نوعان من فحوصات الكشف عن الضفدع Chemoattraction الحيوانات المنوية

Summary

البيض والطلاء خارج الخلية حول الافراج عن البيض في كثير من الأحيان الببتيدات والبروتينات والجزيئات الصغيرة التي تتصل مع الحيوانات المنوية لإرشادهم إلى البويضة وبالتالي تعزيز الإخصاب. باستخدام الحيوانات المنوية وصفنا ضفدع وقارن بين فئتين من المقايسات المستخدمة للكشف عن الحيوانات المنوية chemoattraction -- المقايسات تراكم الحيوانات المنوية والمقايسات تعقب الحيوانات المنوية.

Abstract

يمكن chemoattraction الحيوانات المنوية في اللافقاريات تكون قوية بما فيه الكفاية يمكن للمرء أن يضع ماصة تحتوي على الببتيد جذابة في تعليق الحيوانات المنوية مجهريا ووضع تصور لتراكم الحيوانات المنوية حول ماصة ^1. chemoattraction الحيوانات المنوية في الفقاريات مثل القوارض والضفادع والبشر هي أكثر صعوبة ويتطلب الكشف عن المقايسات الكمية. هذه المقايسات من نوعين رئيسيين -- المقايسات أن حركة الحيوانات المنوية quantitate الى مصدر جاذب كيميائي ، يسمى المقايسات تراكم الحيوانات المنوية ، والمقايسات التي تتبع فعليا مسارات للسباحة الحيوانات المنوية الفردية.

المقايسات تراكم السائل المنوي تكون سريعة نسبيا السماح عشرات أو مئات من المقايسات ينبغي القيام به في يوم واحد ، مما يسمح ليتم منحنيات الاستجابة للجرعة والدورات مهلة بسرعة نسبيا. وقد استخدمت هذه الأنواع من المقايسات على نطاق واسع لوصف العديد من أنظمة chemoattraction راسخة -- على سبيل المثال ، إلى الكيميائي العدلة البكالورياterial الببتيدات والكيميائي الحيوانات المنوية إلى السائل الجريبي. ويمكن تتبع المقايسات الحيوانات المنوية تكون أكثر كثافة اليد العاملة ولكنه لم يقدم بيانات إضافية حول كيفية تغيير الواقع chemoattractancts مسارات السباحة التي تأخذ الحيوانات المنوية. هناك حاجة إلى هذا النوع من الفحص لبيان اتجاه حركة الحيوانات المنوية بالنسبة للمحور التدرج chemoattrractant ويتحول إلى تصور مميزة أو تغيرات في الاتجاه الذي جعل الحيوانات المنوية أكثر قربا من البيض.

نحن هنا وصف الأساليب المستخدمة في كل من هذين النوعين من المقايسات. يسمى الفحص تراكم السائل المنوي استخدامها على "من مجلسين" مقايسة. توضع الحيوانات المنوية في البرمائيات لوحة ادخال زراعة الأنسجة مع الكلمة تصفية البولي بعد 12 المسام قطرها ميكرون. وتوضع مع الحيوانات المنوية يدرج في الآبار التي تحتوي على نسيج اللوحة العازلة الثقافة وchemoatttractant pipetted بعناية في قاع بئر حيث يجتمع الكلمة الجدار (انظر الشكل 1). بعد الحضانة ، وإدراج الأعلى التي تحتوي على خزان الحيوانات المنوية هو بعناية صتتم إزالة emoved ، والحيوانات المنوية في الغرفة السفلى التي مرت عبر الغشاء ، مكعبات وعدها ثم عدادة الكريات أو تدفق عداد الكريات.

وتعقب الحيوانات المنوية مقايسة يستخدم غرفة زيجموند وضعت أصلا لمراقبة الكيميائي العدلة وتعديلها لمراقبة الحيوانات المنوية التي Giojalas وزملاء العمل ^2،3. غرفة تتكون من شريحة زجاجية سميكة في التي تم تشكيله two أحواض العمودي. يتم فصل هذه عن طريق منصة المراقبة 1 مم واسعة. بعد أن يتم تحميل التطبيق من الحيوانات المنوية الغطاء ، والزجاج في واحدة الحوض الصغير ، وتصور عامل جاذب كيميائي في غيرها من الحيوانات المنوية والحركة الفردية عن طريق الفحص المجهري الفيديو. ومن ثم تحليلها لقطات الفيديو باستخدام البرنامج لتحديد تحركات خلية ثنائي الأبعاد في الطائرة س ص بوصفها وظيفة من الوقت (xyt مجموعات البيانات) التي تشكل مسار كل الحيوانات المنوية.

Protocol

1. المواد المستخدمة ومخازن

1. الاحتياطي رينغر البويضة ل(1.5 × OR2) يحتوي على 124 ملي كلوريد الصوديوم ، 3.75 ملي بوكل ، 1.5 ملي CaCl ₂ ، 1.5 ملم MgCl ₂ ، 1.5 مم نا ₂ هبو ₄ ، 10 Hepes مم ، الحموضة 7.8 درجة. الاحتياطي الإخصاب (F - 1) يحتوي على 41.25 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.25 ملي بوكل ، 0.25 ملي CaCl ₂ ، 0.06 MgCl مم ₂ ، و 0.5 ملي نا ₂ هبو ₄ ، 2.5 ملي Hepes ، ودرجة الحموضة 7.8 درجة.
2. مستعدة القيطم المياه البيض المورق وفقا سوغيياما وآخرون. ^4. ووصف فترة وجيزة ، ولدت حديثا ملتف هلامي بيض الضفادع في حجم صغير من F - 1 العازلة لمدة 30 دقيقة والمتوسطة مكيفة micropipette تحذف من قبل. ويمكن أيضا هذه الوسيلة ، ووصف "المياه البيض" ، يمكن استخدامها لإعداد allurin المنقى ، وجاذب كيميائي الأساسية في هذا استخراج الهلام. ويتم الحصول على الحيوانات المنوية من المورق القيطم تربيتها تجاريا أو القيطم مداري.
3. انظر جدول المواد للبنود المحددة المطلوبة في رانه مقايسة.

