Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

Summary

Uncoating هو خطوة ضرورية في مرحلة مبكرة من دورة الحياة HIV - 1 ، ويعرف بأنه تفكك قذيفة قفيصة والإفراج عن مجمع بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNP). هنا ، علينا أن نظهر تقنيات لعزل نواة سليمة من virions HIV - 1 لقياس وuncoating بهم في المختبر.

Abstract

الجينوم من الفيروسات القهقرية هو المغطى في قفيصة محاطة المغلف الدهون. لlentiviruses ، مثل HIV - 1 ، وتتألف القشرة قفيصة المخروطية من البروتين CA رتبت بوصفها شعرية من مسدس. إغلاق قفيصة pentamers بنسبة 7 في نهاية اسعة و 5 في نهاية الضيقة للمخروط ^{1 و 2.} المغطى في هذه القذيفة قفيصة هو مجمع بروتين نووي ريبوزي الفيروسية ، وأنهم يشكلون معا جوهر.

بعد الانصهار في الغشاء الفيروسية مع غشاء الخلية المستهدفة ، يتم الافراج عن HIV - 1 في السيتوبلازم. قفيصة ثم يفكك الافراج CA الحرة في شكل قابل للذوبان ³ في عملية يشار إلى uncoating. ولا يزال الغموض يكتنف مكان وتوقيت الخلايا HIV - 1 uncoating. الأحماض الأمينية واحد التبديلات في كاليفورنيا التي تغير على استقرار قفيصة يضعف أيضا قدرة HIV - 1 إلى ⁴ تصيب الخلايا. هذا يدل على أن الاستقرار في قفيصة هو أمر حاسم لHIV - 1 العدوى. وقد HIV - 1 uncoating الصعب دراسة نظرا لعدم توافر فحوصات حساسة وموثوقة لهذه العملية. نحن هنا وصف الأسلوب الكمي للدراسة في المختبر باستخدام uncoating النوى معزولة عن جسيمات HIV - 1 المعدية. هذا النهج ينطوي على عزل النوى بالترسيب من خلال virions تتركز طبقة من المنظفات والى الانحدار الخطي السكروز ، في البرد. لتحديد uncoating ، يتم تحضين النوى معزولة عند 37 درجة مئوية لفترات مختلفة وتوقيتها لاحقا من قبل مكعبات تنبيذ فائق. ويتم تحليل مدى uncoating عن طريق قياس نسبة ضئيلة من CA في طاف. وقد استخدمت هذه الطريقة لتحليل آثار الطفرات الفيروسية على HIV - 1 الاستقرار قفيصة ^{4 ، 5 ، 6.} وينبغي أن يكون من المفيد أيضا لدراسة دور العوامل الخلوية في HIV - 1 uncoating.

Protocol

1. إنتاج جسيمات HIV - 1

قبل المتابعة ، يجب الحصول على إذن واتبع الإرشادات من مكتب السلامة للمؤسسة للعمل في مرفق السلامة الأحيائية الموافق عليها لفيروس نقص المناعة البشرية المعدية. يجب ضمان أن الرعاية المناسبة وتتبع احتياطات السلامة أثناء العمل في مختبر السلامة الحيوية.

ويجري في العادة انتاج جسيمات HIV - 1 بواسطة ترنسفكأيشن عابرة من الخلايا 293T مع HIV - 1 الحمض النووي proviral باستخدام الأسلوب فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن ^{7 و 8.} ارتفاع مخزونات فيروس عيار نما بنسبة ثقافة خلايا تي المصابة هي أيضا مناسبة.

