الإنتاج الضخم ل Aedes aegypti المعدلة وراثيا للإصدارات الميدانية في البرازيل

Summary

لتحقيق قمع السكان من Aedes aegypti باستخدام نظام^{RIDL ®} (إطلاق الحشرات التي تحمل القاتل المهيمن) ، تحتاج إلى إطلاق أعداد كبيرة من البعوض الذكور. وهذا يتطلب استخدام تقنيات وتكنولوجيا تربية الكتلة لتوفير أنظمة موثوقة للحصول على أكبر عدد ممكن من البعوض الذكور عالية الجودة.

Abstract

ويجري السعي إلى تقنيات وأساليب جديدة في محاولة لكسب المعركة ضد البعوض. وقد أدت التطورات الأخيرة في التقنيات الجزيئية إلى تطوير أساليب جديدة ومبتكرة لمكافحة البعوض تقوم على تقنية الحشرات العقيمة (SIT)^1-3. أسلوب مكافحة المعروفة باسم RIDL (إطلاق الحشرات التي تحمل المهيمنة القاتلة)⁴، ويستند حول SIT ، ولكن يستخدم أساليب وراثية لإزالة الحاجة إلى التعقيم الإشعاعي^5-8. تم اختبار سلالة RIDL من Ae. aegypti بنجاح في الميدان في جزيرة كايمان الكبرى^9,10; ومن المقرر استخدام المزيد من الحقول أو يجري العمل في بلدان أخرى في جميع أنحاء العالم.

وقد تم إنشاء تربية جماعية للحشرات في العديد من أنواع الحشرات ومستويات المليارات في الأسبوع. ومع ذلك، في البعوض، تم إجراء التربية بشكل عام على نطاق أصغر بكثير، مع إجراء معظم التربية على نطاق واسع في السبعينيات والثمانينيات. لبرنامج RIDL من المستحسن الإفراج عن عدد قليل من الإناث ممكن لأنها لدغة ونقل المرض. في برنامج تربية جماعي هناك عدة مراحل لإنتاج الذكور ليتم إطلاقها: إنتاج البيض، وتربية البيض حتى pupation، ومن ثم فرز الذكور من الإناث قبل الإفراج عنهم. ثم يتم استخدام هذه الذكور لبرنامج التحكم RIDL، وأفرج عنه إما الخوادر أو البالغين^11،12.

لقمع السكان البعوض باستخدام RIDL عدد كبير من البالغين الذكور عالية الجودة تحتاج إلى^{تربية 13,14}. فيما يلي وصف لأساليب تربية كتلة OX513A، سلالة RIDL من Ae. aegypti ⁸، للإفراج عنها ويغطي التقنيات اللازمة لإنتاج البيض وتربية الذكور RIDL الشامل لبرنامج التحكم.

Introduction

ينقل البعوض العديد من مسببات الأمراض التي يمكن أن تسبب مجموعة من الأمراض في البشر ، وكانت السيطرة على هذه البعوض معركة مستمرة لعدة قرون. وقد حققت استراتيجيات مكافحة الحشرات القائمة على الأساليب الكيميائية والبيولوجية بعض النجاحات الملحوظة، ولكن في كثير من الحالات لم تكن المكافحة مستدامة على المدى الطويل. على سبيل المثال، حققت البرازيل القضاء على Ae. aegypti في الخمسينات ولكن البعوضة قد تكاثرت مرة أخرى على مدى السنوات ال 40-50 الماضية. ويمكن أن يعزى ذلك إلى العديد من الأسباب، بما في ذلك مقاومة المبيدات الحشرية، والأضرار البيئية، وسوء تنفيذ برنامج^{المكافحة 15-20،}وإعادة التغلغل السريع دون رصد أو استجابة كافية.

ويجري البحث عن تقنيات وأساليب جديدة في محاولة لكسب هذه المعركة ضد البعوض.  وقد أدت التطورات الأخيرة في التقنيات الجزيئية إلى تطوير أساليب جديدة ومبتكرة لمكافحة البعوض تقوم على تقنية الحشرات العقيمة (SIT)^1-3. تعتمد طريقة التحكم المعروفة باسم RIDL (إطلاق الحشرات التي تحمل قاتلة مهيمنة)⁴ على SIT ، ولكنها تستخدم أساليب جينية لإزالة الحاجة إلى التعقيم الإشعاعي. وقد تم بناء سلالات RIDL للعديد من أنواع الآفات بما في ذلك Ae. aegypti ^5-8، تم اختبار سلالة RIDL من Ae. aegypti بنجاح في هذا المجال في كايمان الكبرى^9،10؛ ومن المقرر استخدام المزيد من الحقول أو يجري العمل في بلدان أخرى في جميع أنحاء العالم.  قمع مجموعات البعوض باستخدام RIDL سيتطلب عددا كبيرا من البالغين الذكور عالية الجودة لتربية^3,14.

