Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Summary

وقد الأمثل لدينا تقنية الكبسلة باعتبارها منصة 3D فعالة لنشر وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأديم الباطن والخلايا العصبية الدوبامين (DA). كما أنه يوفر فرصة للمناعة عزل الخلايا من المضيف خلال زرع. ويمكن تكييف هذه المنصة لأنواع الخلايا الأخرى.

Abstract

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) آخذة في الظهور كمصدر بديل جذاب لعلاج استبدال الخلية حيث يمكن التوسع فيها في الثقافة إلى أجل غير مسمى ومتباينة إلى أي نوع من أنواع الخلايا في الجسم. وتم أيضا أنواع مختلفة من المواد الحيوية المستخدمة في مزارع الخلايا الجذعية لتوفير المكروية محاكاة المتخصصة الخلايا الجذعية ^1-3. وهذا الأخير هو هام لتعزيز الخلية الى خلية التفاعل، وتكاثر الخلايا، وتمايز في الأنساب محددة، فضلا عن تنظيم الأنسجة عن طريق توفير ثلاثي الأبعاد (3D) البيئة ⁽⁴⁾ مثل التغليف. مبدأ التغليف الخلية ينطوي انحباس الخلايا الحية داخل حدود شبه منفذ الأغشية في الثقافات 3D ^2. هذه الأغشية تسمح لتبادل الاوكسجين والمغذيات والمحفزات عبر الأغشية، في حين يتم استبعاد الأجسام المضادة والخلايا المناعية من المضيف أن تكون أكبر من حجم المسام كبسولة ^5. هنا، نحن مسبقاأرسلت نهجا للثقافة وتفرق hESC DA الخلايا العصبية في المكروية 3D باستخدام كبسولات الجينات. عدلت نحن شروط ثقافة ² إلى تعزيز جدوى hESC مغلفة. أظهرنا سابقا أن إضافة ملفوف لفائف p160-رو المرتبطة المانع (روك) كيناز، Y-27632 والبشرية الجنين الليفية مكيفة المتوسطة استبدال المصل (HFF-CM) إلى منصة 3D تعزز إلى حد كبير جدوى hESC مغلفة الذي أعرب فيه خلايا نهائي الجينات علامة الأديم الباطن ^1. وقد استخدمنا الآن هذه المنصة 3D لنشر التفرقة hESC وفعالة لالخلايا العصبية DA. تحليل التعبير الجيني البروتين وبعد المرحلة النهائية من تمايز الخلايا العصبية DA أظهرت تعبير زيادة هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، وهي علامة للحصول على الخلايا العصبية DA،> 100 طيات بعد 2 أسابيع. افترضنا أن لدينا منصة 3D باستخدام كبسولات الجينات قد تكون مفيدة لدراسة انتشار الأسلحة النووية والموجهة التمايزمن hESC إلى مختلف الأنساب. هذا نظام 3D كما يسمح الفصل بين الخلايا المغذية من hESC خلال عملية التمايز، وأيضا احتمالات العزلة المناعة خلال زرع في المستقبل.

Protocol

وتتم كافة الإجراءات أدناه، باستخدام تقنيات التعقيم داخل مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية. وترد الكواشف والمعدات المستخدمة في الجداول أدناه.

1. إعداد الجيني 1.1٪ (W / V)

1. إضافة 0.275 غرام من تنقية الجينات الصوديوم (نسبة عالية من حامض الغلوكورونيك ≥ 60٪، واللزوجة> 200 ميغاباسكال ثانية، والذيفان الداخلي في الاتحاد الأوروبي ≤ 100 / غ) في أنبوب معقم 50 مل و 25 مل اضافة معقم حل الجيلاتين 0.1٪ أعدت في وقت سابق (0.5g gelatin/500 مل ملي س H ₂ O وحلت عن طريق جهاز الأوتوكليف).
2. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية تقريبا إلى حل جزء من مسحوق الجينات ثم ضع أنبوب على خلاط المدار في 10 XG ليلة وضحاها (درجة حرارة الغرفة).
3. إضافة 2.778 مل من كلوريد الصوديوم العقيمة 9٪ (4.5 غرام من NaCl/50 مل ملي س O ₂ H) إلى 25 مل من محلول الجينات. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية تقريبا تلاه الطرد المركزي في 95 XG لمدة 5 دقائق.
4. تخزين حل الجينات في 4 درجات؛ مئوية لمدة قصيرة الأجل للتخزين (1-2 أشهر) أو عند -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل تخزين (حوالي سنة).

