JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نظام الوراثة العكسية للMP - 12 لحمى الوادي المتصدع فيروس سلالة اللقاح هي أداة مفيدة لخلق إضافية MP - 12 المسوخ مع تخفيف وزيادة المناعة. نحن تصف البروتوكول لتوليد سلالات متحولة وتوصيف NSS.

Abstract

تم تصنيف فيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) ، والذي يسبب الحمى النزفية ، واضطرابات عصبية أو العمى في البشر ، وارتفاع معدل الإجهاض وتشوه الأجنة في المجترات 1 ، باعتباره HHS / وكيل وزارة الزراعة الأميركية التداخل تحديد المخاطر والعوامل المسببة للأمراض المجموعة 3. انه ينتمي الى جنس الفاصدة Phlebovirus في الأسرة والفيروسات البنياوية هي واحدة من أكثر أفراد هذه العائلة الخبيثة. وقد تم تطوير عدة أنظمة الوراثة العكسية للسلالة MP - 12 RVFV قاح 2،3 فضلا عن السلالات البرية من نوع RVFV 4-6 ، بما في ذلك ZH548 وZH501 ، منذ عام 2006. و- 12 MP سلالة (الذي يشكل خطرا المجموعة 2 الممرض وعامل عدم تحديد) وموهن للغاية من قبل العديد من الطفرات في تقريرها M - L - والشرائح ، ولكن لا يزال يحمل خبثا S - RNA الجزء 3 ، الذي يشفر الفوعة وظيفية عامل ، NSS. وrMP12 - C13type (C13type) تحمل 69 ٪ في الإطار حذف ORF NSS تفتقر جميع وظائف NSS المعروفة ، في حين أنه يكرر ما efficient كما يفعل MP - 12 في الخلايا التي تفتقر VeroE6 النوع الأول الإنترفيرون. NSS يحرض للإيقاف من النسخ المضيفة بما في ذلك الإنترفيرون (الإنترفيرون) بيتا 7،8 مرنا ويعزز تدهور المزدوج تقطعت بهم السبل بروتين كيناز التي تعتمد على الحمض النووي الريبي (PKR) في مرحلة ما بعد متعدية. 9،10 الإنترفيرون بيتا transcriptionally upregulated بواسطة عامل إنترفيرون التنظيمية 3 (IRF - 3) ، NF كيلوبايت والبروتين المنشط - 1 (AP - 1) ، والملزمة لالإنترفيرون بيتا لمستقبلات IFN-alpha/beta (IFNAR) يحفز النسخ من الإنترفيرون ألفا الجينات أو غيرها من الجينات الإنترفيرون حفز (ISGs) 11 ، والذي يدفع الأنشطة المضيفة للفيروسات ، في حين تستضيف قمع النسخ بما في ذلك الإنترفيرون بيتا الجينات التي كتبها NSS يمنع upregulations تلك الجينات ISGs ردا على الرغم من تكاثر الفيروس IRF - 3 ، NF - KB ومنشط البروتين - 1 يمكن تفعيلها (AP - 1) بواسطة RVFV7. . وهكذا ، NSS هو هدف ممتازة لتخفيف مزيد من MP - 12 ، وتعزيز الاستجابات المناعية الفطرية المضيفة من خلال إلغاء وظيفة قمع الإنترفيرون بيتا. هنا، ونحن تصف بروتوكول للتوليد المؤتلف النائب NSS - 12 ترميز تحور ، ومثالا لطريقة الفرز لتحديد المسوخ NSS تفتقر إلى وظيفة لقمع الإنترفيرون بيتا التوليف مرنا. بالإضافة إلى دورها الأساسي في المناعة الفطرية ، النوع الأول هو الإنترفيرون مهمة لنضوج الخلايا الجذعية وتحريض استجابة مناعية التكيف 12-14. وبالتالي ، إحداث نوع المسوخ NSS - I الإنترفيرون وكذلك الموهن ، ولكن في نفس الوقت أكثر كفاءة في تحفيز استجابات المضيف المناعية من النوع البري من MP - 12 ، مما يجعلها مثالية للمرشحين نهج التطعيم.