1. ثقافة 293T الخلايا في النسر Dulbecco ومتوسطة التعديل (DMEM) تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) وتستكمل مع المضادات الحيوية [البنسلين (100 وحدة دولية / مل) ، والستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل)] عند 37 درجة مئوية ، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₂ .
2. فصل الخلايا من الصحون متكدسة به ما يقرب من 0.25 ٪ التربسين - EDTA والبذور 2x10 ⁶ خلايا في 9 مل لكل 100 ملم الطبق قبل يوم من ثقافة ترنسفكأيشن. البذور الستة الثقافة 100 مم لإنتاج أطباق virions. إذا كان المطلوب إعداد مركزة من النوى ، يمكن المصنفة أكثر الأطباق لترنسفكأيشن.
3. في اليوم التالي ، يجب أن تكون الخلية monolayers حوالي 25 ٪ متكدسة وجاهزة للترنسفكأيشن. لمدة ستة أطباق من الخلايا لتكون transfected ، وجلب 120 ميكروغرام من الحمض النووي proviral تصل إلى حجم من 2.7 مل مع الماء المعقم. إضافة إلى هذا الخليط 0.3 مل من 2.5 M CaCl ₂ و 3 مل من 2XBBS ، ومزيج صحيح من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. السماح للخليط إلى الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-20 دقيقة.
4. إضافة 1 مل من قطرة قطرة الخليط الناتج إلى وسط كل صحن في حين يحوم برفق لمزج. ضع الأطباق بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) في مجموعة حاضنة عند 35 درجة مئوية و 3 ٪ CO _2.
5. نضح المتوسط ​​الثقافة وإضافة بلطف 5 مل برنامج تلفزيوني.
6. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل من المتوسط ​​الطازجة. ثقافة الخلايا في الحاضنة في 37 &CO C و 5 ​​٪ ₂ لل24-48 ساعة إضافية ؛ درجة.
7. جمع طاف الثقافة التي تحتوي على جزيئات فيروسية ، ونقل إلى أنبوب 50 مل الطرد المركزي المخروطية. الجمع بين supernatants من جميع الأطباق وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق إلى خلايا بيليه والحطام. تصفية طاف به 0.45 ميكرون مرشحات حقنة مسام الحجم. وينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتقليل تكوين الهباء الجوي بينما كان يعمل مع الفيروس الحي. وهذا يشمل استخدام أنابيب مخروطية مع O - الخواتم أو يغطي دلو الدوار أثناء خطوة الطرد المركزي. إذا لم يكن هذا ممكنا ، يجب أن تكون ملفوفة في أغطية الأنابيب اللولبية مع parafilm.

2. تركيز HIV - 1 virions بواسطة تنبيذ فائق

1. مكان طاف الثقافة (30 مل) في أنبوب الطرد المركزي 38.5 مل polyallomer (الدوار لSW32Ti بيكمان أو ما يعادلها). الأساس الذي تقوم عليه بلطف طاف تحتوي على الفيروس مع 5 مل من محلول السكروز 20 ٪ في برنامج تلفزيوني باستخدام الماصة 5 مل.
2. الطرد المركزي لمدة 3 ساعات في32000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية (175000 XG في _أقصى اليمين) إلى جزيئات الفيروس بيليه.
3. إزالة طاف بواسطة الطموح ، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة 0.5 مل من 1XSTE العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة] ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 1 ملم EDTA) إلى أنبوب والمكان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتخفيف بيليه. تستخدم على نطاق وتتحمل الماصة 1 مل طرف الماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات لفصل بيليه من أسفل الأنبوب. المقبل ، ونقل بيليه خففت لأنبوب مل microcentrifuge 1.5 ، مع الحرص على تجنب الرغوة. في احتضان 4 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعات للسماح للكتل صغيرة من الفيروس لتفريق. خلال هذه الفترة ، وإعداد التدرج السكروز كما هو موضح في الخطوة 3.1.
4. الماصة بلطف تعليق فيروس صعودا وهبوطا عدة مرات ، والطرد المركزي في 8000 دورة في الدقيقة (6،000 x ج) في 4 درجات مئوية في microfuge مبردة ل1 دقيقة لإزالة كتل المتبقية. الحفاظ على عينة الباردة خلال هذه العملية.

3. السكروز التدرجالطرد المركزي لعزل النوى

يتم عزل HIV - 1 النوى باستخدام "تدور الظهور" طريقة ⁽⁹⁾ الذي هو تعديل للطريقة التي سبق وصفها لتنقية HIV - 2 النوى ^10.