2. إعداد حمام CaCl الأمطار ₂

1. حل 14،7 غرام من CaCl ^_2. 2H O ₂ و 2،38 غرام من HEPES في 1 لتر من ملي س O. ₂ H
2. ضبط مستوى الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
3. تعقيم حل باستخدام فلتر ميكرون 0.22.
4. ويمكن تخزين حمام هطول الأمطار في درجة حرارة الغرفة (6-12 شهرا).

3. إعداد Decapsulating الحل

1. في 500 مل من الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة (D-PBS)، إضافة 50 مل من EDTA 0.5M و 5 مل من HEPES 1M.
2. تعقيم باستخدام فلتر ميكرون أو 0.22 في الأوتوكلاف 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. تخزين حل decapsulating في درجة حرارة الغرفة (6-12 شهرا).

4. إعداد مصل متوسطة (ريال) مع تبديل

1. قبل التغليف، وإعداد ريال المتوسطة مقدما كما ديscribed في جدول معين الكواشف والمعدات.

5. إعداد المانع روك (Y-27632)

1. تمييع Y-27632 مسحوق 0.1٪ في الإنسان مصل (HSA) في مد برنامج تلفزيوني لتقديم حل 5 ملم.

6. إعداد hESC للتغليف

1. قبل علاج الخلايا مع وسائل الاعلام زراعة تستكمل مع 10 ميكرون من المانع روك (RI) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية (حماية من الضوء).
2. بعد العلاج RI، غسل الخلايا مع D-PBS مرتين وطرد الخلايا من لوحات ثقافة إنزيمي مع accutase لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
3. كشط بلطف الخلايا مع مكشطة ماصة أو خلية، وجمع في أنبوب 15 مل. تحييد accutase مع ريال المتوسطة في نسبة 1:1.
4. لإعداد تعليق خلية واحدة، تصفية الخلايا تحييدها باستخدام فلتر ميكرون 40 وجمع في 50 مل أنبوب جديد للطرد المركزي.
5. حساب عدد الخلايا في حل باستخدام عدادة الكريات.
6. منبذة تعليق خلية 95 XG لمدة 5 دقائق والتخلص بعناية وطاف بعد ذلك. غسل الخلايا مع مرحلة ما قبل حرارة كلوريد الصوديوم 0.9٪. منبذة 95 XG لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف.