لبرنامج SIT يعتبر من المرغوب فيه للافراج عن الذكور فقط; البعوض الإناث لدغة ونقل المرض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون الذكور المعقمة المفرج عنها "مشتتة" من قبل الإناث المفرج عنهم مما يقلل من فعالية البرنامج. وقد تبين أن إطلاق سراح الذكور فقط لتكون 3-5 أضعاف أكثر فعالية من إطلاق سراح مختلط الجنس في التجارب الميدانية الكبيرة مع ذباب الفاكهة البحر الأبيض المتوسط^{المشعع 21}.

في برنامج تربية الكتلة RIDL، وهناك عدة مراحل لإنتاج الذكور للإفراج عنهم.  الأول هو إنتاج البيض المطلوب لتوليد الافراج (الشكل 1). المرحلة التالية هي تربية البيض إلى الخوادر أو البالغين ، وفصل اليرقات عن الخوادر والجرو الذكر من الخوادر الأنثوية. يتطلب الفصل الواسع النطاق بين الذكور والإناث فرقا بين الجنسين في مرحلة حياة معينة مناسبة لفرز الكتلة^22. في Ae. aegypti (وغيرها من أنواع البعوض) هناك فرق كبير في الحجم بين الخوادر الذكور والإناث التي يمكن استغلالها لتقنيات الفصل بين الجنسين. ثم يتم تحرير الذكور RIDL فرزها في برنامج التحكم إما الخوادر أو كبالغين^11,12.

فيما يلي وصف أساليب تربية كتلة OX513A، سلالة RIDL من Ae. Aegypti، للإفراج عنهم. وتغطي الأساليب الموصوفة التقنيات اللازمة لإنتاج البيض والذكور RIDL لبرنامج التحكم.

Protocol

متطلبات الحشرات

1. نظرة عامة

1. وتتميز التربية الجماعية بعدة مراحل، يتم تنفيذ كل منها في منطقة متميزة من وحدة تربية الكتلة. ويبين الشكل 1 المرحلة الرئيسية للتربية ومكان حدوثها في مرفق تربية الكتلة.

2. اعتبارات الأمن البيولوجي للحشرات

1. وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان من جامعة ساو باولو - البرازيل على المشروع، وتم الحصول على جميع التصاريح والموافقات اللازمة.
2. يستخدم نظام RIDL الفتك المشروط؛ مكمل غذائي (التتراسيكلين) يمنع التعبير عن نظام RIDL مما يسمح للحشرات بتربية جماعية؛ دون التتراسيكلين يموت البعوض. لا يوجد التتراسيكلين في مواقع تكاثر Ae. aegypti في البرية لذلك فإن أي ذرية تنتج من الهاربين لن تبقى على قيد الحياة.  وهذا يضيف مستوى إضافي من الأمن على استخدام الحشرات البرية (WT) المعقمة بطرق أخرى(أي الإشعاع).
3. استخدم الدخول المزدوج الباب وعلامات "الموظفين المعتمدين فقط" وشاشات الحشرات في الحشرات. يجب إغلاق أي نوافذ لتجنب تلوث المستعمرة بالحشرات WT والمساعدة في منع الهروب من داخل الحشرات.
4. قد يكون للأنظمة والسلطات المحلية متطلبات إضافية أو بديلة محددة. اتصل بالسلطات المختصة للحصول على معلومات / إرشادات في مرحلة مبكرة ، وتأمين جميع التصاريح والموافقات اللازمة قبل تحديد سلالة RIDL في حشرة.
5. يجب استخدام حشرة التربية الجماعية فقط لتربية RIDL. لا ينبغي أن تكون هناك سلالات أو حشرات أخرى. هذا هو لتجنب تلوث سلالة RIDL والتلوث مع مسببات الأمراض التي قد تؤثر على اللياقة البدنية والبقاء على قيد الحياة، والحد من إنتاجية وفعالية الذكور الصادرة.

