قياس γHV68 العدوى في الفئران

Summary

γ - Herpesviruses (γ - HVS) وضع الثبات مدى الحياة في البلدان المضيفة لهم. إصابة الفئران مع γ - HV68 يوفر لين العريكة وراثيا في الجسم الحي نموذج للتوصيف دورة / γHVs المرضية. يصف هذا بروتوكول الكشف والكميات من γHV68 العدوى الحادة في المراحل التالية ، وكامن العدوى عن طريق المركز ، لتشكيل لوحة المعدية ، والمقايسات qPCR.

Abstract

γ - Herpesviruses (γ - HVS) جديرة بالملاحظة لقدرتها على إقامة العدوى الكامنة من الخلايا اللمفاوية ^1. وقد أعاق مجموعة ضيقة من المضيف الإنسان HVS - γ ، مثل EBV وKSHV ، شديدة الإمراض دراسات مفصلة. فأري γ - هربس 68 (γHV68) سهم واسعة الشبه الجينية والبيولوجية مع الانسان γ - HVS والممرض الطبيعية من القوارض مريد ^2. مثل تقييم γHV68 العدوى الفطرية سلالات من الفئران في مراحل مختلفة من العدوى الفيروسية يقدم نموذجا هاما لفهم دورة الحياة الفيروسية والمرضية خلال γ - HVS العدوى.

عند التلقيح داخل الأنف ، ونتائج الإصابة γHV68 في viremia الحادة في الرئة التي يتم حلها في وقت لاحق الى عدوى الكامنة splenocytes والخلايا الأخرى ، والتي يمكن تنشيطها في جميع أنحاء الحياة من ^3،4 المضيف. في هذا البروتوكول ، فإننا سوف تصف كيفية استخدام لوحة فحص لتقييمق عيار الفيروس المعدية في الرئة الخليط على monolayers فيرو الخلية في مرحلة مبكرة (5 -- 7 أيام) من الأنف بعد الإصابة (نقطة في البوصة). بينما يتم مسح العدوى الحادة إلى حد كبير 2 -- 3 أسابيع بعد العدوى ، عدوى الكامنة γHV68 يتم تأسيس حوالي 14 نقطة في البوصة وصيانتها لاحقا في الطحال من الفئران. العدوى الكامنة عادة ما يصيب السكان صغيرة جدا من الخلايا في الأنسجة المصابة ، بحيث يبقى الفيروس نائمة ويغلق معظم التعبير الجيني لها. splenocytes خفية المصابة تنشيط الفيروس تلقائيا عند explanting في زراعة الأنسجة ، والتي يمكن تلخيصها من قبل مقايسة المعدية (IC) مركز لتحديد الحمولة الفيروسية الكامنة. لمزيد من تقدير كمية من النسخ في الجينوم الفيروسي الحاد و / أو الأنسجة المصابة خفية ، PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) يستخدم لحساسيتها ودقتها القصوى. فإن التحليلات المشتركة لنتائج الفحص qPCR والبلاك ، و / أو مقايسة IC تكشف ملامح من spatiotemporal الفيروسيةالتكرار والعدوى في الجسم الحي.

Protocol

وبروتوكول التالية تصف دراسة الفيروسات والتتر الأحمال الجينوم الفيروسي في دورة العدوى الكامنة وlytic γHV68 في الفئران ، والتي يمكن نظريا أن تستخدم لتقييم العدوى عن طريق الفيروسات الأخرى تقاسم حياة مماثلة لتلك التي γHV68.

