 مليون سنة أوثق) ^15. أخيرا ، في هذه المراحل ، الشراغف القيطم تتسم بالشفافية ، والتعبير المتزامنة من البروتينات الفلورية أو الجزيئات سيسمح التصور السهل للغضاريف النامية. ونحن نتوقع أن هذا النهج سوف تسمح لنا بسرعة وكفاءة اختبار الجزيئات مرشح في النظام النموذجي في الجسم الحي.

Protocol

جزء 1A. معدات

المجهر : تستقيم نطاق ستيريو مع تشريح الهدف منخفضة الطاقة

• الجهد / مولد نبض : BTX ECM 830 Electroporation الموجة ساحة النظام
• ماصة مجتذب : P - 87 Micropipette بولير (سوتر شركة الصك ، CA)
• مناور : الخشنة ، أو مجتمعة الخشنة والناعمة اعتمادا على الإعداد.
• Micropipette حامل : أدوات العلوم الجميلة
• القطب : محلية الصنع
• Electroporation الغرفة : محلية الصنع

على شكل حرف L الأقطاب :

1. قطع 8 سم من نقاء عالية سلك التنغستن 0.4 ملم (Goodfellow) ، ويضعوا في منتصف حقنة 1ml باستخدام المعجون (نستخدم بلو تاك). ترك 4 سم سلك التنغستن يتعرض من غيض من غيض المحاقن والانحناء في شكل - L ، 1 سم من نهاية (الشكل 1A).
2. تقليم غيض بحيث نهاية التدابير 0.5 ملم في الطول. Tتلميح له هو نهاية القطب.
3. تشغيل الفائض موازية لسلك التنجستن حقنة واستخدامه لتوصيل مولد نبض كهربائي.
4. تكرار عملية صنع زوج من الأقطاب الكهربائية.
5. نعلق الأقطاب إلى مربع موجة مولد نبض عبر الكابلات العاصمة.

Electroporation الغرفة

1. أسفل خط 90 ملم مع صحن 5 ~ البلاستيسين غير سامة ملم.
2. ملء طبق electroporation مع وسائل الاعلام.
3. باستخدام رقم 5 ساعاتي ملقط نحت جيدا على شكل حرف T (الشكل 2). وينبغي أن البئر طويلة قياس ~ 2 مم × 2 مم x 10 مم والقصير 2 مم ~ × 2 مم × 5 مم. يمكن غسل الطبق electroporation وإعادة استخدامها.

جزء 1B. الكواشف

الحمض النووي أو الجزيئات المشحونة

• Micropipettes : 1 4 ملم واسعة "لفترة طويلة البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية (WPI ، TW100 - F)
• ثقافة الإعلام : عادي البرمائيات وسائل الإعلام (NAM)
• > 10 X الأسهم : 1100 ملي كلوريد الصوديوم ، 20بوكل ملي و 10 ملي كا (NO _{3) 2} • 4H ₂ O ، 1 ملم EDTA.
  • الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  • 1 X حركة عدم الانحياز : خفف من 10X العازلة ، الأسهم بنسبة 0.1 ملي NaHCo ₃ و 0.2 ملي نا ₃ ص _4.
• القيطم المورق الضفادع الصغيرة ، المرحلة 28

الحمض النووي التحضير :

1. إعداد البلازميدات التعبير باستخدام بروتوكولات قياسية.
2. Resuspend الحمض النووي للتركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكروليتر في nuclease مجانا H ₂ 0.

* لقد كان النجاح مع ناقلات تحتوي على مروج CMV قوية ، مثل pCS2 + [16]. لتحليل النسب ، ونحن عادة ما تتضمن الحمض النووي الترميز الخضراء بروتين فلوري (GFP pCS2 +) عند تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / ميكروليتر. كما تم اختبار تركيز الحمض النووي [بين 0،1-3 ميكروغرام / ميكروليتر. وجدنا أن تركيزات أقل من الخلايا ميكروغرام / ميكروليتر 0.8 المسمى غير فعالة ، في حين أن تركيز الحمض النووي أكبر من 2 ميكروغرام / م &ش ؛ لم يكن ل تحسين الكفاءة electroporation].