3. تصميم حشري

1. ويبين الشكل 2 خطة للحشرة المستخدمة في بيوفاريكا موسكامايد في البرازيل.
2. وكانت درجة الحرارة في جميع الغرف 26 °C ± 2) مع الرطوبة النسبية ما يقرب من 70-80٪ و 12:12 ساعة ضوء: دورة الظلام باستخدام شرائط الضوء الفلوري.
3. ويمكن تعديل هذا المخطط وفقا لمتطلبات مساحة محددة، على سبيل المثال، سيحدد حجم الإصدار الحجم الإجمالي. ومع ذلك، ينبغي فصل إنتاج البيض، وتربية وفرز، ومراقبة الجودة (QC) والإصدارات إلى أربع مناطق متميزة: مستعمرة إنتاج البيض، وتوليد الإصدار، ومراقبة الجودة، وتخزين الكبار للإفراج عنهم.
4. تستخدم غرفة مستعمرة إنتاج البيض (حوالي 20 م²⁾لإنتاج البيض لتوليد الإفراج.
5. منطقة مراقبة الجودة هي المكان الذي تجرى فيه التجارب للتحقق من الإجراءات واللياقة البدنية لخط RIDL بما في ذلك قياسات معدل الفتحة ، وأرقام الخوادر ، وحجم الخوخ ، وقياس فعالية فرز وإزالة الإناث. كما تجرى اختبارات للتلوث ب WT من خلال التحقق من وجود علامة مضان ونمط افتراضي باستخدام مقايسات تعويضية تقيس الفتك.
6. غرفة توليد الإفراج (حوالي 36 م²⁾يتطلب مساحة كافية للصواني وفرز اليرقات والجراء. وتعقد الصواني في رفوف الألومنيوم بنيت لهذا الغرض. وهناك حاجة إلى منطقة عمل كبيرة وبالوعة للتربية والفرز، وهناك حاجة إلى بالوعة كبيرة أخرى لغسل الصواني والأقفاص. وقد أدرج مصيدة صيد مرشح في منفذ مياه الصرف الصحي من المصارف للتخفيف من هروب البعوض الحي عبر المجاري.
7. يتم التخلص من جميع المياه المستخدمة في الصواني من خلال استنزاف ، والذي يحتوي على مقصورة تحتوي على شبكة تمنع هروب الحشرات في أي مرحلة من مراحل التطور.
8. مطلوب منطقة لتخزين البالغين للافراج عنهم (تخزين الكبار للافراج عنهم، الشكل 2)تحتوي على الاجهاد لعقد أجهزة الإفراج في حين أن البالغين تنضج قبل الافراج عنهم.

طرق الإنتاج للتربية الشامل RIDL:

تنتج مستعمرة إنتاج البيض البيض الذي يستخدم في جيل الإصدار (الشكل 1) لإنتاج البالغين. هناك العديد من أوجه التشابه في طريقتي التربية ولكن أيضا بعض الاختلافات المتميزة. يتم وصف عمليات التربية التي هي نفسها لكلا الإجراءين في قسم مستعمرة إنتاج البيض فقط.

مستعمرة إنتاج البيض

4. إنتاج اليرقات

مستعمرة إنتاج البيض يولد homozygous OX513A RIDL البيض⁸ لجيل الإصدار. مراقبة الجودة العالية يضمن البقاء واللياقة البدنية وسلامة سلالة من البيض الموردة.