1. إعداد 12 مل الانحدار الخطي السكروز 30 ٪ إلى 70 ٪ في 1XSTE العازلة في أنبوب الطرد المركزي 14.5 مل polyallomer لSW32.1Ti الدوار. إعداد التدرج ، استخدم التدرج 20 مل السابقة ؛ مكان 6 مل من محلول السكروز 70 ٪ على الجانب القريب (على مقربة من الميناء المنفذ) و 6 مل من محلول السكروز 30 ٪ على الجانب البعيد. تأكد من أن لا يتم المحاصرين فقاعات الهواء في قناة تربط بين الغرفتين. استخدام سيارات Densi تدفق التدرج السابق لضخ التدرج من أسفل إلى أعلى أنبوب يحتوي على 1 مل من محلول السكروز 85 ٪ في القاع. المكان بلطف الانحدار عند 4 درجات مئوية حتى تبرد (2-4 ساعات).
2. تستخدم على نطاق وتتحمل الماصة 1 مل غيض تراكب الانحدار برفق مع 0.25 مل من محلول السكروز 15 ٪ في STE تحتوي على 1 ٪ تريتون X - 100.
3. تراكب بلطف مع 0.25 مل من محلول السكروز 7.5 ٪ في STE باستخدام الماصة واسعة تتحمل 1 مل الحافة. يجب الحرص على عدم الخلط بين الطبقات.
4. تراكب بلطف مع 0.5 مل تعليق الفيروس من الخطوة 2.4. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بعناية لتجنب أي اضطراب في الانحدار واختلاط طبقات السكروز ركيزة أساسية.
5. مكان الأنابيب في دلو SW32.1Ti قبل تبريده والطرد المركزي في 32000 دورة في الدقيقة (187000 XG في _أقصى ص) بين عشية وضحاها (16-20 ساعة) عند 4 درجات مئوية. لتجنب التوقف من اجهزة الطرد المركزي ، لا تبدأ الطرد المركزي حتى الفراغ في أجهزة الطرد المركزي تصل إلى 250 ميكرون
6. جمع الكسور 1 مل من أعلى إلى أسفل التدرج باستخدام fractionator التدرج التلقائي Densi التدفق. وضع أنابيب على الجليد فور المجموعة. خلط محتويات الأنابيب بواسطة عكس المرات القليلة ، وسحب 50 ميكرولتر من كل جزء لالكمي بواسطة ELISA مقايسة أو عكس المنتسخة النشاط.

4. توطين HIV - 1 النوىوتخزين النوى

1. قبل تنفيذ المقايسات uncoating ، فمن المهم لتحديد الكسور التي تحتوي على حالها HIV - 1 النوى. ويمكن تحديد ذلك عن طريق ELISA مقايسة P24 أو عكس النشاط المنتسخة باستخدام aliquots 50 ميكرولتر من الخطوة 3.6.
2. غالبا ما يرتبط انتعاش CA المرتبطة النوى لاستقرار النوى. قياس الأساسية المرتبطة CA بواسطة ELISA P24 ⁹ باستخدام عينة من كل جزء. بدلا من ذلك ، وقياس النشاط المنتسخة عكس كل جزء. باستخدام كل الوسائل يجب أن تكون ذروة حوالي 10 جزءا.
3. تجمع الكسور التي تحتوي على النوى. إذا النوى لا لاستخدامها في uncoating مقايسة على الفور ، قسامة النوى المجمعة في aliquots مل 0،2-0،3 ، ومضة للتجمد في N2 السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية. النوى المجمدة في هذه الطريقة هي مناسبة لفحص uncoating. العائد من CA الأساسية المرتبطة عادة 1-2 ميكروغرام لكل ملليلتر من P24 أو حوالي 15 ٪ من مجموع المرتبط الفيريونP24.