1. التضخيم من γHV68

1. ذوبان الجليد قارورة المجمدة للγHV68 في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. إضافة إلى اللقاح الفيروسي NIH3T12 أو 3T3 ثقافة خلية (~ 50 ٪ confluency) في أطباق 10 سم والثقافة الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ _2.
3. دراسة الثقافة من خلال الفحص المجهري للتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) ، وجمع وسائل الاعلام في وقت أكبر من 80 ٪ من الخلايا تظهر CPE 4 ~ 5 أيام بعد الإصابة. لتعظيم العائد من الفيروس ، ويمكن للثقافة أن تكون الخلية المصابة والمجمدة ، المذوبة مرتين لإطلاق سراح جميع الخلايا المرتبطة γHV68.
4. الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لإزالة الحطام الخلية.
5. نقل بعناية supernatants لأنابيب جديدة (عالية السرعة أنبوب الطرد المركزي) دون لمس حطام خلية في القاع.
6. عالية السرعة الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (للSorvall SA - 600) في 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 1.5 ساعة لتركيز الجسيمات الفيروسية.
7. تجاهل supernatants الى حل التبييض 10γ بعناية وإعادة تعليق بيليه (فيروس والحطام المتبقي خلية) مع DMEM المصل خالية 1ml. نقل بيليه إعادة علقت في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل ومزيج جيد من قبل vortexing.
8. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة على السرعة القصوى لإزالة بقايا حطام خلية ونقل طاف (الأسهم الفيروس) إلى أنبوب جديد. هذا هو المخزون النهائي للعدوى الفيروسية. يتم تحديد المخزون من عيار الفيروس عن طريق فحص اللوحة (انظر أدناه).

2. العدوى من الأنف مع الفئران γHV68

1. تصيب الفئران في 6 أسابيع من العمر ~ ~ 5000 مع 1000 لوحة لتشكيل وحدات (PFU) من الفئران γHV68 الواحد.
2. خدرالفئران عن طريق الحقن الكيتامين / زيلازين (60 ميكروليتر / الماوس من مزيج من الكيتامين ملغ / مل 80 و 12 زيلازين ملغ / مل) في التجويف البريتوني. رصد التخدير بواسطة معسر إصبع القدم الفئران. وعادة ما يستغرق ~ 5-10 دقيقة. إذا لم يتم تخدير الفئران تماما ، وسوف يعطس الفيروس.
3. عند الفأر هو تخدير كامل ، واستخدام ماصة لتطعيم ~ 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يتضمن γHV68 (15 ميكرولتر في كل منخر) على الفئران انخفاض تلو الانخفاض ببطء ولكن بثبات. تأكد من أن الفأر هو في الواقع استنشاق قطرات دون محاولة لتشكيل فقاعات.
4. السماح الماوس لاستعادة لمدة 10-15 دقيقة ورصد رفاهية الفئران (على سبيل المثال وعيه ، والتنفس ، الخ) قبل إعادتها إلى القفص. ويتم فحص الحيوانات اليومية للمرض وكفاية الغذاء والماء ، وظروف الأسرة. إذا العلامات السريرية للألم أو المرض أو الشدة تطوير ، سيتم إجراء التشخيص الروتيني لتحديد المسببات. سيتم تسجيل الحيوانات التي تفقد أكثر من 20 ٪ من وزن الجسم لفقدان الوزن الأقصىوالموت الرحيم. القرار النهائي لتنفيذ القتل الرحيم هو في تقدير الطبيب البيطري السريري ويتم بعد التشاور مع الباحث الرئيسي.