1. الحافز للفقس هو الغمر في الماء مع مستوى منخفض من الأكسجين الذائب. لتقليل مستوى الأكسجين في الماء، سخني الماء حتى يغلي وضعي فورا 400 مل في 500 مل من الجرار الزجاجية (محيط الفتح 74 مم)، واربطي الغطاء بشكل آمن واتركيه في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات ليبرد.
2. ضعي 1 غرام من البيض في جرة من الماء المغلي، وا reseal وانتظري لمدة ساعة. نقل محتويات إلى صينية مع الماء 2 لتر وترك بين عشية وضحاها في ظل ظروف حشرية.
3. ضع اليرقات المفقسة في حجم معروف من الماء وحرك باستخدام التحريك المغناطيسي والبراغيث لوقت كاف لأخذ اليكوتس؛ اثارة بقوة أو لفترة طويلة الأضرار اليرقات وينبغي أن تبقى إلى أدنى حد ممكن. الحجم القياسي المستخدم لتفقيس اليرقات هو 1 لتر ، ولكن الكثافات لأكثر من 300 يرقة / مل يصعب عدها وقد تكون ضارة. لذلك لا تفقس أكثر من حوالي 300،000 بيضة / لتر من الماء.
4. تحديد معدل الفتحة عن طريق اتخاذ ثلاثة 1 مل aliquots ووضع على ورقة ماصة، مع شبكة من 1 سم المربعات، على رأس اسفنجة ماصة لامتصاص أي المياه الزائدة.  عد عدد البيض المفقس وغير المفقس من ثلاثة مربعات من خلال البحث عن الغطاء المفقود للبيضة المفقسة. ومن المتوقع أن معدل فتحة حول 80-90٪.
5. خذ أربعة aliquots من 1 مل لكل منهما ووضعها في أربعة قوارب وزن سوداء (اليرقات بيضاء وبالتالي مرئية بسهولة أكبر على خلفية سوداء) وإحصاء عدد اليرقات الحية الموجودة بالعين؛ ينصح باستخدام عداد. ثم يتم استخدام متوسط عدد اليرقات لكل مل لحساب حجم الماء لإضافته على كل صينية للحصول على العدد المطلوب من اليرقات لكل صينية.
6. يمكن أن تكون هناك اختلافات كبيرة في الكثافة التي يمكن أن تربى فيها اليرقات بين السلالات والأنواع. ومن المستحسن أيضا لمقارنة RIDL حجم الذكور البالغين إلى الذكور نوع البرية; من الناحية المثالية تريد مماثلة لأكبر حجم RIDL الذكور التي يمكن أن تتنافس بنجاح مع الذكور البرية. لذلك لكل سلالة RIDL يجب تحديد الكثافة المثالية لليرقات وهي مقايضة ضد قيود المساحة للتربية وحجم الإنتاج. كثافات تتراوح بين 0.1-2.5 يرقة / مل وجدنا أن يكون مزيجا جيدا من إنتاج الإنتاج والجودة؛ كما ناقشها ميديشي²³.
7. أضف اليرقات إلى الصواني. في منشأتنا نستخدم صواني قياس حوالي 53 سم × 37 سم × 8 سم (L x W x H) والكمية المطلوبة من المياه لتحقيق كثافة اليرقات للإنتاج.
8. إضافة محلول الأسهم من التتراسيكلين (3 ملغ / مل في الماء) إلى الصواني في تخفيف 1:100 للحصول على التركيز النهائي المطلوب من 30 ميكروغرام / مل.
9. تغذية اليرقات مع تقشر الأسماك الغذاء(www.sera.de)يوميا، والتي تم سحقها إلى مسحوق ناعم. ويبين الجدول 1 نظام التغذية النموذجي في ملغ من الغذاء لكل يرقات يوميا. تغذية اليرقات حتى اليوم المناسب للفرز في ظل الظروف الحشرية المذكورة أعلاه.

5. فرز اليرقات من بوبا والجراء الذكور / الإناث

1. فرز اليرقات من الخوادر بعد 8 أيام من الفقس عن طريق فصل اليرقات عن الخوادر. ثم الجنس فرز الخوخ للذكور. يمكن للجهاز المعروف باسم فاصل اللوحة^24,25 فرز اليرقات من الخوادر الذكور ومن الخوادر الأنثوية. يوضح الشكل 3 استخدام فاصل اللوحة هذا لفصل اليرقات عن الذكور والإناث.
2. باستخدام ملعقة قياس مع شبكة في الجزء السفلي، ومعايرتها مع 500 pupae أو أكثر واستخدامها لإعداد أقفاص وتقدير المبلغ الإجمالي للذكور والإناث الخوخ المنتجة.
3. في اليوم الأول من الفرز (اليوم 8) معظم الخوادر هم من الذكور ، لذلك ضع اليرقات المفرزة مرة أخرى في صينية والخلفية حتى اليوم التالي عندما تكون معظم الخوادر من الإناث(الشكل 4).
4. كرر عملية الفرز كل يوم كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.3 حتى تكون جميع اليرقات قد تم تهاونها أو حتى نهاية أسبوع العمل.
5. ضع 1000 جرو ذكر (باستخدام ملعقة القياس) في قفص وفي اليوم 9 أضف 3000 جروة أنثى إلى نفس القفص (نستخدم أنابيب PVC عالية 30 سم وقطرها 30 سم مكيفة مع أعلى الشبكة وثقب وصول صافي ، ولكن 30 سم × 30 سم × 30 سم أقفاص بلاستيكية متاحة أيضا من BugDorm).
6. السماح للبالغين بالتزاوج لمدة يومين على الأقل وتزويدهم بمحلول السكروز (10٪) على القطن الرطب libitum الإعلانية قبل تغذية الدم. جمع البيض لمدة أسبوعين (~ دورتين gonotrophic) مع اثنين من الدم يغذي في الأسبوع. وينتج عن ذلك ما متوسطه 000 143 بيضة من قفص من 000 3 أنثى (بمعدل 48 بيضة/أنثى). لإنتاج 4 ملايين بيضة في الأسبوع حوالي 28 أقفاص تحتاج إلى إعداد كل أسبوع.