2. ومقايسة من مجلسين للالكيميائي الحيوانات المنوية الضفدع

1. تخدير الضفادع عن طريق الغمر في الماء الذي يحتوي على 0.07 ٪ بنزوكاين ، قطع رأس باستخدام مقص ارتفع السامور ، وباب مزدوج لضمان القتل الرحيم. قطع الجلد في منطقة البطن لفضح العضلات. إجراء تخفيضات في خط الوسط والجانبية وسحب عضلات البطن. سحب بلطف الأمعاء والدهون للكشف عن البيض ، والفاصوليا على شكل الخصيتين. تقليم بعيدا النسيج الضام باستخدام مقص غرامة الحرص على تجنب الأوعية الدموية. إزالة الخصية ، أي يغسل الدم باستخدام 1.5 × OR2 العازلة ، ثم لفة الخصية على الورق مرشح لإزالة الفائض عازلة والأوعية الدموية الصغيرة ملتصقة ، ثم ضع الخصية في صحن PITRE البلاستيكية في 0.2 مل من 1.5 العازلة OR2 س. ملء محقنة 5 مل مع 2 مل من 1.5 العازلة OR2 س ، كزة برفق 10-20 ثقوب في الخصية على معظم السطح في نهاية واحدة ، أدخل الإبرة في نهاية المقابلة وحقن العازلة بلطف لاخراج الحيوانات المنوية. بدلا من ذلك ، واحدويمكن حقن العازلة بينما بدس الثقوب خروج لاخراج الحيوانات المنوية. نقل تعليق الحيوانات المنوية باستخدام micropipette مع طرف قطع (تجنب القص من الحيوانات المنوية) إلى أنبوب microcentrifuge ومكان على الجليد.
2. تقدير عدد الحيوانات المنوية التي حصلت عليها الضفدع تمييع 1:100 الحيوانات المنوية في 1.5 x أو - 2 وأخذ عينة من 20 ميكروليتر تعليق الحيوانات المنوية المختلطة وحساب عدد الخلايا باستخدام وعدادة الكريات كبيرة مساحتها ² 1 ملم. باستخدام عدد ونسبة العينات عدادة الكريات حساب كثافة الحيوانات المنوية ومجموع عدد الحيوانات المنوية المقطوع. هذا المجموع هو عادة 2-6 × 10 ⁷ الحيوانات المنوية في حجم حوالي 2 مل عند استخدام كلا الخصيتين. تمييع تعليق الحيوانات المنوية الأسهم مع 1.5 العازلة OR2 X للحصول على كثافة الحيوانات المنوية من 2 × 10 ⁷ / مل. استخدام الحيوانات المنوية للمقايسة في حدود 2 إلى 3 ساعات من التحضير. تقييم الحيوانات المنوية على الحركة من خلال تمييع 5 ميكرولتر من 1:10 الحيوانات المنوية مع F - 1 العازلة وتصور الحركة باستخدام البصريات النقيض من المرحلة. لا يقل عن 40 ٪ إلى 50 ٪ من الحيوانات المنويةوينبغي متحركة. وحتى الاستعدادات مناسبة تحتوي على عدد كبير من الحيوانات المنوية immotile معظمها غير ناضجة.
3. يعد جيدا الجديدة 24 لوحة من البلاستيك زراعة الأنسجة التي micropipetting 700 ميكرولتر من F1 العازلة في كل بئر. وينبغي أن يكون كل بئر حوالي 15 مليمتر في القطر في الأسفل.
4. بدء سلسلة من المقايسات التي تمييع 100 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية مع 900 ميكرولتر من F1 عازلة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 21 إلى 23 درجة مئوية) في أنبوب microcentrifuge لتنشيط الحيوانات المنوية على الحركة بواسطة صدمة التناضحي. يتم تنشيط الحيوانات المنوية كل مرة جديدة بهذه الطريقة ، يجب أن تستخدم الحيوانات المنوية في غضون 1-2 دقائق.
5. وضع 12 ميكرون المسامية إدراج (12 مم OD) في منطقة عازلة مملوءة جيدا ، تأكد من إدراج التنسيب هو خارج الوسط تاركا مساحة لجانب واحد. نقل على الفور 400 ميكرولتر من الحيوانات المنوية في تنشيط حركية جيدا من قبل وجود طرف micropipette قطع. تطبيق تعليق الحيوانات المنوية في جدار إدراج مرشح والسماح لها لتشغيل يسقط على تصفية في الجزء السفلي من اله إدراج ، وينبغي ألا تكون الحيوانات المنوية تعليق pipetted مباشرة على تصفية.
6. بعناية micropipette 50 ميكرولتر من عامل جاذب كيميائي في البئر في المسافة بين البئر وإدراج خارج مركز التصفية. يجب على المرء أن يكون حريصا على ودائع الانخفاض حيث الجانب وقاع البئر يجتمع وسحب ماصة مع أي اضطراب في النظام. على وجه التحديد ، ينبغي دفع المكبس على micropipette فقط إلى المحطة الأولى وذلك لإخراج العينة تماما ولكن لا فقاعات الهواء.
7. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 أعلاه لبدء فحوصات عديدة وحسب الحاجة ، ثم لوحة احتضان حتى بدأت أول تجربة والمحتضنة 50 دقيقة. عادة ، يمكن للمرء بدء فحص كل 45 ثانية إلى 60. علما بأن الفحص يمكن تبسيطها من قبل شخص من ذوي الخبرة أو من قبل اثنين من الأشخاص الذين يعملون معا. وتستخدم دائما في هذه الحالة ، يمكن البدء في واحد أو صفين من المقايسات مع أكبر مخزون من الحيوانات المنوية متحركة وأسرع pipetting تنص على أن الحيوانات المنوية في حدود 1 إلى 2 دقيقة منالتنشيط.
8. وقف كل مقايسة في التسلسل بدأت. أولا ، ثابتة بعناية إدراج مرشح بيد واحدة مع الآخر وإزالة بعناية معظم أو كل تعليق الحيوانات المنوية في الغرفة العليا من قبل micropipette أو عن طريق الشفط مع ماصة باستور. على الفور ، وذلك باستخدام ملاقط غرامة ، وسحب وتجاهل إدراج مرشح. يجب توخي الحذر في هذه الخطوة ، على الأقل يكون اجتاحت الحيوانات المنوية المتبقية من خلال تصفية artifactually رفع قيم مرور الحيوانات المنوية.
9. من جانب كل لوحة ، ونقل الحيوانات المنوية وقف كامل للأنبوب microcentrifuge. من المهم أن مزيج تعليق الحيوانات المنوية في البئر قبل انسحابها منذ الحيوانات المنوية تميل إلى تترسب في القاع. اضافة 15 ميكرولتر من الفورمالدهايد 25 ٪ إلى التركيز النهائي 0.5 ٪ V / V والثلاجة إذا لم يتم القيام به في عدد الحيوانات المنوية في نفس اليوم.
10. بيليه الحيوانات المنوية في كل أنبوب 10 باستخدام الزر حملة ثانية تدور على microcentrifuge الشخصية وجود سرعة قصوى تصل إلى 2000 × ز إزالة كافة ولكن 100 ميكرولتر من supernatالنمل من كل أنبوب ، ثم resuspend بيليه في هذا الحجم. يستغرق 20 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية ، وتمييع 01:10 بالماء المقطر ، وعدد الحيوانات المنوية على عدادة الكريات به هدفا 40X على المجهر تستقيم. استخدام التهم وعوامل التخفيف لحساب مجموع عدد الحيوانات المنوية التي تم تمريرها من خلال تصفية في كل فحص.