Protocol

1. انتعاش المترابط 12 MP ترميز طفرة NSS (ق) من السلطات الوطنية المعينة بلازميد 2

  1. الكلى انتشار الهامستر الرضيع (BHK) / T7 - 9 خلايا 15 ، الذي أعرب عن ستابلي بوليميريز RNA T7 ، في 6 سم في أطباق متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) ألفا (Invitrogen ، القط # 32561037) تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS ) ، البنسلين ، الستربتوميسين (البنسلين : 100 U / لتر ، الستربتوميسين : 100 ميكروغرام / مل) (Invitrogen ، القط # 15140122) ، و 600 ميكروغرام / مل باء هيغروميسين (Cellgro ، القط # 30 - 240 - CR).
    * كفاءة استرداد الفيروسية أعلى في 6 سم من الأطباق في 35 ملم الأطباق. BHK/T7-9 الخلايا مع مرور المستوى المنخفض دعم ارتفاع معدلات الاسترداد. بدلا من ذلك ، وغيرها من خطوط الخلايا BHK يمكن أن يتم استخدام تعبير ثابت بوليميريز RNA T7 4،5،16،17.
  2. عندما وصلت الخلايا confluency 70-80 ٪ ، استبدال طاف مع ثقافة جديدة MEM ألفا تحتوي على 10 ٪ FBS البنسلين والستربتوميسين - (لا تحتوي على هيغروميسين باء).

    * ينبغي أن تكون خلايا transfecteد في حدود 1 ساعة بعد استبدال المتوسطة لتجنب فقدان التعبير T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي.
  3. لاسترداد RVFV ، مجموعة من البلازميدات ترميز الرناوات الجينوم الفيروسي لكامل طول التعبير RNA الفيروسي ، ومجموعة ثانية ترميز الجين الفيروسي إطارات القراءة المفتوحة للتعبير البروتين الفيروسي (الشكلان 1 و 2) مطلوبة. تحضير خليط من plasmids2 التالية (الشكل 2) في أنبوب 1.5 مل :
    1. pProT7 - S (+) مع الطفرة (s) في الجين NSS (2 ملغ) : هذا البلازميد بترميز المضادة للفيروسات ، بمعنى (بالمعنى الإيجابي) كامل طول RVFV MP - S - 12 قطعة محاطة المروج وT7 فيروس التهاب الكبد دلتا تسلسل ribozyme (HDV).
    2. pProT7 - M (+) (2 ملغ) : هذا البلازميد بترميز المضادة للفيروسات ، بمعنى (بالمعنى الإيجابي) كامل طول RVFV MP - M - 12 قطعة محاطة المروج T7 وتسلسل ribozyme HDV.
    3. pProT7 - L (+) (2 ملغ) : هذا البلازميد بترميز المضادة للفيروسات ، بمعنى (بالمعنى الإيجابي) كامل طول RVFV MP - 12 L - الجزء FLAnked من المروج T7 وتسلسل ribozyme HDV.
    4. pT7 - VN - IRES (2 ملغ) : هذا البلازميد بترميز MP - 12 N RVFV الإطار القراءة المفتوحة (ORF) المصب من المروج وT7 فيروس encephalomyocarditis (EMCV) الداخلية دخول الموقع الريبوسوم (IRES).
    5. pT7 - IRES - VL (1 ملغ) : هذا البلازميد بترميز RVFV MP - 12 L ORF المصب من المروج وT7 IRES EMCV.
    6. pCAGGS - VG (1 ملغ) : هذا البلازميد بترميز RVFV النائب M - 12 المصب ORF من المروج بيتا الأكتين الدجاج.
      * إضافة pT7 - VN - IRES ، pT7 IRES - VL - VG - pCAGGS وليس من الضروري لاسترداد MP - 12 ، لكنه يعزز كفاءة الانقاذ 2. شهدت كتاب التعبير سوء تك / GC باستخدام pT7 - IRES البلازميد ، وربما يرجع ذلك إلى عدم وجود مسح المتسرب من AUGs بواسطة الريبوزومات. ولذلك ، فإننا شيدت pCAGGS - VG للتعبير تك / GC - سقف المعالين.