6. تغذية الدم

1. يزود نظام تغذية لوحة الألومنيوم الأقفاص بالدم مرتين في الأسبوع. يتم إنشاء جيب من الدم على جانب لوحة الألومنيوم (10 سم × 10 سم × 3 ملم) مع بارا فيلم(الشكل 5). لتشجيع التغذية، يتم تسخين الدم عن طريق وضع كيس فول ساخن فوق مغذي اللوحة. تتكون كيس الفاصوليا من حوالي 250 غرام من حبوب القمح في كيس من القماش ، والذي يتم تسخينه لمدة 10 ثوان في الميكروويف. الدم الذي نستخدمه للتغذية هو من مسلخ محلي. لأن هذه الحيوانات (الماعز والأغنام أساسا) للاستهلاك البشري يتم اختبارها لتجنب وجود مسببات الأمراض.
2. بعد ثلاثة أيام من تغذية الدم ، يتم توفير موقع oviposition للإناث لوضع بيضهن. موقع oviposition هو وعاء من البلاستيك مستديرة مليئة حوالي 1/4 مع الماء وورق التصفية التي تغطي الداخل. بعد يومين تتم إزالة موقع oviposition. لأقصى إنتاج للبيض، تأكد من أن ورق الفلتر يغطي كامل السطح المتاح داخل الحاوية ويبقى رطبا.
3. إزالة ورقة البيض ووضعها على الورق الماصة لتجف في ظل ظروف حشرية؛ البيض تتطلب فترة من تكييف في الرطوبة العالية (أكثر من 70٪) على الأقل 48 ساعة بعد أن وضعت. يمكن ترك البيض في الحشرات لمدة تصل إلى 3 أشهر مع الحد الأدنى من الانخفاض في معدل الفتحة ، طالما أن الرطوبة تبقى عالية^25.
4. يجب أن تكون مستعمرة إنتاج البيض بحجم كاف لتوفير عدد البيض المطلوب على أساس أسبوعي لبرنامج الإطلاق. يمكن للمنشأة المذكورة أعلاه إنتاج ما يقرب من 4 ملايين بيضة مع 28 قفصا يتم إعدادها أسبوعيا. فمن المستحسن للحفاظ على ما يكفي من البيض المخزنة لضمان ما لا يقل عن 4 أسابيع من البيض لتوليد الافراج عن والبيض مستعمرة الإنتاج.

إصدار الجيل

7. إنتاج اليرقات

عمليات الفقس والتربية والفرز لتوليد الإصدار متطابقة مع الطريقة الموصوفة سابقا لمستعمرة إنتاج البيض. ومع ذلك ، فإن حجم الإنتاج أكبر بكثير وهذا يتطلب المزيد من الصواني والمزيد من الجهد.

8. فرز اليرقات ، ذكر الجراء ، والجراء الإناث

1. إن فرز اليرقات والجراء الذكورية والجراء الأنثوية مطابق للطريقة الموصوفة لإنتاج البيض.
2. بعد فرز الخوادر الذكور من المهم التحقق من تلوث الإناث قبل الإفراج عنه. لا ينبغي أن يكون هناك أكثر من 1٪ الإناث الحاضر. خذ ثلاثة aliquots من 500 pupae (ثلاثة ملاعق قياس الخوانق عشوائي) وعدد من الخوادر الإناث الحاضر. يمكن التعرف على الإناث لأنها عموما أكبر من الذكور ومن الاختلافات في شكل الفص التناسلي (الشكل 6)²⁷. إذا كان هناك أكثر من 1٪ من الإناث يجب أن يلجأوا إليها وفحصها مرة أخرى.
3. استخدام الذكور فقط من اليوم 8 و 9 للإفراج عنهم. أوتوكلاف أي اليرقات المتبقية والجراء. وفي البرازيل، يجب معالجة هذه النفايات بنفس الطريقة التي تعامل بها النفايات الطبية، ولكن اللوائح قد تختلف في بلدان أخرى. لا تستخدم الخوادر واليرقات الأنثوية من جيل الإطلاق لمستعمرة إنتاج البيض بسبب الاختلافات في مراقبة الجودة والتربية ومخاطر التلوث من أعداد أكبر ، وانخفاض مراقبة الجودة.

تخزين الكبار للإفراج: ضع الذكور في أجهزة الإطلاق للظهور والنضج قبل الإصدار. لا يتم تغطية تفاصيل أجهزة الإصدار في هذا الأسلوب. ومع ذلك فإن قدرة أجهزة الإطلاق التي نستخدمها تبلغ حوالي 1000 ذكر. تفاصيل أسلوب الإصدار (جهاز الإصدار ونظام الإصدار) غير مشمولة في هذه الطريقة.