7. التغليف من خلايا

1. تحضير حقنة 1 مل تعلق على أنابيب من البلاستيك اللين من 14G × 2 قسطرة الرابع ". هذا وتستخدم لنضح تعليق الخلية إلى أن يتم تحميل إلى ضخ حقنة كما هو موضح في الشكل رقم 1.
2. Resuspend الخلايا مع حل الجينات ما قبل حرارة في مناطق ذات كثافة 1.25 مليون خلية / مل الجينات. مزيج بلطف مع المحقنة وتجنب خلق الفقاعات.
3. إعداد مولد حبة، مضخة الحقن ومتر تدفق الهواء كما هو مبين في الشكل رقم 1. وترد المزيد من التفاصيل عن هذه الأجهزة في جدول معين الكواشف والمعدات.
4. مع الخلايا يستنشق في المحاقن، وتجاهل أنابيب بلاستيكية للقسطرة الرابع وتعلق المحقنة إلى آلة التغليف. تأكد من أن هناك فجوة 10 سم يكون توين نهاية آلة التغليف، وجمع نقطة كما هو مبين في الشكل رقم 1.
5. تغلف الخلايا من خلال وضع مضخة الحقن في 20 مل / ساعة، ومعدل تدفق الهواء بنسبة 8 لتر / دقيقة، وضغط 100 كيلو باسكال (يمكن تغيير حجم من الكبسولات عن طريق تغيير معدل تدفق الهواء).
6. جمع الخلايا مغلفة في طبق بيتري (100 × 15 مم) مملوءة 20 مل من حمام هطول الأمطار ما قبل حرارة لمدة 7 دقائق لتحقيق الاستقرار في كبسولات.
7. نقل الخلايا مغلفة بواسطة طموح لطيف إلى 50 أنابيب الطرد المركزي مل مليئة 20 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
8. السماح للكبسولات ليستقر في قاع الأنبوب ثم تجاهل بلطف وطاف. تكرار عملية غسيل مع كلوريد الصوديوم 0.9٪.
9. Resuspend الخلايا مغلفة في المتوسط ​​زراعة ما قبل حرارة تستكمل مع ري (10 ميكرومتر)، ونقل إلى قارورة الثقافة وحضنت في درجة حرارة 37 م / 5٪ CO _2.

8. تمايز hESC مغلف إلى الخلايا العصبية DA

ve_content "> وتعالج hESC مغلفة مع منظمة التأهيل الدولي لمدة 3 أيام قبل التمايز.

1. البذور خط الماوس الخلية اللحمية، PA6 خلايا في مناطق ذات كثافة من 1.0 X 10 ⁴ لكل سم ² في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة T75 قارورة وحالة الخلايا PA6 في المتوسط ​​DA التمايز العصبية (مواد الجدول) قبل 24 ساعة من التمايز.
2. نقل الكبسولات إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وتمكينهم من الاستقرار في الجزء السفلي من أنبوب.
3. تجاهل طاف وresuspend الكبسولات في PA6 المتوسطة DA خلية مكيفة التمايز العصبية.
4. ثقافة hESC مغلفة مع أحادي الطبقة خلية PA6 (9 × 10 ⁶ hESCs لكل 7.5 × 10 خلايا PA6 ⁵⁾ لمدة 28 يوما مع وجود تغيير وسائل الإعلام في يوم (4) ومرة كل يومين بعد ذلك (تغيير سوى نصف المتوسط ​​في كل مرة).
5. بعد 3 أسابيع في الثقافة مع PA6 الخلايا، واستكمال DA متوسطة التمايز العصبية مع 100 نانوغرام / مل SHH و 100 نانوغرام / مل FGF8a للاسبوع المتبقية.

9. نزع المحفظة من hESC مغلف

1. نضح الكبسولات في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، والسماح لهم لتسوية في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل ثم طاف بعناية.
2. غسل الكبسولات مع D-PBS مرتين. السماح للكبسولات تسوية في الجزء السفلي من الأنبوب ثم إزالة طاف.
3. إضافة 5 مل decapsulating حل للكبسولات. مزيج دقيق من خلال تعليق طموح قبل حضانة في درجة حرارة الغرفة لدقائق 4-5.
4. منبذة الخلايا decapsulated في 95 XG لمدة 3 دقائق والتخلص من طاف.
5. غسل بيليه الخلية مع D-PBS تليها الطرد المركزي في 95 XG لمدة 3 دقائق. كرر.
6. يمكن للخلايا decapsulated مزيد من مثقف باعتباره أحادي الطبقة أو استخدامها لتحليل اتجاه مجرى النهر.