3. لوحة الفحص لتحديد العيار الحجمي الفيروسات المصابة بشدة في الرئتين

1. ويتم تحديد التتر العدوى الفيروس عن طريق تشكيل لوحة من الخلايا على monolayers فيرو.
2. والمصنف في الخلايا خلايا فيرو 2.5x10 ⁴ / 12 بشكل جيد في لوحات جيدا قبل يوم من فحص اللوحة. يجب أن تكون موزعة بالتساوي الخلايا والخلايا ينبغي أن تصل كثافة 30 -- في يوم مقايسة البلاك بنسبة 40 ٪.
3. إعداد 0.5 ٪ (ث / ت) methylcellulose المتوسطة تراكب (MC) (الجدول 1).
4. التضحية γHV68 الفئران المصابة 5-7 أيام بعد الإصابة الأنف لتحديد فيروس التتر في المرحلة الحادة في الرئتين. سيكون لeuthanization الكيتامين حمض الهيدروكلوريك (80-100 ملغم / كغم SC ، IM ، والملكية الفكرية) أن تدار من قبل اتباع IM جرعة زائدة من الوريد بنتوباربيتال نا (IP ملغ / كلغ 30-50). تمت الموافقة على هذا الأسلوب من قبل رإنه الأمريكي للطب البيطري.
5. حصاد الرئتين وشطف مرتين مع PBS × 1 لإزالة خلايا الدم. جمع من جانب واحد في الرئتين في 1 مل من الجليد الباردة المتوسطة DMEM كاملة والحفاظ على الجليد. تجميد بسرعة في الجانب الآخر من الرئتين وتخزينها عند درجة -80 لفحص الحمض النووي الفيروسي الأحمال في الرئتين بواسطة qPCR (انظر أدناه).
6. استخدام الخالط الأنسجة لأنسجة الرئة التجانس بأقصى سرعة لمدة 1 ثانية ، وتجميد والذوبان ، ثلاث مرات. غسل الخالط مع الايثانول 70 ٪ في كل خطوة عند تغيير العينة.
7. النسيج المتجانس للطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. طاف جمع ونقل إلى أنابيب جديدة لفحص اللوحة.
8. تحضير التخفيفات التسلسلية (عادة من 10 درجة الى 10 ^-8) من عينات الرئة جناسة 1.5 في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة مل مع DMEM عادي من قبل دوامة. ملء مسبق العدد المناسب من الأنابيب مع DMEM 540 ميكروليتر وتمييع جناسة 60 ميكرولتر في الأنبوب الأول. نقل 60 ميكرولتر من الأنبوب الأول طلا احد المقبل ، وهلم جرا.
9. نضح في وسائل الاعلام من monolayers فيرو أعد في لوحات ال 12 جيدا وتحميل 200 ميكروليتر / جناسة جيدا المخفف متسلسل تحتوي على فيروسات المعدية في ترتيب عكسي (من ^-8 الى 10 ° 10). استخدام بئرين لكل المعايرة (في نسختين).
10. احتضان خلايا فيرو ساعة مع فيروس اللقاح 1 إلى 37 درجة مئوية. دوامة بلطف لوحات كل 15 دقيقة لتوزيع متساو للفيروس خلال أحادي الطبقة.
11. إزالة اللقاح واستبدالها 2 مل / بكثير من المتوسط ​​تراكب (الجدول 1). احتضان لوحات لمدة أسبوع عند 37 درجة مئوية.
12. إزالة المتوسطة تراكب (لا يحتاج إلى أن يكون كاملا) واستبدالها مع الإصلاح / متوسطة صمة مقايسة لوحة (الجدول 1) ، واحتضان ما لا يقل عن 1 ساعة على RT.
13. عندما يتم تجفيفها لوحات ، وحساب عدد معزولة جيدا في كل لويحات التخفيف. للتقليل من الخطأ ، وتحسب فقط الآبار التي تحتوي على ما بين 10 و 100 لويحات.
14. حساب عيار الفيروس باستخدام فولو فوتبال شيالجناح الصيغة : عيار (pfu / مل) = [(عدد لويحات / جيد) / (حجم اللقاح / جيد)] عامل تخفيف س.