3. مقايسة الضفدع تعقب الحيوانات المنوية باستخدام غرفة زيجموند

1. تعد محطة العمل المجهر المقلوب للتصوير بالفيديو. نستخدم Elipse نيكون TE300 المجهر المقلوب مجهزة إما DXC - 390 كاميرا سوني اللون 3 شرائح الفيديو التناظرية أو ORCA - 03G هاماماتسو كاميرا رقمية أحادية اللون. يجب أن الشريحة غرفة زيجموند باقي على المسرح حتى من جانب إلى أسفل مع فتح في لوحة كافية لاستيعاب المرحلة غطاء 22x40 ملم الزجاج. واستلزم هذا الترتيب من خلال حقيقة أن الحيوانات المنوية غير قادرة على الضفدع تسبح ضد الجاذبية. اما تركيز عدسة الهدف 4X 10X أو على منصة المراقبة تشغيل بين البلدينأجران.
2. اختبار للتأكد من أن تركز الكاميرا وتركزت على منصة المراقبة. إذا تم استخدام كاميرا سوني ، يتم إرسال الإخراج إلى شاشة فيديو ومحول A / D (الإطار المختطف) قادرة على رقمنة 7 لقطة في الثانية من إشارة الفيديو. يتم معالجة تيار الرقمية باستخدام الكمبيوتر على التوالي في 3 غيغاهرتز أو أكثر ويفضل مع 4 غيغابايت أو أكثر من ذاكرة الوصول العشوائي. على الرغم من أننا استخدام البرمجيات المطعوم صورة (نسخة ويندوز مخصصة لصورة NIH) التي تسيطر على CG - 7 المطعوم المختطف الإطار ، وهذه المنتجات لم تعد متوفرة. والحل الحالي هو استخدام البرمجيات J صورة مع فيرتوالدوب بلج في لالتقاط الفيديو التناظرية الكاميرا. إذا تم استخدام الكاميرا هاماماتسو ، تتم معالجة انتاجها بواسطة برنامج cellSens الرقمية أوليمبوس وعرضها على شاشة الكمبيوتر. في كلتا الحالتين ، يتم حفظ البيانات على القرص الثابت إما داخلية أو خارجية باعتبارها كومة TIFF 8 بت. استخدام البرمجيات صورة المطعوم يتطلب تحويل تسلسل الصور المشاجرة إلى كومة باستخدام صورة J.
ينبغي الحقل المجهري تشمل معظم أو كل منصة عرض الملاحظة. استخدام التباين مرحلة أو مجال البصريات المظلمة للحصول على أفضل النتائج. وينبغي أن المسافة بين سطح منصة المراقبة والجزء السفلي من الزجاج تغطي 15 إلى 20 ميكرون على النحو الذي تحدده الفرق التي تركز على كل سطح.
3. إعداد جاذب كيميائي في تركيز المناسب في المخزن F1. اعداد الحيوانات المنوية القيطم المورق كما هو موضح سابقا وتخزينها في المخزن OR2 1.5 X على الجليد حتى الاستخدام.
4. غرفة تجميع زيجموند. تبدأ الغرفة نظيفة جافة. به مكانا micropipette خط زيت السيليكون (4 ميكرولتر) حوالي 5 ملم من وبالتوازي مع الحافة الخارجية من كل حوض. وضع غطاء 22x40 ملم على زجاج غرفة السماح للزيت السيليكون لنشر بالتساوي على الحافة الخارجية من كل حوض. إذا تبين أن التجارب الأولية الشائكة الحيوانات المنوية هو المشكلة ، قد لا يحتاج المرء إلى معطف زجاج مع تغطية النيتروسليلوز كما اقترح آخرون فابرو ^3. Alternatively ، يمكن إدراج البروتين في مخازن المستخدمة (BSA على سبيل المثال 1 ٪) أيضا تقليل التصاق الحيوانات المنوية.
5. عكس الغرفة وعلى مدى انقطاع التعميم في المرحلة المجهر الحرص على أن تغطي الزجاج لا يجعل الاتصال مع المرحلة. هذا التكوين المقلوب هو ضروري لتحقيق القيطم الحيوانات المنوية من الحضيض الى المنصة. بخلاف الحيوانات المنوية لدى الثدييات ، القيطم الحيوانات المنوية ليست قوية بما فيه الكفاية لتسبح ضد الجاذبية للوصول إلى المنصة.
6. تفعيل 20 ميكرولتر من الحيوانات المنوية في 1.5 القيطم العازلة OR2 س 01:10 بواسطة الاختلاط مع F1 عازلة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام micropipette مع طرف قص ، ونقل على الفور 70 ميكرولتر من حركية تنشيط الحيوانات المنوية في الحوض الصغير. ويتحقق ذلك من خلال عقد micropipette بزاوية منخفضة ووضع طرف في افتتاح الجانب من الحوض الصغير. تعليق طرد خلية يملأ الحوض الصغير والجسر العمل الشعري. المقبل ، وملء الحوض العكس بنفس الطريقة باستخدام حل chemoatttractant.