  4. إضافة 30 مل من العبور LT1 (Mirus ، القط # MIR2300) إلى 385 مل من OPTI - MEM (Invitrogeن ، القط # 31985070) في أنبوب مل 1.5 ، ودوامة لفترة وجيزة.
  5. بعد 5 دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة ، إضافة ببطء OPTI - MEM الليبوزومات تحتوي على خليط من الخطوة البلازميد 1.3 إلى المزيج بلطف pipetting واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة خليط من الحويصلية والبلازميدات إلى مستنبت من خلايا BHK/T7-9 من قطرة قطرة 1.2 الخطوة (الشكل 3).
  7. احتضان خلايا transfected عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع CO 2 5 ٪ لمدة 24 ساعة ، واستبدال ثقافة طاف مع MEM ألفا الطازجة التي تحتوي على 10 ٪ FBS البنسلين والستربتوميسين - (لا تحتوي على هيغروميسين باء).
  8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع CO 2 5 ٪ لمدة 4 أيام إضافية (احتضان لمدة 5 أيام المجموع) ، وجمع supernatants الثقافة في أنبوب 15 مل.

    * تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) لاحظ هنا لا تعكس بالضرورة ونتيجة للانتعاش فيروسية ناجحة ، لأن ترنسفكأيشنيستحث موت الخلايا التي تبدو مشابهة لCPE الناجمة عن تكرار RNA الفيروسي أو الفيروسية تخليق البروتين.
  9. الطرد المركزي في 2200 في supernatants XG عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

    * والغرض من هذه الخطوة هو بيليه أسفل الحطام الخلوية من المخزون الفيروسية. وأوصى دلو الطرد المركزي الهباء محكم لزيادة السلامة.
  10. نقل supernatants إلى برغي الغطاء cryotubes 5 مل ، وتخزين مرور 0 (P0) الأسهم الفيروس في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى.

2. التضخيم من فيروس P0

  1. وغالبا ما تحتوي على عينات P0 عيار فيروسية غير كافية لإجراء التجارب النهائية 2. خطوة التضخيم في VeroE6 الخلايا ، وهو استنساخ خلايا القرود الأفريقية الخضراء (فيرو) الكلى تفتقر إلى جينات IFN-alpha/beta 18،19 ، ويزيد من عيار الفيروسي يصل إلى أقصى مستوى. بدلا من ذلك ، تفتقر إلى الخلايا الأخرى النوع الأول الإنترفيرون استجابات الخلايا مثل خلايا Hec1B 20 أو MEF من IFNAR1 - 21 بالضربة القاضية الفئران mighر أن تستخدم لهذه الخطوة. انتشار VeroE6 الخلايا إلى 10 سم ، والصحون في المتوسط ​​Dulbecco لتعديل الحد الأدنى الأساسي (DMEM) (Invitrogen ، القط # 11965092) تحتوي على 10 ٪ FBS ، البنسلين ، الستربتوميسين (البنسلين : 100 U / لتر ، الستربتوميسين : 100 ملغ / مل) ، واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة مع CO 2 5 ٪ حتى تصل إلى 80 ٪ confluency.
    * المؤتلف MP - 12 ترميز NSS سلالات متحولة غالبا ما تفشل لتكرار بكفاءة في النوع الأول الخلايا الإنترفيرون المختصة.
  2. مزيج من 300 مل P0 عينات مع 2.7 مل من DMEM FBS مع 10 ٪ والستربتوميسين بنسلين. إزالة مستنبت من خلايا VeroE6 من 2.1 خطوة واستبدالها مع العينة P0 المخفف. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2.
  3. إزالة قائح وإضافة 10 مل من DMEM FBS مع 10 ٪ والبنسلين الستبرتوميسين إلى كل طبق.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 إلى 4 أيام حتى CPE من VeroE6 الخلايا تصبح واضحة.
    * تعطيل المونولاير يحدث خلال العدوى - 12 MP ، whilه المؤتلف النائب NSS - 12 متوفرة ، مثل rMP12 - C13type (C13type) (الشكل 4) ، لا تعطل أحادي الطبقة ، ولكن عددا من خلايا ميتة طافية تظهر 2 إلى 3 أيام بعد الإصابة.
  5. طاف في حصاد 3-4 نقطة في البوصة ، كما هو موضح في المقاطع 1.9) و 1.10) ، ويعين على عينات E6P1.