4. مركز الفحص المعدية لتحديد تحميل الفيروس في Splenocytes المصابة خفية

1. يتم تحديد الحمولة الفيروسية المعدية التي كامنة مقايسة (IC) في مركز أحادي الطبقة من الخلايا فيرو. قبل يوم من الخلايا مقايسة IC البذور ، فيرو في 6 جيدا لوحات (1 -- 2.5 X 10 ⁵ خلية / جيدا ونحن عادة استخدام 11 بئرا لكل عينة الطحال ، وسيتم استخدام 10 بئرا لتعليق splenocytes المخفف متسلسل واحد جيدا للاختبار العفوية تنشيط الفيروس بعد تجميد أذاب دورات.
2. التضحية الفئران المصابة بعد تأسيس الكمون (12 -- 14 يوما بعد الإصابة). حصاد الطحال الماوس وتجمع لهم في DMEM 1 مل مبردة.
3. تفارق الميكانيكية للطحال الفأر. نقل الطحال الماوس المعزولة حديثا في لوحة 10 سم وإضافة 10 مل من المتوسط ​​المطلوب مثل DMEM مع FBS 2 ٪. الرطب two متجمد الزجاج نهاية microscمكتب مستشار رئيس الوزراء الشرائح مع الثلج الباردة المتوسط. مكان الطحال في الجانب متجمد من شريحة واحدة ونيك الكبسولة مع حافة نهاية متجمد من الشريحة الأخرى. فصل ميكانيكيا بين شريحتين الطحال حتى يتم سحق جميع كتل حمراء (أيضا إزالة جزيئات الدهون إذا كان موجودا).
4. شطف الشرائح مع DMEM لاسترداد الخلايا المتبقية على كل الشرائح.
5. نقل الأنسجة تعليق كامل بلطف من خلال مصفاة الخلية (40 ميكرومتر شبكة النايلون) في أنبوب المسمار سقف مخروطي 50 مل. غسل الطبق 10 سم تحتوي على الخليط مع PBS الطحال ونقل 10 مل في حين التصفية.
6. الطرد المركزي وحيد الخلية تعليق 10 دقيقة في 375 XG وتجاهل طاف. نفض الغبار الكريات خلية لتفتيت كتل الخلايا الموجودة. أضف 5 مل ACK العازلة (الجدول 1) إلى ليز خلايا الدم الحمراء. احتضان 5 دقائق ومرة ​​أخرى في أجهزة الطرد المركزي ز س 375
7. تجاهل طاف واعادة تعليق الكريات ، وبدقة ، ولكن بلطف ، في برنامج تلفزيوني مع 2 ٪ FBS. إبقاء الخلايا في 4 درجات مئوية. استخدام ماصة للإزالة الأنقاض ، إن وجدت. عدد خلايا قابلة للحياة الخلية باستخدام عداد التلقائي (بيو راد).
8. تدور باستمرار splenocytes PBS ، معلق في 375 x ج لمدة 4 دقائق. وطاف تجاهل resuspend الخلايا في DMEM مل 4 كاملة (سيتم استخدام 2 × 1 مل للمقايسة IC للتعليق الأصلي ؛ 0.6 مل تستخدم للتخفيف من خمسة أضعاف التسلسلي في مقايسة IC ؛ 0.4 مل لإعداد الحمض النووي الفيروسي وqPCR ، وسيتم استخدام نظام التعليق 1 مل لتقييم تنشيط عفوية من الفيروس كامنا بعد دورات تجميد أذاب ثلاثة)
9. يعد المسلسل خمسة أضعاف التخفيفات (أي 1 / 5 ، 25/01 ، 1 / ​​125 ، 1 / ​​250) من نظام التعليق في splenocytes التكرارات. ملء مسبق لأنابيب مخروطية 15 مل مع DMEM مل 2.4 و تمييع تعليق splenocytes 600 ميكروليتر في الأنبوب الأول ، ومزيج جيد. نقل 600 ميكرولتر من أنبوب إلى أنبوب السابقة المقبل ، وما إلى ذلك لا الدوامة!
10. نضح في المتوسط ​​من أحادي الطبقة 6 أيضا على استعداد للخلايا فيرو. البذور 1 مل من splenocytes بالتسلسل المخفف على خلايا فيرو مع كل dupl التخفيفicated (سيتم استخدام 10 بئرا لالتخفيفات 0 1 / 5 ، 25/01 ، 1 / ​​125 ، 1 / ​​250 ،).
11. احتضان لوحات 8-12 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2. لا تتجاوز 24 ساعة. نضح تعليق splenocytes المصنفة وتحميل 4 مل تراكب وسائل الاعلام (الجدول 1) إلى كل بئر. لاحتضان 6 أيام إضافية.
12. تحديد مستويات مراكز الطحال المعدية تلوين لوحات مع 0.2 ٪ (W / V) وضوح الشمس فوق البنفسجية على النحو المبين في مقايسة البلاك.