7. بدء تصوير بالفيديو في غضون 3 دقائق (القيطم الحيوانات المنوية لديها القدرة على الحركة محدودة مدى الحياة) وتستمر لمدة 5 دقائق. في نهاية تصوير بالفيديو ، بتفكيكها الغرفة وغسل وأحواض منصة المراقبة مع ضغط تيار من الماء ثم الايثانول من زجاجة بخ. إزالة زيت السيليكون من السطوح العليا مع مناديل الورق والحرص على عدم تلويث منصة المراقبة وهبوطا.
8. إذا لزم الأمر ، لتحويل البيانات الفيديو التي تم التقاطها لتسلسل الصور TIFF أو المكدس باستخدام صورة البرنامج J. ثم فتح الملف في صورة وياء في الإطارات ال 21 الأولى (3 ثوان) اختيار ما يصل إلى 50 في الحيوانات المنوية لتعقبها. لتفادي التحيز ، اختار الحيوانات المنوية من جميع المناطق في مجال المراقبة ودون معرفة بيانات مسارها. القبض على خلية مسارات ثنائية الأبعاد في الطائرة س ص بوصفها وظيفة من الوقت (xyt مجموعات البيانات) لكل الحيوانات المنوية بمقدار نقطة وانقر على الماوس باستخدام المكونات في وحدة لمسارات MtrackJ صورة تصور وحساب مسار J.المسافات والسرعات ومكونات المحور داخل MtrackJ. بدلا من ذلك ، القيام بهذه العمليات ومزيد من التحليل العددي (مثل الاتجاهية المعلمات الكيميائي ، ورسوم بيانية المعلمة) عن طريق استيراد البيانات إلى Excel xyt مجموعات مايكروسوفت.
9. مسارات مؤامرة لكل الحيوانات المنوية في Excel لاكتشاف الأنماط العامة للحركة بما في ذلك الأنماط ، وخطي منحني الأضلاع ، والتعميم فضلا عن ميزات مثل المنعطفات. استخدام البيانات xyt مجموعات لحساب سرعة انحنائي المتوسط ​​، السفر صافي على طول X (الانحدار) -- و ص المحور ، والمعلمات التوجيه مثل زاوية المتوسط ​​للسفر بالنسبة للمحور التدرج.

4. ممثل النتائج :

معلمات فنية هامة في غرفة الفحص هما حجم وشكل الغرفة ، ومسامية الغشاء ، وطول الحضانة. وينبغي أن حجم الغرفة العليا عقد الحيوانات المنوية لا تكون كبيرة جدا في قطر ، مما يتطلب كمية كبيرة من الحيوانات المنوية (قبلferably 0.5 مل أو أقل) لا ينبغي للغرفة العليا تكون عميقة وذلك لإنشاء عمود عالية من التعليق الخلية (<1 سم). وينبغي أن حجم العازلة المحيطة النواب إدراج الغرفة العليا تتطابق تماما على مستوى الخلية في التعليق حتى لا تضاف إلى خلق الضغط الهيدروليكي عبر الغشاء الذي سيجبر artifactually الحيوانات المنوية من خلال الغشاء. التنسيب لإدراج فارغة في قاع البئر الأول ، تليها نتائج تحميل الحيوانات المنوية في الضغط الهيدروستاتيكي الأولية صعودا يمنع الحيوانات المنوية من المرور عبر الغشاء أثناء التحميل. ويتحدد اختيار حجم مسام الغشاء حسب حجم الحيوانات المنوية ، وتوافر التجارية لإدراج غشاء يسهل اختراقها. نجد أن المقايسات مع الحيوانات المنوية الضفدع يمكن الاستفادة إما 8 أو 12 مسام قطرها 12 ميكرومتر ميكرومتر على الرغم من المسام توفير مرور أعداد أكبر من الحيوانات المنوية السماح العد أكثر دقة. أحجام مسام أكبر من 12 ميكرومتر لا يبدو أن تكون متاحة تجاريا. بديل لاستخدام TIإدراج الثقافة ssue هو استخدام الأغشية Neuroprobe مصممة لفحوصات الكيميائي في 96 - جيدا لوحات. هذه تقترح زيادة الإنتاجية ، ويحتمل أن تكون مجموعة واسعة من أقطار المسام. على الرغم من الحيوانات المنوية أكبر الثدييات يبدو أنها تتطلب قطرها أكبر المسام ، وقد نجحنا في يعاير الكيميائي الحيوانات المنوية باستخدام الماوس يدرج مع 12 ميكرون المسامات (بورنيت ، والملاحظات غير منشورة). في المقابل ، قد يكون أصغر حجما المسام الكافية لصغار الحيوانات المنوية (مثل قنفذ البحر) على الرغم من أننا لم تختبر حتى الآن هذه الإمكانية.