3. معايرة المؤتلف MP - 12 بواسطة لوحة مقايسة

  1. انتشار الخلايا في VeroE6 6 - جيدا لوحات.
    * تحليل عينة مكررة في أكثر موثوقية من تحليل واحد.
  2. عندما VeroE6 الخلايا قد نمت إلى 80 ٪ confluency ، وإعداد 10 أضعاف التخفيفات المتسلسلة لعينات الفيروس في DMEM FBS مع 10 ٪ والبنسلين الستبرتوميسين المتابعة ل10-6 على النحو التالي :
    • 10 ميكروليتر من عينة E6P1 + 990 مل من DMEM FBS مع 10 ٪ والبنسلين الستبرتوميسين - (10 -2 التخفيف)
    • 100 ميكروليتر من عينة -2 10 + 900 مل من DMEM FBS مع 10 ٪ والبنسلين ، الستربتوميسين (10 التخفيف -3)
    • 100ميكرولتر من 10 عينة -3 + 900 مل من DMEM FBS مع 10 ٪ والبنسلين ، الستربتوميسين (10 تمييع -4)
    • 100 ميكروليتر من عينة 10 -4 + 900 مل من DMEM FBS مع 10 ٪ والبنسلين الستبرتوميسين - (10-5 التخفيف)
  3. نضح المتوسطة من لوحة 6 - جيدا من الخطوة 3.1 وإضافة 400 ميكرولتر من كل تخفيف (من الخطوة 3.2) في الآبار (الشكل 3).
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2.
  5. أثناء الحضانة ، وإعداد مدة 15 مل أنابيب للتراكب ، أغار على النحو التالي :
    أنبوب (نضع في حمام مائي 42 ° C) : 7 مل من آغار النبيلة 1.2 ٪ (VWR ، القط # 101170-362) في الماء
    أنبوب B (نضع في حمام مائي 37 ° C) : 7 مل من التعديل النسر متوسطة (MEM 2X) (Invitrogen ، القط # 11935046) تحتوي على 10 ٪ FBS ، البنسلين ، الستربتوميسين (البنسلين : 100 U / لتر ، الستربتوميسين : 100 ميكروغرام / مل) ، و 10 ٪ Tryptose الفوسفات مرق (biomedicals النائب ، القط # 1682149).
  6. بعد حضانة ح 1 ، إزالة الفيروسيةقائح ، وعلى الفور إضافة 2 مل لكل بئر من مزيج 01:01 من أنبوب A و B أنبوب (من الخطوة 3.5).
    * احرص على إضافة تراكب على الفور لنضوب الآبار يتسبب في موت الخلايا غير المصابة.
  7. احتضان لوحات على 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام في حاضنة مع 5 ٪ CO 2.
  8. إعداد أنبوب ألف وباء أنبوب مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.5. أيضا بإعداد 500 ميكروليتر من محلول 0.33 ٪ أحمر محايدة (سيغما الدريتش ، القط # N2889 - 100ML) لكل لوحة والتي يتم الاحتفاظ بها أيضا في حمام الماء 37 درجة مئوية.
  9. أنبوب مزيج A ، B وأنبوب 500 مل (اضرب النهائي. 0.011 ٪) من حل أحمر محايدة وإضافة 2 مل من خليط لكل بئر.
    * كمية من محلول أحمر محايدة لتضاف يختلف عن الكثير من حل أحمر محايدة ، وكان المطلوب التحسين الأولي. على المدى الطويل تخزين حل 0.33 ٪ محايد الحمراء يسبب هطول الأمطار. في مثل هذه الحالات ، يمكن أن يعجل بحل تماما الحضانة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها تهز قوية. استخدام ص محايدة عجلتنتائج حل إد في تلطيخ ضعف الخلايا ، في حين حلت إعادة محايدة البقع الحمراء حل الخلايا أيضا.
  10. احتضان لوحة لمدة 16 ساعة (أو بين عشية وضحاها) عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5 ٪ CO 2.
  11. حساب عدد لويحات في البئر الذي يحتوي على 1-10 ويحات لكل بئر. حساب عدد الوحدات التي تشكل لوحة / مل. على سبيل المثال ، إذا كان لنا أن نلاحظ 28 لويحات في الآبار تلقيح مع التخفيفات -5 10 ، 28 (# لويحات) × (1 ml/0.4 مل) × 10 5 (التخفيف) = 7.0 × 10 6 وحدات لوحة تشكيل (pfu) / مل (الشكلان 5).