5. مقايسة الحركية من HIV - 1 uncoating

1. كمية من النوى - 1 فيروس نقص المناعة البشرية المطلوبة لكل فعل uncoating هو ما يقرب من 50 نانوغرام. لإجراء فحص في المختبر uncoating ، predilute وقسامة من النوى مع حجم مساو من العازلة 1XSTE الباردة لخفض اللزوجة لتعليق والتقليل من الأخطاء pipetting.
2. مزيد من تمييع 100 ميكروليتر من النوى إلى 0.15 مل من العازلة 1XSTE الباردة تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من جيش صرب البوسنة في أنبوب مل microcentrifuge 1.5. نحن تكملة العازلة STE مع جيش صرب البوسنة (10 ميكروغرام / مل) لتقليل امتصاص CA على الجدران من الأنبوب. مزيج من قبل مرات عدة قلب الأنبوب. لا دوامة العينات. احتضان الأنابيب في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة زمنية موقوتة (15 ، 30 ، 60 دقيقة و 120). وينبغي أن تكون مغمورة في أنابيب المياه في الحمام على الأقل تصل إلى مستوى من العينة الداخلية من أجل ضمان ارتفاع درجات الحرارة حتى.
3. أثناء الحضانة ، مزيج بلطف محتويات الأنبوب بشكل دوري (عادة 5 --10 دقيقة) من قبل عبها الأنبوب. لمراقبة دقيقة الصفر ، تمييع 100 ميكروليتر من النوى إلى 0.15 مل من العازلة 1XSTE الباردة واحتضان على الجليد لكامل مدة التجربة (120 دقيقة). مراقبة دقيقة صفر يعطي قيمة uncoating القاعدية ، ويستخدم لتحديد الزيادة في uncoating من النوى المحتضنة في 37 درجة مئوية لفترات مختلفة في الوقت المناسب.
4. في نهاية فترة الحضانة ، ووقف عملية uncoating بوضع الأنابيب في الثلج لمدة 10 دقائق.
5. أنابيب الطرد المركزي في 45000 دورة في الدقيقة (TLA - 55 الدوار ؛ 125000 XG في _أقصى ص) لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. وهذا بيليه النوى سليمة وخالية CA المفرج عنها نتيجة لuncoating من النوى ستبقى في طاف. وينبغي precooled الدوار عند 4 درجة مئوية قبل التحميل العينات.
6. طاف لنقل أنابيب جديدة microfuge precooled يفضل استخدام الجل التحميل نصائح تخزين في درجة حرارة الغرفة. يرجى ملاحظة أن بيليه لن تكون مرئية للعين المجردة ، حتى تأخذ الرعاية القصوى ثhile pipetting خارج طاف. Resuspend الكريات في 250 ميكروليتر من عينة مخفف ELISA (0.5 ٪ X - 100 و 5 تريتون المانحة في برنامج تلفزيوني العجل المصل). لضمان حل فعال من بيليه ، بعد إضافة دوامة مخفف عينة ELISA. تحديد محتوى CA من بيليه وطاف به ELISA P24 كما هو موضح في المقطع التالي.
7. يتم الحصول على قدر من uncoating عن طريق حساب جزء من CA موجودة في طاف.

6. مقايسة لCA بواسطة ELISA P24

1. العديد من مجموعات تجارية ELISA متوفرة ويمكن استخدامها لتحديد CA. أي استخدام تجاري أو "في المنزل" ELISA ، وتشمل معايير لتحديد P24 الخطي للمقايسة. وينبغي أن يعاير التخفيفات من العينات لضمان الدقة.
2. قمنا بتطوير ELISA محلية الصنع والتي نستخدمها لفحص روتيني لكاليفورنيا. ويتم تكييف الإجراء من تقرير سابق ⁽¹¹⁾ وتتم باستخدام التقاط وكشف عن الأجسام المضادة المتاحة من المعونة المعاهد الوطنية للصحةS الأبحاث والمراجع برنامج الكاشف.

7. ممثل النتائج :

ويرد مثال على نتيجة من ELISA لتحديد الكسور التي تحتوي الأساسية في الشكل 1. بعد جمع الكسور (1 مل لكل منهما) ، واستخدمت 50 ميكروليتر من عينة من كل جزء لجعل التخفيفات المتسلسلة وتحليلها بواسطة ELISA. كان مجموع P24 التي حصلت عليها مضيفا ان القيم لمدة اثني عشر الكسور 14.5 ميكروغرام. كما هو مبين في الشكل الكسور 8-10 الواردة النوى. بلغت قيمة P24 عن كسور الأساسية التي تحتوي على 2.17 ميكروغرام. تم تحديد النسبة المئوية للالأساسية المرتبطة P24 (14.97 ٪) عن طريق اتخاذ P24 نسبة القيمة الأساسية للكسور (2.17 ميكروغرام) إلى إجمالي قيمة P24 (14.5 ميكروغرام). وسوف جزء 1 أو 2 تحتوي دائما أكبر قدر من P24 ، وهذا يمثل CA الحرة التي لا ترتبط مع النوى. ويعقب ذلك من خلال إجراء تخفيض تدريجي في قيم P24 مع كل جزء لاحق ، ثم زيادة حادة ، وأخيرا انخفاض حاد في P24القيم. إذا أخذ الرعاية المناسبة أثناء تحميل التدرج ثم تم العثور على ذروة الأساسية المرتبطة CA حوالي 10 جزءا.