عيب واحد للفحص من مجلسين صفها هو أن توضع الحيوانات المنوية في الغرفة أعلى مما سيؤدي حتما في بعض مرور الحيوانات المنوية عن طريق الجاذبية ، مما أدى إلى خفض نسبة إشارة إلى الخلفية. واستلزم هذا من حقيقة أن القيطم الحيوانات المنوية ليست قوية بما فيه الكفاية في حراك على السباحة ضد الجاذبية كما هي الحيوانات المنوية لدى الثدييات. صعوبة أخرى في يعاير القيطم الحيوانات المنوية هو حقيقة أن هذه الحركية لIFE الوقت قصير -- 5 إلى 15 دقيقة بعد التنشيط. هذا القيد هو الأساس لتنشيط الحاجة إلى دفعة جديدة من الحيوانات المنوية كل دقيقة 2-3 عند إجراء فحوصات متعددة. نتيجة لذلك ، وقد أظهرت الدراسات أن مرور الوقت بالطبع معظم الحيوانات المنوية يحدث في غضون الدقائق ال 20 الاولى من مقايسة ^5. على الرغم من أننا استخدام فترة الحضانة لمدة 50 دقيقة ، يمكن أن من المرجح أن تكون هذه الفترة قلل إلى 20 أو 30 دقيقة. في المقابل ، عن الماوس الحيوانات المنوية التي لا تزال متحركة لساعات ، وقد استخدمنا لمدة تصل إلى 2 ساعة من الفحص مع نتائج جيدة (بورنيت ، والملاحظات غير منشورة).

في مقايسة من مجلسين باستخدام الحيوانات المنوية الضفدع ، فإن العدد الإجمالي للمرور الحيوانات المنوية من خلال غشاء مسامي عادة 1-20 أو حوالي 1 إلى 2 ٪ من السائل المنوي وضعها في إدراج مجلس الشيوخ. يمكن وجود التدرج جاذب كيميائي في مجلس النواب زيادة مرور الحيوانات المنوية بقدر 4-10 أضعاف. الشكل 2 يوضح منحنى الاستجابة للجرعة نموذجية مع إجراء هذا الاختبار. وextrوانصب عمل القيطم البيض هلام ("بيضة المياه") الذي يحتوي على بروتين يعرف allurin جاذب كيميائي (الدوائر الحمراء) ، في غرفة أسفل في سلسلة من التخفيفات. وبالنظر إلى مجموع المياه البيض البروتين الواردة في كل مقايسة في ميكروغرام / مقايسة -- تسليم المبلغ في حجم الأصلي 50 ميكرولتر. منذ تسليم البروتين ستشكل التدرج نشرها ، ولا يعرف مدى تركيز الفعلية من البروتين الذي لرد على الحيوانات المنوية ولكن يمكن تقدير أن 5 إلى 10 مرات أقل من تركيز البروتين من الانخفاض تسليمها. لهذا السبب ، فإننا دلالة على كمية البروتين وعرض ، وليس التركيز. وعادة ما نقوم المقايسات مكررة أو ثلاث نسخ عن كل جرعة ومتوسط ​​النتيجة ، ونحن بعد ذلك تكرار التجربة بأكملها 3 أو 4 مرات استخدام الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة في كل تجربة. ويتم احتساب الخطأ الحسابي والمعياري للمتوسط ​​عن كل جرعة مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​يجري عادة 5 إلى 10 ٪ من المتوسط. علما أن البروتينات دون كنوقد سفل نشاط جاذب كيميائي مثل المصل البقري (الدوائر المفتوحة ، الشكل 2) إنتاج ألبومين منخفضة المستوى ، وزيادة غير محددة في مرور الحيوانات المنوية من خلال الغشاء. ملاحظة مثيرة للاهتمام هو أن منحنى الاستجابة للجرعة للمياه البيض المتعدد المراحل -- مرحلة الارتفاع ومرحلة التناقص. هذا النوع من العلاقة متعدد الأطوار الشائع لchemoattractants الحيوانات المنوية ، واستجابة الحيوانات المنوية البشرية إلى السائل الجريبي معارض مماثلة ⁶ علاقة ثنائية الطور التي يعتقد أن تكون مفيدة في تركيزات عالية من جاذب كيميائي وجدت في محيط البويضة قد تؤدي إلى مزيد من ردود تقلل البحث على جزء من الحيوانات المنوية.

أحيانا نجد أن القيم لمراقبة هذا الاختبار هي أعلى من المعتاد ، وبالتالي تقليل الزيادة أضعاف تنتجها جاذب كيميائي. عادة ، يمكن أن يعزى هذا إلى اضطراب الميكانيكية لإدراج مرشح خلال الفحص. وبالتالي ، فمن المهم أن لا يتم إدراج بالانزعاج أثناء تحميل الحيوانات المنوية أو تشيmoattractant خلال مقايسة حضانة أو عند إزالة إدراج. حاسم على وجه الخصوص هو أن تتم إزالة خزان الحيوانات المنوية في إدراج بواسطة micropipette أو الشفط قبل رفع إدراج من البئر. هذا يضمن أن الحيوانات المنوية لا اكتسحت غشاء مسامي إلى غرفة أسفل كما هو إزالة إدراج.