4. فحص المسوخ NSS تفتقر إلى قمع الإنترفيرون النوع الأول وظيفة

  1. انتشار الخلايا C57/WT MEF (InvivoGen ، القط # MEF - c57wt) ، والذي ترميز الفوسفاتيز القلوية يفرز الجنينية (استصلاح) محرض الجينات التي كتبها NF - KB وIRF - 3 / 7 (الشكل 6) ، إلى جانب 12 لوحات. تتم المحافظة على الخلايا في DMEM مع FBS 10 ٪ ، والبنسلين ، الستربتوميسين (Penicillin : 100 U / لتر ، الستربتوميسين : 100 ميكروغرام / مل) ، Blasticidin S (3 ملغ / مل) ، وZeocin (100 ميكروغرام / مل).
  2. عندما تصبح الخلايا شبه متموجة (80 ٪) ، وخلايا وهمية أو المصابين بعدوى MP - 12 أو المؤتلف النائب NSS - 12 ترميز الطفرات في تعدد العدوى (موي) من 3 أو 0.1 (انظر الأقسام 2 و 3 ، ومقدار وينبغي أن يكون كل قيحة 300 ميكرولتر). إصابة آخر في 1 ساعة ، وإزالة قائح ، وإضافة 1 مل لكل بئر من DMEM مع 10 ٪ FBS ، البنسلين ، الستربتوميسين (البنسلين : 100 U / لتر ، الستربتوميسين : 100 ميكروغرام / مل) (لا تضاف Blasticidin وZeocin في هذه الوقت).
  3. إصابة آخر في 14 ساعة ، وجمع supernatants الثقافة. إضافة 200 ميكرولتر من QUANTI أزرق (InvivoGen ، القط # مندوب - qb1) و 50 ميكرولتر من كل عينة (في ثلاث نسخ) من الآبار لوحة 96 - جيدا. ختم واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    * كلا MP - 12 و 12 MP - المؤتلف NSS حمل تفتقر بوضوح قمع متعدية في الخلايا المضيفة IFN-alpha/beta المختصة بما في ذلك 293 الخلايا ، والخلايا MRC - 5 و embr الماوسyonic الليفية (MEF) خلايا بعد 14 ساعة على آخر عدوى عالية وزارة الداخلية. من ناحية أخرى ، الإنترفيرون بيتا مرنا أو مرنا بما فيه الكفاية في ISG56 يتراكم 7-8 عدوى آخر ساعة في النوع الأول الإنترفيرون الخلايا المختصة. وبالتالي ، اخترنا 14 إصابة آخر ساعة لجمع supernatants لرؤية تراكم استصلاح الناجم عن الاستجابات المناعية الفطرية.
  4. قراءة القيم OD في 650 نانومتر باستخدام قارئ لوحة (الشكل 7).
    * وكانت النتائج متسقة مع البيانات التي حصلت عليها لطخة الشمالية باستخدام الحمض النووي الريبي محددة لتحقيق مرنا ISG56 الماوس ، مما يدل على المتابعة تنظيم ISG56 مرنا في غياب التعبير NSS (الشكل 8).
    * وتجدر الإشارة إلى أن يتم تحديد نشاط استصلاح من وفرة من البروتينات التي يمكن أن تتأثر نشاط الترجمة المضيف. وقد يكون المستوى النسبي للاستصلاح لا تكون مرتفعة بالمقارنة مع زيادة مستوى مرنا لأنه لا يمكن أن يكون استصلاح توليفها حتى في وجود مرنا إذا استصلاح الترجمة الخلوية suppressed. شمال لطخة هو فحص أكثر وضوحا وبطريقة أكثر دقة لتقييم كمية مرنا الناجم عن عدم وجود وظائف NSS في الخلايا المصابة من مقايسة مراسل استصلاح. ومع ذلك ، فإن نظام مراسل استصلاح أكثر سرعة مما هو وصمة عار الشمالية وبالتالي مفيدة للفحص السريع للالمسوخ NSS تفتقر يحتمل ظيفة المضيف قمع النسخ.

5. ممثل النتائج :

نظام الوراثة العكسية المتولدة باستمرار قابلة للحياة المؤتلف MP - 12 الفيروسات مع التتر أعلى من 1 × pfu 6 10 / مل. تشكيل فيروس نقص الوظائف C13type NSS عكر ويحات كبيرة ، في حين شكلت MP - 12 لويحات واضحة من مختلف الأحجام 2 (الشكل 5). لم همية الخلايا المصابة MEF C57/WT أو المصابين MP - 12 لا زيادة مستوى استصلاح طاف في مقابل ثقافة وهمية الخلايا المصابة ، في حين طاف ثقافة من الخلايا المصابة MEF C57/WT C13type احتوى على زيادةمستوى استصلاح بنسبة 14 إصابة آخر ساعة (HPI) (الشكل 7). هذه النتائج متوافقة مع تلك التي حصل عليها لطخة الشمالية باستخدام الحمض النووي الريبي محددة لتحقيق مرنا ISG56 الفأرة (الشكل 8).