5. الكمي لالجينوم الفيروسي

1. مجموع استخراج الحمض النووي من الأنسجة الجينومية γHV68 المصابة ، مثل سرطان الرئة وعينات الطحال في هذه التجربة. استخدام الدم DNeasy وكيت الأنسجة (Qiagen) ، في أعقاب البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
2. تحديد تركيز الحمض النووي لكل عينة لضمان نفس الكمية من الحمض النووي التي تستخدم لفحص qPCR. تصميم الفيروس محددة الاشعال (يفضل ~ amplicon غليان 200 لمقايسة qPCR). استخدمنا γHV68 ORF56 محددة الاشعال (التمهيدي إلى الأمام : 5 و العلاقات العامةIME ؛ -- GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC -- 3 '؛ التمهيدي عكس : 5' - CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG - 3') لهذا الاختبار وβ - الأكتين الاشعال (مهاجم التمهيدي : "عكس التمهيدي : 5' - gtgaggatcttcatgaggtagtc - 3' 5' - cacccacactgtggcccatcat - 3) على النحو سيطرة للتفاعل qPCR.
3. خلط عينة من الحمض النووي (100 -- 500 نانوغرام جيدة) والشعائل المناسبة مع 2 × مزيج الرئيسي SYBR (بيو راد قريش SYBR Supermix الخضراء). استخدام نظام بيو راد PCR الوقت الحقيقي لقياس العبء الفيروسي في الأنسجة المصابة. PCR في تنفيذ الشرط التالي : 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة و 45 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها تحليلات منحنى ذوبان ، على حد سواء والفيروسية amplicons الأكتين.
4. لجعل منحنى القياسية لتقدير حجم الجينوم الفيروسي ، وتمييع متسلسل كميات معروفة من الحمض النووي γHV68 bacmid مع الحمض النووي الجيني معزولة من خلايا مصابة. تشغيل qPCR بالتوازي مع السلطات الوطنية المعينة التي تم استردادها من العدوىتيد الأنسجة باستخدام مجموعات من نفس الفيروس محددة الاشعال.
5. عرض تحميل الجينوم الفيروسي في الأنسجة والحمض النووي الفيروسي في عدد النسخ لكل وحدة (مثلا 100 نانوغرام أو نانوغرام 500) من الحمض النووي الجينوم بعد تطبيع الأكتين.

6. ممثل النتائج :

الشكل 1 يصور المخطط الشامل للتجارب لقياس γHV68 العدوى في الفئران في الجسم الحي. وقد أظهرت نتائج ممثل التتر فيروس في الرئتين خلال العدوى الحادة γHV68 ، على النحو الذي يحدده مقايسة لوحة ، في الشكل 2A. سلالة طافرة من γHV68 تحتوي على مواد غير وظيفية الفيروسي بي سي إل 2 (vBcl - 2) منسوخة على مستويات مماثلة لمن النوع البري γHV68 في الرئتين بعد 7 أيام من العدوى داخل الأنف BALB / ج الفئران (6 -- 7 الفئران في كل مجموعة). تم الكشف عن أية فروق ذات دلالة إحصائية في التتر الرئة من الفيروس بين مجموعتين. هذه البيانات تشير إلى أن vBcl - 2 ليس عاملا حاسما لالعدوى الحادة في γHV68الفئران. ومع ذلك ، قبل 28 يوما بعد العدوى ، انخفض من عيار vBcl 2 - الفيروس متحولة في الطحال 6 -- إلى 10 -- أضعاف مقارنة WT ، مقاسا مقايسة مركز المعدية (الشكل 2B) ، مما يوحي بأن vBcl - 2 متحولة γHV68 الفيروس هو عيب في صون الكمون الطحال بعد العدوى. في اتفاق مع التتر مركز المعدية مخفضة ، وخفض بشدة تحميل الجينوم الفيروسي لفيروس vBcl - 2 متحولة مقارنة بما كان عليه من الفيروسات WT في اليوم 28 في التجارب المتكررة ، كما هو مبين في الشكل 2C. الارتباط الوثيق بين الأحمال الجينوم الفيروسي وتواتر كامنة HV68vBcl - 2 - فيفو الفيروس متحولة السابقين في مرحلة إعادة تنشيط عدوى كامنة من الضوء على هذا الخلل كمون عدوى فيروس متحولة.