10. ممثل النتائج

القطر من كبسولات رقيقة جدا الجينات هي ميكرون 400-500. وكان عدد الخلايا داخل كبسولة estimatإد عن طريق حساب عدد الخلايا مقسوما على عدد من الكبسولات في المدى. ولذلك، قدر ما يقرب من 5.0 X 10 ⁴ خلايا لكل كبسولة. من هذا، فإننا نفترض أن الحد الأقصى لعدد خلايا الكبسولة يمكن أن تحتوي على ما يقرب من 1.0 X 10 ^5. جدوى hESC مغلفة هو> 80٪ (الشكل 2) على النحو الذي تحدده باستخدام باستخدام carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات استر succinimidly (CFDA) / propidium يوديد (PI) فحص. وقد الأمثل نحن شروط التغليف hESC من خلال خفض تركيز الجينات من 2.2٪ الى 1.1٪ وذلك بتغيير حمام هطول الأمطار من كلوريد الباريوم إلى كلوريد الكالسيوم. من هذه الشروط، ونحن فقط اظهرت ان الخلايا التي كانت مغلفة مع الجينات الكالسيوم 1.1٪ ويمكن البقاء على قيد الحياة، تتكاثر وتشكل EBS في المختبر ^1. زيادة الاستخدام الأمثل للحالة، وآثار وسائل الاعلام والتثقيف RI، وقد تم التحقيق Y-27632. البيانات كما وردت في الشكل رقم 2 و 3 تثبت أن prevente RIد التفكك التي يسببها موت الخلايا المبرمج والحفاظ على بقاء الخلية وتعزيز تشكيل كتلة ^1،6 وعلاوة على ذلك، وكان بقاء hESC مغلفة مثقف في ري + HFF-CM أعلى بكثير من غيرها من الجماعات دون مكملات RI، ولكن هذا لم يكن مختلفا إلى حد كبير في hESC مغلفة مثقف في ري + ريال. وبالمثل، وزيادة انتشار الخلايا باستخدام BrdU فحص من 25٪ إلى 75٪ كما الخلايا واحدة وضعت في مجموعات (الشكل 3). وكشف فحص موت الخلايا المبرمج من قبل TUNEL أن الخلايا وحيدة في كبسولات رقيقة جدا مثقف في وسط ريال كانت أفكارك (البيانات لا تظهر) في حين أن المجموعات التي تم استردادها من CM-HFF كانت سلبية في معظمها لTUNEL. إلى حد ما، HFF-CM تستكمل مع bFGF روجت أيضا بقاء وانتشار hESCs مغلفة في غياب Y-27632. ومع ذلك، والعلاج مع Y-27632 قبل (2 ساعة) وبعد التغليف (للحصول على 4 أيام إضافية) تعزيز الجدوى بشكل ملحوظ، والانتشار، وتشكيل كتلة من hESC مغلفة1.1٪ في كبسولات ألجينات الكالسيوم.

أظهرت سابقا نحن يمكن hESC مغلفة متباينة بنجاح إلى الأديم الباطن نهائي ^1. هنا، درسنا تطبيق التغليف خلية كمنصة 3D للتمييز hESC مغلفة في الخلايا العصبية DA. وكانت hESC، التي شكلت هيئات مضغي الشكل (EB) في كبسولات مباشرة متباينة، وعلى نزع المحفظة وفقا للشروط المذكورة أظهرت التشكل التدريجي العصبية (الشكل 4) بعد 2-3 أيام من الثقافة مع بقاء أكثر من 90٪. وأظهر تحليل الجينات التعبير 1 أسفل تنظيم علامة المحفزة، بينما OCT4 علامة neuroprogenitor، PAX6 وDA علامة العصبية، TH كانت تصل للتنظيم بعد 7 أيام من التمييز (الشكل 5A). وكشفت تلطيخ مناعي أن hESC متباينة كانت PAX6 إيجابية (> 80٪)، ولكن OCT4 السلبية في يوم واحد 7. وأظهرت hESC متباينة مزيد TH-إيجابية (> 90٪) الخلايا العصبية بعد 21 يوما (الشكل 5B). الغربية لطخة تحليل وأظهرت أيضاما يصل التنظيم والتعبير TH من يوم 14 (الشكل 5C) في حين انخفض PAX6 التعبير، ينظم بعد 21 يوما. وبالمقارنة، فإن الخلايا المزروعة تحت بيئة ثنائية الأبعاد (2D) في ظل ظروف مماثلة (مثل ري ما قبل المعالجة لمدة 2 ساعة، ومنظمة الروتاري الدولية في مرحلة ما بعد العلاج لمدة 3 أيام قبل التمايز) حافظت على نسبة عالية من الخلايا PAX6 إيجابية (> 80 ٪) خلال فترة التمايز ولم تكن فعالة كما هو الحال في التفريق إلى TH-إيجابية الخلايا (<60٪) كما هو الحال في بيئة 3D التي تقدمها التغليف (الشكل 5A وجيم).