ويرد النتيجة التي حصلت عليها نموذجية معايرة حركية uncoating من النوى HIV - 1 في الشكل 2. ويبين الرسم البياني زيادة تعتمد على الوقت في uncoating من النوى HIV - 1 من النوع البري. تم الحصول على قيمة uncoating في المئة عن طريق حساب جزء من CA موجودة في طاف. مع الممارسة ، ومقايسة هو تكرار للغاية ومفيد لتحديد استقرار النوى الفيروسية في المختبر. يرجى ملاحظة أن استنساخ للمقايسة يعتمد بدرجة كبيرة على التعامل الصحيح مع العينات أثناء العملية. منذ النوى وعطوب بالحرارة ، ينبغي المحافظة على العينات عند 4 درجات مئوية في جميع أنحاء مقايسة إلا أثناء فترة الحضانة.

الشكل 1 التدرج الكثافة الطرد المركزي من التوازنHIV - 1 النوى. وقد طبق نظام التعليق الفيروس تتركز على الجزء العلوي من الانحدار الخطي السكروز 30-70 ٪ مضافين مع 1 ٪ تريتون - X - 100. بعد الطرد المركزي ليلا 187000 XG و 4 درجات مئوية ، وقد تم جمع الكسور 1 مل من الأعلى (الكسر 1) إلى الأسفل (الكسر 12) ، وكان كميا P24 بواسطة ELISA.

الشكل 2 دوام من HIV - 1 uncoating في المختبر. وكانت مخففة المنقى HIV - 1 النوى والمحتضنة في 37 درجة مئوية لفترات زمنية محدد. وقد حضنت العينة دقيقة صفر على الجليد لكامل مدة التجربة. بعد الحضانة ، وكانت العينات في ultracentrifuged 125000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. تم فصل طاف والكريات وتحليلها بواسطة ELISA P24. تم تحديد مدى uncoating كما هو موضح في نص البروتوكول. تم تنفيذ كل رد فعل uncoating في نسختين ؛ أشرطة الخطأ تغطي مجموعة من القيمتين.

Discussion

وصف الأسلوب هنا لتنقية HIV - 1 النوى لدراسة uncoating في المختبر هو مفيد لدراسة هذه المرحلة من دورة الحياة HIV - 1 ، خصوصا بسبب عدم وجود طريقة لتحليل التحقق من صحة HIV - 1 uncoating في الخلايا المستهدفة. على الرغم من أن هذا الأسلوب يستخدم لتنقية تنبيذ فائق التوازن النوى ، والبعض الآخر ق...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليق (اختياري)
DMEM	Cellgro	10-013 - CV
برنامج تلفزيوني	Cellgro	21-031 - CV
تريتون - X - 100	مالينكرودت شركة بيكر	9002-93-1
توين 20	Acros	9005-64-5
0.25 ٪ التربسين - EDTA	Cellgro	25-053 - CI
2XBBS			التكوين : 50mM BES [ع ه 6،95] ، 280 ملي مول كلوريد الصوديوم و 1.5 ملي نا 2 هبو 4. ضبط درجة الحموضة إلى 6.95في درجة حرارة الغرفة. تصفية وتعقيم في متجر في aliquots -20 درجة مئوية.
طلاء الأضداد : ريتوكسيماب إلى P24 (183 - H12 - 5C)	المعاهد الوطنية للصحة والبحوث الإيدز المرجعي برنامج الكاشف	3537
الابتدائية الأضداد : فيروس نقص المناعة البشرية الإيج (مصل المريض مفرط المناعة البشرية)	NIH أبحاث الإيدز والبرنامج المرجعي الكاشف	3957
الأجسام المضادة الثانوية : الماعز المضادة للمفتش الإنسان ، مترافق البيروكسيداز	ثقب	31130
HRP الركيزة	KPL المؤتمر الوطني العراقي	50-76-11
Immulon 2HB 96 لوحات جيدة	الحرارية العلمية	3455
وSW32Ti SW32.1 الدوارات تي نابذة فائقة السرعة ومتوافق	بيكمان كولتر
TLA - 55 الدوار ونابذة فائقة السرعة منضدية	بيكمان كولتر
سرعة عالية أنابيب microfuge	بيكمان كولتر	326823 ، 358123 ، 357448
التدرج التلقائي Densi كثافة تدفق fractionator	Labconco كورب	4517000
التدرج السابقة	شركة سي بي اس العلمية المحدودة	GM - 20