Morpholino إعداد قليل النوكليوتيد :

(ملاحظة : يجب أن المنظمات الأعضاء fluoresceinated (3' - carboxyfluorescein تعديل) أو اتهامات غير ذلك)

1. [أليغنوكليوتيد] Resuspend morpholino (موس) (Genetools ، www.genetools.com ) بتركيز 2 مم في nuclease مجانا H ₂ 0.
2. قسامة حرارة حل السهم عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. تمييع للتركيز النهائي من 0.5 ملم في المياه مجانا nuclease.

تم اختبار * 0.1 - 1MM MO الحلول. وكانت 0.5 ملم حلول MO كافية لخلايا اللحمة المتوسطة electroporation كثيرة.

Micropipettes

1. إعداد micropipettes من الزجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (1 ملم واسعة ، 4 "طويل ، لا WPI. TW100 - F). مجتذب استخدام إبرة لإعداد micropipettes مع تفتق لونغ 8-12 ملم وغيض الغرامة.
2. غيض سحق ~ 2 مممن طرف باستخدام ملقط ، وخلق فاصل خشنة.

وسائل الإعلام

1. وسائل الاعلام الحضانة : تحضير 04/03 عادي الطازجة البرمائيات وسائل الإعلام (NAM) 1X من الأسهم. إضافة 0،025 ملغ / مل الجنتاميسين.
2. وسائل الاعلام Electroporation : على النحو الوارد أعلاه ، مع 0.1 ٪ بنزوكاين (سيغما ، 06950).

2. Electroporation

Micropipette الإعداد

1. ملء مع micropipette 1 ~ حل حقن ميكرولتر.
2. آمن micropipette في micromanipulator ونعلق على microinjector (Picospritzer الثاني).
3. في زاوية 50 درجة micropipette من الطاولة.
4. مجموعة ضغط الحقن في 20 PSI.
5. معايرة micropipette لضخ 30 NL في النبضة.

إعداد الشرغوف

1. تخدير اليرقات المرحلة التي يحتضنها القيطم 28 electroporation في وسائل الإعلام لمدة 5 دقائق.
2. نقل الى غرفة تخدير الشرغوف electroporation شغلها مع وسائل الاعلام electroporation. موقف الجنينضمن فترة طويلة جيدا أن مساند الرأس في مفترق - T مع الجانب الظهري أسفل والجانب البطني المكشوفة. يجب أن يكون الرأس مرتفع قليلا مقارنة مع الذيل.
3. باستخدام ملقط ، وتأمين بلطف الشرغوف بشكل جيد مع المناطق المحيطة البلاستيسين. (ملاحظة : إذا لم يتم تأمين الشرغوف ، فإنه قد نشل والاتصال الكهربائي خلال electroporation في هذه الحالة تجاهل الشرغوف كما سيتم أنسجة الوجه أضرار جسيمة)

Electroporation

1. إدراج غيض micropipette الخلفي فورا للغدة الاسمنت واللحمة المتوسطة في الوجه.
2. ضخ 30 NL حل في اللحمة المتوسطة.
3. التراجع micropipette.
4. محاذاة بسرعة نصائح القطب الموازي للرئيس الجنين (الشكل 3).
5. تطبيق 8 50 مللي ، والبقول 20mV مربع.
6. التراجع عن الأقطاب.
7. باستخدام ملقط الافراج الشرغوف بعناية من جانب ونقل إلى 03/04 حركة عدم الانحياز ، 0،025 ملغ / مل الجنتاميسين.
8. يمكن المحتضنة الشراغيف في 04/03 حركة عدم الانحياز ، 0،025 ملغ / مل overnight ، أو لفترة أطول.
9. فحص الاجنة لelectroporation كفاءة من خلال الفحص المجهري مضان بعد 24 ساعة.