Discussion

وقد أثبتت العديد من الدراسات التي تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية وhESC فوائد نظام ثقافة 3D في المواد الحيوية وهندسة الأنسجة ^2،3. كنا كبسولات ألجينات الكالسيوم ومنصة 3D مناسبة لدراسة انتشار hESC والتمايز مقارنة الجينات الباريوم منذ hESC أظهرت ارتفاع كبير جدوى عندما م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	ملاحظات
الجينات (Pronova UP MVG)	NovoMatrix	4200101	نسبة عالية من حامض الغلوكورونيك ≥ 60٪، واللزوجة> 200 ميغاباسكال ثانية، والذيفان الداخلي <100 الاتحاد الاوروبي / ز
الجيلاتين	سيغما الدريخ	G1890-100G
0.9٪ كلوريد الصوديوم	باكستر للرعاية الصحية	AHF7123
نوع J1 حبة مولد	Nisco الهندسية المحدودة	SPA-0447
متعددة فيزر حقنة مضخة	عصر جديد مضخة نظم المؤتمر الوطني العراقي	نموذج NE-1000
Ezi تدفق مقياس الجريان الطبية	جاسكون أنظمة	G0149
Y-27632	ميرك	688000
مصل الإنسان الزلال	سيغما الدريخ	A4327-1G
Accutase	ميليبور	SCR005
14G × 2 قسطرة الرابع "	شركة Terumo	SR-OX1451C
خروج المغلوب، DMEM	إينفيتروجن	10829-018	لريال المتوسطة (القاعدية)
GlutaMAX-I	إينفيتروجن	35050-061	لريال المتوسطة (2 مم)
تبديل خروج المغلوب المصل	إينفيتروجن	10828-028	لريال المتوسطة (20٪)
البنسلين الستربتوميسين	إينفيتروجن	15070063	لريال المتوسطة (2.5 يو / مل)
الانسولين ترانسفيرين، السيلينيوم (ITS)	إينفيتروجن	41400045	لريال المتوسطة (1X)
β-المركابتويثانول	إينفيتروجن	21985-023	لريال المتوسط ​​(0.1 ملم)
MEM NEAA الحل	إينفيتروجن	11140-050	لريال المتوسطة (5 ملم)
غلاسكو متوسطة الأساسية الدنيا	إينفيتروجن	11710035	لDA متوسطة التمايز العصبي (القاعدية)
تبديل خروج المغلوب المصل	إينفيتروجن	10828-028	لDA متوسطة التمايز العصبية (10٪)
الصوديوم البيروفات	إينفيتروجن	11360070	لDA متوسطة التمايز العصبي (1 ملم)
MEM NEAA الحل	إينفيتروجن	11140-050	لدا نeural متوسطة التمايز (0.1 ملم)
β-المركابتويثانول	إينفيتروجن	21985-023	لDA متوسطة التمايز العصبية (0.1 ملم)
القنفذ الصوتي (SHH)	R & D أنظمة	1314-SH-025/CF	لDA التمايز العصبية (100 نانوغرام / مل)
نمو الخلايا الليفية 8A عامل (FGF8a)	R & D أنظمة	4745-F8-050	لDA التمايز العصبية (100 نانوغرام / مل)