figure-protocol-14440
هيكل الرقم 1 الجينوم. RVFV لل
RVFV لديه الثلاثي السلبية أو بمعنى ambisense RNA يسمى الجينوم S ، M ، L - والجزء. S - N شريحة بترميز الجينات وNSS بطريقة ambisense. يتم تصنيعه من الشعور N مرنا للفيروسات (بالمعنى السلبي) S - الجزء ، في حين يتم تصنيعه مرنا NSS من الحس المضادة للفيروسات (بالمعنى الإيجابي) S - الجزء. M - الجزء يشفر مرنا M واحدة ويجمع the78kD ، NSM ، تك أو البروتينات القيادة العامة عن طريق مسح المتسرب من AUGs عدة في 5'region من مرنا M ، تليها تشطر المشترك متعدية على 22،23. L - الجزء بترميز بروتين L. كلا N و L البروتينات ضرورية لالنسخ الفيروسية وتكرار ، في حين تك و GC هي البروتينات الفيروسية المغلف. NSS والبروتينات هي بروتينات ابنيوي NSM ، والتي لم تدرج في جزيئات الفيروس.

figure-protocol-15305
الشكل 2. تصميم DNA البلازميد لاسترداد المؤتلف سلالة RVFV MP - 12
ترميز [كدنا] بالطول المضادة للفيروسات ، بمعنى S ، M ، L - أو الجزء من T7 هي cloneddownstream المروج والمنبع فيروس التهاب الكبد دلتا (HDV) متواليات ribozyme ، على النحو المحدد S - pProT7 (+) ، pProT7 - M (+) ، أو pProT7 - L (+) ، على التوالي 2. T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي التي أعرب عنها في خلايا BHK/T7-9 transcribes الترميز الحمض النووي الريبي كامل طول S ، M ، L - الجزء أو مع نهاية الجينوم 3 'دقيقة. يتم استنساخ الإطار القراءة المفتوحة (ORF) أو البروتينات من N L تحت encephalomyocarditis فيروس (EMCV) الداخلية دخول الموقع الريبوسوم (IRES) ، والتي يطلق عليها مسمى pT7 - VN - IRES أو pT7 IRES - VL ، على التوالي ، للسماح لللم يسبق لهم اللعب لا بد من الاعتراف T7 الحمض النووي الريبي التي نص ريبوسوم في كاب indepenدنت الطريقة. هو استنساخ ORF M - تحت المروج ب الأكتين الدجاج من pCAGGS البلازميد 24 ، التي اعتبرت بمثابة pCAGGS - VG ، للسماح للتوليف 78kD ، NSM ، والبروتينات تك القيادة العامة ، والتي يتم إنشاؤها من AUGs مختلفة عن طريق المسح الضوئي راشح 23. كلاهما مطلوب N والبروتينات L لبدء النسخ المتماثل أو الحمض النووي الريبي ، في حين أن pT7 - VN - IRES وpT7 - VL - IRES ليست ضرورية لاسترداد المؤتلف 2 MP - 12 ، وربما بسبب التعبير المتسرب من بول ممكن إفتراضه ثانيا يحركها توج ترميز النصوص الحمض النووي الريبي N - L وORF ORF - S - pProT7 من (+) وpProT7 - L (+) ، على التوالي.

figure-protocol-16858
الشكل 3. استرداد RVFV MP - 12 من الحمض النووي البلازميد
ترنسفكأيشن BHK/T7-9 من الخلايا مع S - pProT7 (+) ، pProT7 - M (+) ، pProT7 - L (+) ، pT7 - VN - IRES ، pT7 VL - IRES وpCAGGS - VG البلازميدات (Fig.1 ) يولد المعدية المؤتلف RVFV MP - 12 سلالة طاف في الثقافةس. يتم جمع طاف في 5 أيام ترنسفكأيشن آخر ، وpassaged جديدة في الخلايا E6 فيرو لتضخيم الفيروسية. عادة ، يمكن استرداد أكثر من 1 × 10 6 pfu / مل من الفيروس في 3-4 عدوى آخر أيام. غير معاير الفيروس تضخيم (E6P1 فيروس) باستخدام مقايسة مع الخلايا E6 وحة فيرو واستخدامها لأغراض التحليل والدراسات استمناع النمط الظاهري.