النتائج

تظهر نتائج الجراء المتوقعة للإنتاج في الشكل 4. الذكور pupate الأولى ، وبلغت ذروتها في اليوم 8 والإناث الذروة في اليوم 9 بعد الفقس. من المهم قياس منحنى الجرو هذا لمعرفة أفضل وقت لفرز الذكور من الإناث.

تظهر نتائج أكثر من 6 أشهر من فرز الخوادر الذكور والإناث أن تلوث الإناث في المتوسط هو 0.02٪(الشكل 5؛ SEM = 0.004٪). ويمثل معدل التلوث هذا 400 أنثى فقط تطلق على مدى شهر واحد من الإطلاقات (حوالي مليوني ذكر). ويبلغ الإنتاج الحالي للبيض في الأسبوع 4 ملايين بيضة. من هذه، 3.5 مليون فقست لمستعمرة البيض والإنتاج مع ما تبقى المخزنة للنسخ الاحتياطي. يستخدم ما يقرب من 11٪ من البيض في مستعمرة إنتاج البيض والباقي لتوليد الإفراج. معدل فقس البيض يبلغ 87.3٪ (SEM = 0.5٪) ويبلغ متوسط إنتاج الخوادر الذكور من يرقات L1 29.5٪ (SEM = 1.2). يتم تربية مليوني يرقة كل أسبوع لمستعمرة جيل الإطلاق التي تنتج حوالي 571,000 جرو ذكر (SEM = 14,000). يبلغ متوسط وفيات الجراء والبالغين أثناء الظهور والإطلاق 5٪، مما أدى إلى إطلاق ما يقرب من 543,000 (SEM = 13,000) بعوض ذكور بالغ أسبوعيا. ومن المتوقع أن يتم تخفيض الإنتاج الحالي من 4 ملايين بيضة في الأسبوع إلى ~ 3 ملايين / أسبوع مع مزيد من التحسين للحد من الخسارة من الهدر والتخزين. في المجموع هناك حاجة إلى 6 موظفين للإنتاج الموصوفة؛ أربعة يعملون على توليد الإفراج واثنين المتبقية على مستعمرة البيض.

مراقبة الجودة

مراقبة الجودة أمر ضروري للحفاظ على جودة البالغين، وكفاءة التربية والعمالة والتكاليف.

التحكم في النمط الظاهري Transgene

من أجل التحقق من التعبير الجيني RIDL يتم تنفيذ عنصري تحكم، أولا للتحقق من التعبير عن علامة الفلورية وثانيا للتحقق من التعبير عن سمة الفتك RIDL في غياب التتراسيكلين. يجب أن تعبر جميع اليرقات عن علامة الفلورسنت. للتحقق مما إذا كان يتم التعبير عن علامة الفلورسنت كما هو متوقع ، يتم فحص 2000 يرقات نجمة أولى تحت منظار مجسم MZFLIII لايكا مع فلتر DsRed2 (تكساس ريد) لتحديد ما إذا كان هناك أي أفراد غير فلووريسين. دون التتراسيكلين يتم التعبير عن الجين RIDL ونتوقع 3-4٪ البقاء على قيد الحياة للبالغين⁸. للتحقق من ذلك، يتم إعداد درج إضافي لكل دفعة إصدار بدون التتراسيكلين. الفرق الوحيد للتربية الطبيعية هو أن الطعام ينخفض بنسبة 2/3 من اليوم السادس لأن تراكم الطعام الزائد بسبب اليرقات الميتة يمكن أن يؤدي إلى نمو بكتيري زائد.

التحكم في التربية

يتم اختيار أربع صواني من جيل الإصدار بشكل عشوائي ليتم فرزها والعد بشكل منفصل. يتم تسجيل عدد الخوادر الذكور والإناث من كل صينية كل يوم (الشكل 4). أي انحراف عن العدد المتوقع من الذكور والإناث يشير إلى مشكلة محتملة يمكن أن تؤثر على الإنتاج و / أو اللياقة البدنية ويمكن مقارنتها بمستعمرة البيض للمساعدة في تحديد مصدر المشاكل.