معلمات فنية هامة في غرفة الفحص زيجموند تشمل المسافة بين منصة ساترة والمراقبة ، والتكبير من المراقبة بالفيديو ، ونوع من البصريات المستخدمة ، ومعدل الإطار. المسافة بين منصة المراقبة عادة 10-15 ميكرومتر يمكن أن تختلف على الرغم من أن هذه المسافة بمقدار زيت السيليكون المستخدمة في واجهة زجاجية بين الغطاء والشريحة غرفة -- لمزيد من النفط ، وزيادة المسافة. طائرة رقيقة من السائل يزيد من مقدار الوقت اللازم لتشكيل التدرج فضلا عن طول العمر التدرج تشكلت مرة واحدة. والطائرة من السائل سمكا يسمح ز أكثر سرعةتشكيل radient لكن التدرج وأقصر مدة وأقل الاستقرار. ويمكن لديناميات تشكيل التدرج يمكن تصور باستخدام صبغة الفلورسنت أو ديكستران فلوري في جاذب كيميائي جيدا وباستخدام المجهر مضان لعرض ديناميكية. وينبغي أن تكون مطابقة للكاشف الاختبار في الوزن الجزيئي للجاذب كيميائي المستخدمة وتحديد استخدام ديناميكية للحكم على مدى عدة دقائق وينبغي أن يسمح لتكوين التدرج وتسجيل تحركات الحيوانات المنوية.

يجب أن تكون منخفضة التكبير المستخدمة (الهدف 4X أو 10X) عموما اذا منصة المراقبة بأكملها هو أن تكون كما تصور في ظروف مقايسة التي وصفناها. من ناحية أخرى ، قد التكبير العالي (63x 40x او الهدف) أن تكون مفيدة إذا كان أحد ينوي رصد مسار شرائح قصيرة نسبيا أو يرغب في حل الاقتراحات سوطي. ويمكن القيام بها إما عن طريق تتبع شبه دليل طرق كما هو موضح في هذه الورقة ، أو عن طريق تتبع الآلي كما يمارس في أكثر سوبحزم البرمجيات مثل histicated MetaMorph أو المسار Imaris. في كلتا الحالتين ، وسهولة تعقب يعتمد جدا على النقيض من الصورة سواء كان ذلك من قبل مشغل أو من قبل البرامج التي تتلقى مساعدة من التعرف على الأشياء. على الرغم من أن يمكن أن تستخدم البصريات مجال مشرق في بعض الحالات ، واستخدام البصريات أو العكس المرحلة هو مطلوب عموما الساحة المظلمة البصريات. أخيرا ، معدل الإطار يتوقف على قرار في الوقت المطلوب التعقب. إذا تم استخدام أساليب شبه اليدوي كما هو الحال في إجراءاتنا ، يقتصر على الارجح واحدة لمعدل الإطار منخفضة نسبيا -- 4-8 إطارات في الثانية الواحدة -- نظرا لطبيعة العمل المكثف لتسجيل البيانات. من ناحية أخرى ، قد يكون مطلوبا الملاحظات معدل الفيديو لاستجابات سريعة مثل النماذج موجة سوطي. في كثير من الأحيان ، يتم تقديم أفضل أهداف تجريبية عن طريق القيام بتجارب أبطأ معدل الإطار التجارب وأسرع معدل الإطار بشكل منفصل منذ عام واحد كما يرغب في تغيير معلمات أخرى مثل التكبير ، والبصريات ، أو معالجة الصور الرقمية.

نتائج نموذجية للZigmond مقايسة تتبع غرفة تتكون من مجموعة من المسارات ، مثل تلك التي ظهرت على الحيوانات المنوية الضفدع الخمسين في الفيديو كليب من فيلم 1. ضد صورة من منصة المراقبة ، وتتبع المسارات الفردية في الحيوانات المنوية الحمراء لتجربة التحكم (أي التدرج الحالي جاذب كيميائي). يمكن رسم مسارات خلية ثنائي الأبعاد في الطائرة س ص بوصفها وظيفة من الوقت لكل الحيوانات المنوية وتم تسجيلها بواسطة MtrackJ والمستوردة إلى Excel مايكروسوفت. لتحليل المسار ، علينا أن نؤسس محور التدرج جاذب كيميائي ومحور X ومحور Y - كمحور متعامد ، بما يتسق مع الاتفاقية وضعت أصلا من قبل فابرو وآخرون. ^3. كما هو مبين في الرسم البياني في الشكل 3 ، ويتألف المسار الفعلي من الخطوات المتخذة ، من مجموع طوله يساوي المسافة انحنائي سافر في مسار (أزرق / سهام الذهب). المسافة الصافية والتوجه للسفر من قبل كل الحيوانات المنوية هو متجه ربط النقطة الأولى والأخيرة من مسار (السهم الأحمر القطري). وويمكن تقسيم السفر إلى صافي مكون المحور السيني والمحور Y المكون (السهام الحمراء متقطع ، كما وصف صافي دلتا دلتا وصافي X Y ، على التوالي).