figure-protocol-17600
الشكل 4. S - شريحة من MP - 12 - C13type وrMP12
المقارنة بين 12 و MP - rMP12 - C13type (C13type) S - القطع. بالمقارنة مع NSS - 12 سلالة من النائب ، يتم اقتطاع ORF NSS من C13type بنسبة 69 ٪ ، ومطابقة لتلك التي من سلالة معزولة بشكل طبيعي 13 استنساخ 2،25.

figure-protocol-18024
الشكل 5. مقايسة لوحة MP - 12 (NSS غير وظيفية) (NSS الوظيفية) وC13type
والمونولاير هاء فيرويستخدم 6 خلايا في طبق 6 - جيدا لفحص اللوحة. واضاف بعد 3 أيام الحضانة مع تراكب آغار 0.6 ٪ ، وتراكب أغار ثانية تحتوي على حل أحمر محايدة. ثم ، يتم عدها لويحات في يوم آخر العدوى 4. MP - 12 نماذج لويحات واضحة من أحجام متنوعة ، في حين C13type أشكال العكرة لويحات كبيرة (أو البؤر). ينبغي أن تستخدم بشكل جيد مع 1-10 ويحات لفرزها.

figure-protocol-18597
الشكل 6. مسار تفعيل يفرز القلوية الفوسفاتيز (استصلاح) مراسل الجينات في خلايا MEF C57/WT
انترفيرون بيتا المروج يتضمن تسلسل الملزمة AP - 1 ، NF - KB وIRF - 3. RVFV تكرار ينشط AP - 1 ، NF كيلوبايت و7،11 IRF - 3. ومع ذلك ، NSS تمنع اطلاق سراح معقدة كاظمة من المروج الإنترفيرون بيتا حتى بعد الملزم لتلك العوامل النسخ ، وبالتالي قمع تجميع الإنترفيرون بيتا مرنا 26. علاوة على ذلك ، NSS بامتصاصه TFIIH P44 وsubunits8يسوتو يعزز تدهور مفارز p62 TFIIH 27 ، الأمر الذي أدى بالتالي النسخ المضيف العام بما في ذلك قمع الإنترفيرون ألفا الجينات والمورثات تحت ISRE المروج. المسوخ NSS C13type أو غيرها تفتقر الإنترفيرون بيتا ظيفة قمع لحث الإنترفيرون بيتا التوليف ، والذي بدوره ينشط المروج الإنترفيرون ألفا وعنصر استجابة الإنترفيرون حساسة المروج (ISRE). IRF - 7 ومن ثم upregulated transcriptionally بواسطة التحفيز وزيادة IFN-alpha/beta upregulated بواسطة الإنترفيرون ألفا في دعم IRF - 3 28،29. في هذا الاختبار ، C57/WT الخلايا MEF ترميز الفوسفاتيز القلوية يفرز (استصلاح) في اتجاه مجرى النهر من التسلسل ملزمة اصطناعية من NF - KB ، IRF - 3 و 7 IRF. وهكذا ، تفتقر المسوخ NSS الإنترفيرون بيتا ظيفة قمع upregulate استصلاح إفراز التي يقاس ذلك الحين.

figure-protocol-19926
الرقم 7. تحريض استصلاح بواسطة C13type
وكانت الخلايا C57/WT MEF (InvivoGen) وهميةأو المصابين بعدوى MP - 12 أو rMP12 - C13type (C13type) في وزارة الداخلية من 3 (اللوحة اليسرى) أو 0.01 (اللوحة اليمنى). كانت مختلطة supernatants الثقافة (50 ميكرولتر) في 14 HPI مع 200 ميكرولتر من QUANTI أزرق (InvivoGen) الركيزة في 96 لوحة وكذلك القيم OD في 650 نانومتر قيست بعد حضانة ح 1 إلى 37 درجة مئوية بحلول قارئ اللوحة. وتظهر الزيادة النسبية للاستصلاح وهمية إلى الخلايا المصابة. تمثل البيانات يعني + / -- الانحراف المعياري لثلاث تجارب مستقلة. وطاف C13type الثقافة من الخلايا المصابة يظهر زيادة استصلاح ، مما يشير إلى عدم وجود قمع النسخ المضيف NSS.