قياسات بوبا

وقد تبين أن حجم Pupae ترتبط مع حجم الكبار²⁸. كتحكم في الجودة لحجم الكبار يتم قياس عرض السيفالوثوراكس من 30 على الأقل من الخوادر الذكور لكل يوم فرز من جيل الإصدار. للبيض إنتاج مستعمرة أنثى الخوادر أيضا تقاس. وكان متوسط عرض السيفالوثوراكس 1.05 مم (SEM 0.005) للذكور المفرج عنهم و 1.04 مم (SEM = 0.006) و 1.29 مم (SEM = 0.006) للذكور والإناث على التوالي إنتاج البيض، مستعمرة؛ تم الحصول على نتائج مماثلة ل Ae. albopictus تربية كتلة²⁴.

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 مراحل بعوض تربية جماعية للاستخدام في برنامج RIDL/SIT. تتمتع مستعمرة إنتاج البيض بمستوى عال من مراقبة الجودة لضمان جودة البيض المقدم إلى جيل الإطلاق.  يتم تربية البيض من خلال إلى الخوادر في مستعمرة الإفراج، حيث يتم فرز الذكور من الإناث.  ثم يتم استخدام البالغين الذكور لبرنامج التحكم RIDL.

الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم التخطيطي لمنشأة التربية لإنتاج الذكور RIDL لبرنامج الافراج عنهم. يتم إنتاج البيض عالي الجودة باستمرار في غرفة مستعمرة إنتاج البيض ثم يتم تربيته حتى الخوخ في غرفة جيل الإصدار. ثم يتم فصل اليرقات والجراء وفرز الجنس الخوادر للذكور. ثم يتم وضع الذكور في أجهزة الإفراج ويسمح لها أن تنضج للبالغين للإفراج عنهم في غرفة التخزين والإفراج عن البالغين. 

الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن فصل اليرقات ، الخوادر الذكور ، والجراء الإناث باستخدام فاصل لوحة²⁶.  يستخدم فاصل اللوحة الفرق في الحجم بين اليرقات والجراء الذكورية والجراء الأنثوية لفرز هذه المراحل الحياتية الثلاث المختلفة؛ تميل اليرقات إلى أن تكون أصغر من الخوادر الذكور التي هي بدورها أصغر من الخوادر الأنثوية.  وتتألف الأداة من لوحتين زجاجيتين؛ يتم إصلاح واحد إلى إطار معدني مائل والآخر يجلس على رأس اللوحة الأولى ويمكن نقلها بالنسبة إلى الأول باستخدام أربعة مسامير التكيف (أ).  مسامير التكيف الأربعة تسمح للوح الخارجي أن يتم تعيين في زاوية إلى لوحة الظهر بحيث يتم تشكيل مساحة إسفين على شكل بين لوحات، مستدق إلى أسفل.  يتم صب اليرقات والجراء بين الصفائح الزجاجية(B)وغسلها بلطف باستخدام خرطوم المياه(C).  عن طريق ضبط زاوية لوحة، يمكن فصل اليرقات، الخوادر الذكور والجراء الإناث (D).  مع التنظيف المستمر وزيادة زاوية اللوحة يمكن مسح اليرقات من خلال أولا (إلى منخل) ، تليها الخوادر الذكور وأخيرا الخوادر الأنثوية. 

الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال منحنيات Pupation لكتلة تربى RIDL Ae. aegypti.  يظهر هذا الرسم البياني متوسط النسبة المئوية للجراء للجراء RIDL التي تربى على نطاق واسع من الذكور والإناث خلال 23 أسبوعا من الملاحظة مع استرداد ~ 135,000 جرو في الأسبوع.  أشرطة الخطأ = خطأ قياسي من المتوسط، n = 23. في المجموعة الأولى (اليوم 8) استعدنا في المتوسط 59٪ من الذكور و 30٪ من الإناث من إجمالي الخوادر التي تم استردادها من الصواني على مدى 5 أيام. 

الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم متوسط تلوث الإناث من الخوادر الذكور فرزها. يظهر هذا الرسم البياني متوسط النسبة المئوية الشهرية للتلوث بين الإناث أثناء فرز الذكور في اليوم الثامن بعد الفقس على مدى فترة ستة أشهر. 

الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 نظام التغذية الدموية لوحة الألومنيوم. لوحة (ب) مغطاة بارا فيلم (أ) والدم أنبوبي في جيب ثم مختومة (D). يتم وضع لوحة على قفص وتسخينها عن طريق وضع كيس الفول الدافئ (C) على رأس (E). 

الشكل 7 - الأرقام 7- الأرقام التي تم التمييز بين الذكور والإناث Ae. aegypti الخوخ. Ae. يمكن أن يكون الخوادر aegypti جنسي موثوق بها من الاختلافات في شكل الفص التناسلي (في نهاية شرائح البطن الجرو أسفل المجاذيف). وبالإضافة إلى ذلك، يميل الذكور أيضا إلى أن يكونوا أصغر من الإناث.   