لأن الكيميائي في الحيوانات المنوية يمكن أن تنطوي على الفقاريات تحولات خفية نسبيا في اتجاه السفر ، وأعداد كبيرة من الحيوانات المنوية (100 إلى 300) ، تم اختيارها عشوائيا ، وعادة ما يتم تحليل كل حالة تتطلب في كثير من الأحيان البيانات المجمعة 4-6 التجارب المستقلة. لأغراض التوضيح ، ومع ذلك ، سوف نستخدم البيانات من الحيوانات المنوية الضفدع خمسين فقط. ويوضح الجدول 1 المعلمات الشائعة المستخدمة للكشف عن تغيرات في سفر الحيوانات المنوية. سوف يسافر يعني صافي على طول محور X زيادة كبيرة ، إذا وجود جاذب كيميائي ، والحيوانات المنوية السكان ككل يلي المسارات التي تتلاءم مع أوثق التدرج. في مثالنا ، وزيادة متوسط ​​صافي المحور السيني السفر أكثر من ثلاثة أضعاف في وجود الماء البيض. يمكن للمرء أن المؤامرة أيضا الرسم البياني للسفر المحور السيني الصافية للسكان الحيوانات المنوية الذي يمضي المئوية التي قد يتم الكشف عن مجموعات سكانية فرعية أصغر من الحيوانات المنوية استجابة. يمكن معلمتين التي وضعتها وآخرون فابرو ^3. بن تساعد أيضا في الكشف عن هؤلاء السكان. كلا من نسبة الحيوانات المنوية تظهر إيجابية صافية المحور السيني السفر (٪ ΔX> 0) ونسبة الحيوانات المنوية تظهر السفر خطية الصافي لا يزيد عن 45 درجة من المحور التدرج (٪ ΔX / | ΔY |> 1) يمكن أن تزيد بشكل كبير إذا السكان الحيوانات المنوية كلها حساسة للجاذب كيميائي أو كميات صغيرة ولكنها مهمة لا تزال في حالة المجموعات السكانية الفرعية من الحيوانات المنوية حساسة. في مثالنا ويبين الجدول 1 الزيادات في كل من المعلمات من أجل الحيوانات المنوية الضفدع fifty تتعرض لبيضة التدرج المياه. علما بأن عشوائي غير المنحى الحركة ستعطي صفرية قيم كل من هذه المعايير من 50 ٪ و 25 ٪ على التوالي ، والقيم تحكم أعلى من ذلك (مثل تلك الموجودة في الجدول رقم 1) تمثل الخلفية إما بسبب انخفاض عدد العينات أو إلى وجود تحيز في اتجاه الحيوانات المنوية خاص لتصميم تجريبي.

محتوى "ويمكن> اتجاهية الحيوانات المنوية السفر استجابة لعوامل جاذب كيميائي المقررة مباشرة ثيتا ، الزاوية بين متجه السفر الصافية لكل الحيوانات المنوية والتدرج (X) المحور. دينا المثال في الجدول 1 يبين أن يعني انخفاض ثيتا للسباحة الحيوانات المنوية في البويضة التدرج المياه مشيرا إلى أنه تم تنسيق أفضل المسارات الحيوانات المنوية ويبلغ عدد سكانها مع التدرج. مماثلة للسفر المحور السيني صافي (انظر أعلاه) ، يمكن التعبير عن thetas للسكان وتوزيع الحيوانات المنوية ، وهو نهج حساسة أيضا لمجموعات سكانية فرعية من الحيوانات المنوية وتستجيب تلك التي كانت درست مؤخرا Gakamsky ⁷ آخرون.

أخيرا ، يمكن أيضا سرعات منحنية ولحظية ليكون الفرد الحيوانات المنوية المستخرجة من بيانات تصف المسارات خلية ثنائي الأبعاد في الطائرة س ص بوصفها وظيفة من الزمن. يمكن للمرء أن يجد أن هناك زيادة في السرعة ، فضلا عن تحول في اتجاه السفر ، مما يوحي بذلك ردا منشط كيميائي وكذلكردا الكيميائي.

هذه البيانات تمثل نقطة انطلاق لتحليل مسارات الحيوانات المنوية. ويمكن إجراء مزيد من التحليل وتشمل قياسات وانحناء المسار الخطي على أساس لحظة لحظة ونفذتها بومر وآخرون ⁽⁸⁾ وشبعا وآخرون. ⁹ ، والكشف الآلي للتشغيل والتي تقوم بها بورنيت وآخرون ¹⁰ ، واستقامة و يقاس من خلال تحليل كسورية ^11،12. شريطة أن يتم رصد هذه المسارات الحيوانات المنوية السباحة في تضخم أعلى ، يمكن للمرء أن الاقتراحات أيضا سوطي صورة حقيقية وإشارات الكالسيوم الوقت نفذت حسب العديد من المختبرات ^{8،9،13،14،15،16.} وقد أظهرت هذه الدراسات أن كلا من اللافقاريات والحيوانات المنوية لدى الثدييات التي تستجيب لchemoattractants المنعطفات الحادة من الحيوانات المنوية يصل الانحدار نحو مصدر جاذب كيميائي. ويرافق هذه الانحناءات التي تتحول سوطي التي تغير اتجاه الحيوانات المنوية بقدر ما هو الدفة و، والانحناءات التي تظهر في تعريف بمبادرة من موجة لى ،إشارات الكالسيوم من خلال نشر كه السوط. وبالتالي ، فإن الهدف النهائي المتمثل في تعقب الحيوانات المنوية هو إشارة لربط النظام مع التغيرات الديناميكية في الدفع سوطي التي تخدم كأساس للتوجه الحيوانات المنوية في الانحدار الكيميائي. هذه الأهداف حتى الآن لم يتم التوصل في الحيوانات المنوية التي القيطم السفر في حركة حلزونية ¹⁷ ، المعرض انحناء منخفضة في مساراتها ¹⁰ ، والإشارات التي الكالسيوم لم يتم رصدها.