3. ممثل النتائج :

استخدام جزيئات الفلورسنت يسمح فحص الأجنة electroporated سهلة. الشكل 4 يوضح دفعة نموذجية من MO electroporated الشراغيف ~ 12 و 48 و 96 ساعة بعد electroporation ، حضنت ب 14.5 درجة مئوية. باستخدام المجهر مضان ، يمكن تصور المنظمات الأعضاء على الفور بعد electroporation وتستمر لعدة أيام بعد electroporation. في تجربتنا ، مضان هو واضح في هذه المرحلة ضعيف 46 (~ 5 أيام في وقت لاحق). في الغضاريف ، يقلل بشكل كبير مضان بعد ظهور تمايز (~ ش 42) ، ومع ذلك ، استمرت MO مضان بقوة أكبر في أنواع الخلايا الأخرى مثل الأديم الباطن البلعوم. مضان المجهري تبين أن تدرج في الأنسجة [أليغنوكليوتيد] القحفي عدة بما في ذلك الغضروف. قليل النوكليوتيد مضان جan غالبا ما يكون تصور في الأنسجة على جانبي الرأس. وهذا هو الأرجح بسبب الانتشار السريع للحقن محلول في جميع أنحاء اللحمة المتوسطة في القحفي فضفاضة قبل electroporation.

الشكل 1 كهربائية محلية الصنع. ويرد على شكل حرف L سلك التنغستن الى حقنة 1 مل به غير سامة أو الطين المعجون. (أ) وصول القطب التدابير 5 ملم. (ب) أرفق زوج من الأقطاب ، مثل أن مصطلحات تسير في شكل مواز. وترد إلى مولد كهربائي نبض بواسطة الكابلات العاصمة.

الشكل 2 غرفة Electroporation. (أ) يتم تعبئة 90 مم طبق تصطف مع البلاستيسين مع وسائل الإعلام وغرفة منحوتة على شكل حرف T مع ملقط للا ساعاتي 5. (ب) على الجانب البعيد اجراءات X 2 ملم 2 ملم X10 ملمفي حين أن التدابير القصيرة 2 مم X 2 مم X 5 مم. رأس الجنين تقع في الجانب ، T - بطني حتى مفرق.

الشكل 3 يوضح الإجراء التخطيطي electroporation. وضعت سانت الشرغوف في 28 غرفة electroporation ، حتى الجانب البطني. يتم إدراج Micropipette في الوجه الغدة اللحمة المتوسطة الأسمنت المصدر. حقن. تتم إزالة Micropipette وتتماشى على شكل حرف L أقطاب المرافقة موازية الرأس. تطبيق eight 50 مللي ، 20 بالسيارات البقول مربع. التراجع عن الأقطاب. تنمو الشراغيف المراحل المطلوبة. المنظمات الأعضاء أو يتصور GFP التعبير باستخدام المجهر مضان.

الرقم الشراغيف الممثل 4 12 (أ) و 48 (B) ، و 96 (C) ساعة electroporation آخر (المراحل 30 و 34 و 44 على التوالي). يمكن (A "- B") يمكن تصور نيون MO داخل القحفي اللحمة المتوسطة في الأيلوفاق 30 و 34. ويمكن الكشف عن مضان في غضاريف في المرحلة 44 (رأس السهم ، C' - C ") ، والقناة الهضمية وautofluorescent للغاية.

Discussion

في هذا الفيديو ، وقد أثبتنا جدوى إيصال الجينات electroporation بوساطة اللحمة المتوسطة في الوجه من الشراغف الضفدع. باستخدام هذا النهج ، يمكننا تجاوز الآثار التنموية في وقت مبكر من التلاعب وظيفة الجين مما يسمح لنا استهداف الأنسجة عند نقاط محددة وقت لاحق. دراستنا تظهر أن يمكن أن يتأثر السكان غير متجانس من خلايا اللحمة المتوسطة القحفي ، مما يسمح لنا لدراسة نسب الخلايا electroporated فضلا عن متطلبات الحكم الذاتي للبروتينات الخلية في المصالح. تعيش جنبا إلى جنب مع التصوير ، يمكننا استخدام هذا النهج لدراسة وظائف الجينات ، بمرور الوقت ، أثناء تطوير القحفي. هذا الأسلوب الرواية الضوء على قابلية الإستطراق من القيطم لدراسة organogenesis. ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها على نطاق واسع لدراسة التشكل وتمايز الأنسجة الأخرى كذلك.