الجدول 1 - الجداول نظام التغذية العام ليرقات Ae. aegypti RIDL (ملغ من الطعام لكل يرقة يوميا). لحساب الكمية الفعلية من الطعام المطلوبة تتضاعف في العدد الإجمالي لليرقات في صينية.

Discussion

RIDL هو وسيلة فعالة وآمنة بيئيا لمكافحة البعوض^3,29-31. وتنطبق هذه التقنية على برنامج متكامل لإدارة الآفات، وتتوافق معظم أساليب المكافحة الحالية، بما في ذلك مبيدات اليرقات والحد من مواقع التكاثر ومبيدات البالغين مع هذه التكنولوجيا. توضح هذه الطريقة كيفية إنتاج ما يصل إلى 570,000 من الخوادر الذكور من RIDL أسبوعيا لاستخدامها في التحكم في Ae. Aegypti وعلى حد علمنا هذا هو الوصف الأول لإنتاج البعوض المعدل وراثيا على هذا النطاق. تم تطوير بعض أنظمة الإنتاج المماثلة لنوع البرية Ae. aegypti في 1960s و 70s²⁵، ولكن لم يكن هناك إنتاج مماثل على هذا النطاق منذ ذلك الحين. وفي البرازيل، أطلق سراح نحو 11 مليون ذكر في الفترة من شباط/فبراير 2011 إلى شباط/فبراير 2012. وتعتمد أعداد الذكور المطلوب السيطرة عليها في منطقة معينة على عدد من العوامل بما في ذلك حجم السكان البريين، وتشتت الذكور المفرج عنهم، والقدرة التنافسية للذكور على البقاء والتزاوج بعد الإفراج عنهم، والظروف البيئية.  وقد أظهرت الدراسات السابقة أن RIDL يمكن أن تقلل من عدد البعوض بنسبة 80٪ على الأقل^9.

هناك حاجة إلى توازن بين تحسين تربية الكتلة لحجم الإنتاج والتكلفة مقابل جودة الذكور. على سبيل المثال ، يمكن أن تزيد كثافة اليرقات المتزايدة من القدرة الإنتاجية عن طريق تقليل المساحة المطلوبة والعمل والوقت إلى pupation^32. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الكثافات العالية جدا من اليرقات إلى ذكور أصغر وأقصر عمرا مع انخفاض قدرة التزاوج^32،33. سيتم تقييم جودة الذكور فيما يتعلق ببرنامج SIT في نهاية المطاف من خلال قدرة الذكور المفرج عنهم على التزاوج مع الإناث في الميدان. ويلزم إجراء تقييم ميداني واسع النطاق لتقييم القدرة التنافسية للتزاوج مقارنة بنظرائها البريين^{10 9.} وهذا غالبا ما يجعل من غير العملي تقييم العوامل التي تجعل البعوض الذكور "عالي الجودة" بالضبط. ومع ذلك، فإن الحفاظ على الإنتاج والجودة المتسقين (بالقدر الذي يمكن تقييمه بشكل روتيني) في تربية الكتلة على نطاق واسع أمر بالغ الأهمية. ويتطلب ذلك مستوى عاليا من اليقظة والتوحيد القياسي لجميع العمليات مع احتمال أن يكون للتقلبات الصغيرة تأثير كبير. يعد الاقتباس من يرقات L1 خطوة حاسمة ويوضح هذه النقطة. يعد نقل العدد الصحيح من اليرقات إلى صواني أمرا ضروريا لإنتاج ذات نوعية جيدة. نظام التغذية مصمم خصيصا لعدد محدد من اليرقات. سيؤدي عدد قليل جدا / العديد من اليرقات إلى الإفراط في / تحت التغذية ، مما يؤثر على بقاء اليرقات وحجم الخوادر والوقت للجراء. إذا كان هناك سر لفن تربية الشامل هو ضمان العديد من الخطوات الصغيرة في دورة الإنتاج تجري باستمرار، على وجه التحديد ومع مستوى عال من مراقبة الجودة، كما هو موضح في هذه الورقة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vipan Premium	Sera GmbH	190	http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html
Tetracycline	Sigma Aldrich	T7660	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=T7660|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC
Plate separator	J.W. Hock	5412	http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf
Parafilm M	Pechiney Plastic packing	PM-996	www.parafilm.com
Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm)	Pleion	0757	http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1
Fluorescent scope	Leica Microsystems	MZ FLIII	http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf
Adult cages	BugDorm	DP1000	http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
Filter paper	CELAB		http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html