على الرغم من أن نركز هنا على تفاصيل الأساليب التي نستخدمها لفحص الحيوانات المنوية القيطم المورق ، فإن كلا من الحيوانات المنوية غرفة two مقايسة التراكم ويمكن استخدامها لتتبع غرفة لفحص الحيوانات المنوية زيجموند الثدييات إذا تم إجراء بعض التعديلات. ويمكن القيام بها في كل من المقايسات 37 درجة مئوية إذا كان المطلوب ، من خلال استخدام أكثر دفئا والشرائح ، في غرفة الفحص زيجموند ، مرحلة المجهر أكثر دفئا. عادة ، سيتم عزل الحيوانات المنوية لدى الثدييات ، وحضنت باكتسابها باستخدام مخازن الثدييات رصد مبلغسوف chemoattractants د ، ولكن تحليل البيانات تكون مشابهة لما هو موضح هنا للأنواع البرمائيات. فارق واحد هو زيادة التي يتم وضعها عادة في غرفة زيجموند تستقيم على مرحلة مجهر تستقيم منذ الثدييات الحيوانات المنوية ، على عكس الحيوانات المنوية القيطم ، يمكن السباحة حتى على منصة المراقبة. كما لم تختبر حتى الآن ، قد تكون هذه المقايسات two انظر إلى الحيوانات المنوية تطبيق عدد من الأنواع في العمل في المستقبل.

الشكل 1. رسم تخطيطي للمقايسة من مجلسين. توضع الحيوانات المنوية في الجزء السفلي من ادخال وهو مرشح البولي مع مسام ميكرون 12. هو pipetted بعناية حل جاذب كيميائي في البئر لبدء تشكيل التدرج التركيز.

بيانات الممثل الشكل 2. عن الحيوانات المنوية باستخدام الضفادع من مجلسين chemotaxi الحيوانات المنويةق مقايسة. المياه المعدة من البيض X. المعارض البيض المورق متعدد المراحل جرعة النشاط المنحنى الذي هو سمة من chemoattractants الحيوانات المنوية. المصل البقري يزيد من الحيوانات المنوية الألبومين مرور قليلا فقط -- له تأثير غير محدد من البروتين. تعديل الرقم من العنزي وتشاندلر ^5.

فيلم 1. رسم مقطع فيديو يظهر مسارات الحيوانات المنوية في أحمر الضفدع على منصة المراقبة في غرفة زيجموند. عرض النظام الأساسي هو 1 ملم. انقر هنا لمشاهدة الفيديو كليب.

يتم رسم المحور الاتفاقيات الرقم 3. ، مسار منحني الأضلاع الحيوانات المنوية ومتجه للسفر خطي الصافي على الملاحظة زيجموند منصة القاعة. البيانات التي تم الحصول عليها هي من ثلاثة أنواع. أولا ، لا يمكن للمسارات الحيوانات المنوية نفسها (زرقاء / سهام الذهب) تكشف عن أنماط معينة سوالفصل كدوائر ويتحول (النجمة). ويمكن قياس المسافة المنحنية والسرعات منحنية المسار مسار. الثانية ، والمسافة الخطية صافي سافر عبر مسار كامل ، فإن صافي X مكون المحور (التدرج) من السفر ، ويمكن حساب المحور Y صافي مكون من السفر وثيتا الزاوية بين محور X وناقلات السفر الصافية لكل مسار وبالمقارنة مع توزيع على جميع الحيوانات المنوية مجنزرة. ويمكن دراسة ثالثة ، والتغيرات في سرعة لحظية واتجاه لقطاعات السفر ضمن المسارات الفردية سواء بشكل فردي أو مجموعة من السكان. أعلاه ، يتم تقديم عرض جانب من الغرفة في رسم تخطيطي.

الجدول 1. المعلمات التي يكثر استخدامها في تحليل البيانات من الغرفة زيجموند.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تم العثور الكيميائي للخلايا تتحرك إما عن طريق الحركة أو السباحة amoeboid سياط بالطاقة البيولوجية في سياقات كثيرة ، ودراسة هذه الظاهرة يتطلب توافر فحوصات عملية وموثوق بها. بعض الأمثلة على هذه الظاهرة ، مثل انجذاب الحيوانات المنوية للبويضة قنفذ البحر أو جمع خلايا العفن ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم السلعة	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
24 كذلك لوحات	بيكتون ديكنسون ،	35/1147
إدراج 12 ملم القطر الخارجي مع غشاء 12 ميكرومتر مسام	ميليبور	PIXP01250	كنا سابقا Costar - كورنينج transwell وحة # 3403 - توقفت الآن
زيجموند الغرفة	Neuroprobe	Z02
سيليكون النفط	جنرال الكتريك	SF1154	أي ما يعادل 550 السوائل داو كورنينج
صورة J البرمجيات	اين Rasband والبحوث فرع خدمات ، المعهد الوطني للصحة العقلية	تحميل مجانا في http://rsbweb.nih.gov/ij	جافا البرنامج الذي يعمل على ويندوز ، ولينUX و Mac
MtrackJ البرمجيات	إريك Meijering / Imagescience / فريق التصوير الطبي الحيوي ، ايراسموس MC -- المركز الطبي في جامعة روتردام	تحميل مجانا في http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	جافا البرنامج الذي يعمل على ويندوز ، لينوكس وماك
الظاهري لقب البرمجيات	جنو العمومية العامة المرخصة البرمجيات	تنزيل مجانا عبر http://www.virtualdub.org/index.html	تعليمات الإعداد في صورة الموقع تحت الإضافات J ؛ لنظام التشغيل Windows فقط
cellSens البرمجيات	اوليمبوس	انظر الموقع : http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp؟ المنتج = 1070	الضوابط ويكتسب الصور من مجموعة متنوعة من الكاميرات. كما قدرة معالجة الصور