الشكل 1. رسم تخطيطي لقياس γHV68 العدوى في الفئران عن طريق تشكيل اللوحة ، ومركز الأمراض المعدية ، ومقايسة qPCRس.

الشكل 2. العدوى Lytic والكامنة للفيروسات γHV68 WT ومتحولة في الجسم الحي. تم تحديد تكرار الحاد (أ) من وزن ومتحولة vBcl - 2 الفيروسات γHV68 في الرئتين من الفئران BALB / ج ب 7 نقطة في البوصة (يوم آخر العدوى) عن طريق فحص اللوحة. (B و C) وقيست مراكز المعدية الطحال (B) والفيروسية تحميل الجينوم (C) في الطحال من الفئران المصابة عند 28 نقطة في البوصة من خلال مركز الفحص المعدية وqPCR ، على التوالي. خطوط حمراء ، ومتوسطات القيم المشار إليها. نانوثانية ، وليس كبيرا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد استخدمت على نطاق واسع γHV68 نموذجا لفهم المرضية ^2،4،5 γ - HVS الإنسان. في هذا البروتوكول ، وصفنا ثلاثة أساليب تستخدم بشكل روتيني ، بما في ذلك فحص لوحة عيار الفيروس المعدية ، IC مقايسة لتحميل الكامنة الفيروسية ، وqPCR لتحميل الجينوم الفيروسي ، لتقييم العدوى الحادة وا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم المادة	إعداد الإجراءات
Methylcellulose المتوسطة تراكب (MC) لفحص اللوحة الفيروسية	الحرارة تقريبا 250 مل من الماء المقطر في زجاجة TC ل> 80 درجة مئوية (المغلي لمدة 3 دقائق في الميكروويف) إضافة تدريجيا مسحوق MC 2.5 غرام في الماء الساخن ، واثارة على نار هادئة حتى المنحل. الأوتوكلاف على الفور لمدة 15 دقيقة في دورة السائل. تحريك تعقيمها وسائل الاعلام MC عند 4 درجات مئوية خلال الليل. الجمع بين وسائل الإعلام MC 250 مل مع 200ml 2 × MEM (Gibco - BRL) + 50 مل FBS لاعطاء وسائل الاعلام تراكب 500 مل.
إصلاح / وصمة عار لفحص اللوحة المتوسطة	0.2 ٪ (W / V) الكريستال البنفسجي في الايثانول 20 ٪.
ACK تحلل العازلة	NH 4 الكلورين 0.15M ، KHCO 3 10MM ، EDTA 0.1mM
إكمال DMEM	Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة(DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS ؛ Invitrogen) ، 2 مم L - الجلوتامين ، و 1 ٪ البنسلين ستربتومايسين (Gibco - BRL).

اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد
الكيتامين	سيغما الدريخ	K2753
زيلازين	سيغما الدريخ	X1251
Methylcellulose	سيغما الدريخ	M0512 - 250G
2 × MEM	الحياة تكنولوجيز	11935
خلية مصفاة	Faclon دينار بحريني	352340
اومني الأنسجة الخالط	OMNI الدولية	TH115
DNeasy الدم والأنسجة كيت	هيئة الاستثمار القطريةالجنرال	69504
iQTM SYBRH الخضراء Supermix	BioRad	170-8882
CFX96 نظام PCR الوقت الحقيقي	بيو راد	184-5072
خلية مكافحة	بيو راد	145-0001
Sorvall SA - 600	الحرارية العلمية	096-124022