figure-protocol-20719
الرقم 8. الشمالية مع لطخة DIG المسمى مسبار الحمض النووي الريبي
وكانت من النوع البري الماوس الجنينية الخلايا الليفية (MEF) الخلايا المصابة وهمية أو المصابين MP - 12 أو rMP12 - C13type (C13type) في وزارة الداخلية من 3. وقد جمعت في الحمض النووي الريبي مجموع 7 HPI باستخدام Trizol (Invitrogen) ، وب الشماليةتم تنفيذ الكثير digoxigenin باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحمل علامات محددة لتحقيق مرنا الماوس ISG56 الذاتية أو MP - 12 N مرنا / المضادة للفيروسات ، بمعنى S - الجزء 2،30. لجعل الماوس مرنا للتحقيقات ISG56 الذاتية أو RVFV مرنا N / المضادة للفيروسات ، بمعنى S - الجزء ، شظايا PCR تضخيمها من قبل مجموعة من KpnmISG56F التمهيدي (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA دول مجلس التعاون الخليجي TTC GCA AAG CAG) وHindmISG56 (TAC AAA GCT تات GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) للISG56 مرنا أو KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA الجهاز المركزي للمحاسبات CTA TCA AGA GCT TGC G) وHindNR (GGG الجهاز المركزي للمحاسبات GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) لRVFV وهضمها مرنا N / المضادة للفيروسات ، بمعنى S - KPN مع الجزء الأول والثالث هند ، وligated في pSPT18 البلازميد (تم توليفها Roche. ثم تحقيقات RNA المسمى مع digoxigenin باستخدام الحمض النووي الريبي وصفها DIG كيت (SP6/T7) (روش ، القط # 1 175 025). يظهر أيضا مستوى الرنا الريباسي 28S من كل عينة على تحميل السيطرة. الخلايا MEF البرية من نوع المصابين بفعل C13type التوليف ISG56 مرنا ، في حين أن المصابين النائب-12 لم يكن حملها ، مما يشير إلى عدم وجود قمع النسخ C13type المضيف في الخلايا المصابة. كانت البيانات متسقة مع تلك التي حصل عليها مقايسة استصلاح في الشكل 6.

Discussion

وقد وضعت نظم لعلم الوراثة العكسية RVFV عدة جماعات من خلال الاستفادة من T7 المروج 2،4،5 أو الماوس 3 أو 4 المروج بول الإنسان الأول. في هذا المخطوط ، وصفنا بروتوكول لتوليد المؤتلف MP - 12 RVFV سلالات باستخدام الخلايا ال 15 التي BHK/T7-9 ستابلي أعرب بوليميريز RNA T7....

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من حيث عدد المنح 5 AI057156 U54 - 07 من خلال المركز الإقليمي للتميز الغربية (WRCE) ، 1 AI08764301 R01 - A1 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية ، والتمويل الداخلي من مركز سيلي استحداث اللقاحات في جامعة تكساس الطبية فرع.

Materials

اسم الكاشف شركة فهرس العدد تعليق (اختياري)
متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) ألفا Invitrogen 32561037
Dulbecco لتعديل المتوسطة الأساسية الدنيا Invitrogen 11965092
تعديل النسر متوسطة (MEM 2X) Invitrogen 11935046
البنسلين الستربتوميسين Invitrogen 15140122
هيغروميسين B Cellgro 30-240 - CR
Tryptose الفوسفات مرق النائب biomedicals 1682149
نبيلة آغار VWR 101170-362
العابر LT1 Mirus MIR2300
OPTI - MEM Invitrogen 31985070
غطاء محكم الهباء إيبندورف C - 2223-25
0.33 ٪ حل أحمر محايدة سيغما الدريتش N2889 - 100ML
C57/WT الخلايا MEF InvivoGen MEF - c57wt
Blasticidin S InvivoGen النمل BL - 1
Zeocin InvivoGen النملة والزنك - 1
QUANTI أزرق InvivoGen مندوب - qb1
BHK/T7-9 الخلايا 15 الجامعة جيفو ، اليابان
فيرو الخلايا E6 ATCC CRL - 1586

References

  1. Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
  2. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  3. Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
  4. Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
  5. Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
  6. Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
  7. May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  8. Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
  9. Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
  10. Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
  11. Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
  12. Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
  13. Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
  14. Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
  15. Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
  16. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  17. Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
  18. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
  19. Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
  20. Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
  21. Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
  22. Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
  23. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  24. Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
  25. Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
  26. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  27. Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
  28. Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
  29. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
  30. Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
  31. Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
  32. Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

57 NSS MP 12

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved