تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

Summary

وقد تم تطوير نوع B الجيلاتين نظام يستند nanovectors هندسيا (جينز) للتسليم الجين النظامية وترنسفكأيشن في علاج سرطان البنكرياس. قبل التعديل مع البشرة مستقبلات عوامل النمو (EGFR) الببتيد محددة على سطح nanparticles ، فإنها يمكن أن الهدف على مستقبلات EGFR والإفراج البلازميد تحت الحد البيئة ، مثل تركيزات عالية من الجلوتاثيون داخل الخلايا.

Abstract

ويتم تشخيص أكثر من 32000 مريضا بسرطان البنكرياس في الولايات المتحدة سنويا ، ويرتبط هذا المرض مع وفيات عالية جدا ^1. هناك حاجة ملحة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة سريريا للترجمة التي يمكن أن تحسن على الإحصاءات الكئيبة بقاء مرضى سرطان البنكرياس. على الرغم من أن العلاج الجيني في حالات السرطان وأظهرت وعدا كبيرا ، فإن التحدي الرئيسي يتمثل في تطوير نظام توصيل آمنة وفعالة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى التعبير التحوير المستدام.

الجيلاتين هي واحدة من البوليمر الحيوي الطبيعي الأكثر تنوعا ، وتستخدم على نطاق واسع في المنتجات الغذائية والدوائية. وقد أظهرت دراسات سابقة من هذا النوع لدينا مختبر B الجيلاتين الجسدي يمكن تغليف الحمض النووي ، التي حافظت على بنية supercoiled كفاءة ترنسفكأيشن البلازميد وتحسينها التسليم داخل الخلايا. بواسطة thiolation من الجيلاتين ، يمكن عرض المجموعات سلفهيدريل في البوليمر وسوف ومكسورة ORM السندات ثاني كبريتيد داخل النانوية ، والتي تستقر في ثاني كبريتيد السندات كلها معقدة ومرة واحدة بسبب وجود الجلوتاثيون في العصارة الخلوية ، سوف يتم الافراج حمولة ^2-5. بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) معدلة وجينز ، وعندما تدار في جهاز الدورة الدموية ، ويوفر على المدى تداول الأوقات ، والأهداف تفضيلي لكتلة الورم بسبب النفاذية المفرطة من قبل neovasculature تعزيز النفاذية وأثر الاحتفاظ ^6. وقد أظهرت الدراسات الإفراط في التعبير عن مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) على Panc - 1 خلايا البنكرياس غدية ^7. وكان EGFR الببتيد محددة من أجل استهداف خط البنكرياس بنشاط الخلايا السرطانية ، مترافق على سطح الجسيمات من خلال هل PEG ⁸

وتتركز معظم العلاجات الجينات المضادة للورم في إدارة الجينات الكابتة للورم ، مثل البرية من نوع البروتين p53 (WT - البروتين p53) ، لاستعادة وظيفة الموالية لأفكارك في الخلايا ⁹ 10. في سرطان البنكرياس ، ومعظم الخلايا لديها طفرات في البروتين p53 ، مما تسبب في فقدان النشاط أفكارك. مع مقدمة من البروتين p53 - بالوزن ، يمكن إصلاح الخلايا ويؤدي كذلك موت الخلية في الخلايا السرطانية ^11.

استنادا إلى المنطق أعلاه ، قمنا بتصميم EGFR استهداف الببتيد المعدلة النانوية الجيلاتين thiolated لإيصال الجينات البروتين p53 - بالوزن وتقييم كفاءة التسليم وترنسفكأيشن في الخلايا Panc - 1.

Protocol

1. إعداد DNA البلازميد مغلف EGFR استهداف النانوية الجيلاتين

1. توليف الجيلاتين thiolated
   1. تم توليفها Thiolated الجيلاتين والطريقة السابقة ^2-5 ، قبل الاقتران التساهمية مع iminothiolane - 2 على المجموعات الأمينية الأساسية من نوع B الجيلاتين. تم حله 1 غرام من الجيلاتين في الماء منزوع الأيونات 100 مل وحضنت مع 20 هيدروكلوريد 2 - iminothiolane ملغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ساعة.
   2. تمت إزالة كاشف المتفاعل بواسطة غسيل الكلى مقابل 5 ملي حل حمض الهيدروكلوريك ، تليها 1 ملي حل حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 ساعات لكل منهما. وكان تجميد المنقى thiolated الجيلاتين المجففة والمخزنة في 4 درجات مئوية لاستخدامها مرة أخرى.
2. إعداد الحمض النووي الذي يحتوي على جزيئات
   1. تم تعديل تم حل 200 ملغ thiolated الجيلاتين في الماء ودرجة الحموضة من حل ل7 من إضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.2 M. وأضاف 1mg الحمض النووي والمختلط برفق مع حل الجيلاتين.
   2. وأضيف الإيثانول المبردة ببطء الى الخليط بينماالتحريك الحل بسرعة عالية. وتم تشكيل لتكوين جزيئات المذيب عندما تغيرت إلى 75 ٪ المائية محلول كحولي.
   3. تم crosslinked مزيد النانوية بإضافة بطء 0.1 مل حل غليوكسال 8 ٪ (V / V). وكانت تطفأ الكواشف غير المتفاعل مع 0.5 مل 0.2 حل جليكاين M.
   4. وكانت جزيئات فائقة على طرد 16000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. تم غسلها بالماء الكريات منزوع الأيونات جزيئات مرتين وتنقيتها وتجميد المجفف وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3. تعديل سطح النانوية
   1. علقت النانوية في 0.1 م العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) مع تركيز 10 ملغ / مل وحضنت مع 2 مرات وزن ميثوكسي - PEG - succinimidyl استر الميثيل كربوكسي (MPEG - SCM ، 2000 ميغاواط دا) أو كربوكسي maleimide - PEG - succinimidyl methylester (القانون النموذجي للتحكيم ، الربط بين المجلس الاعلى للقضاة ، 2000 ميغاواط دا) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك البطيء.
   2. وقد تم جمع جزيئات PEGylated مع الطرد المركزي الفائقة في 16000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقةس. تم غسلها بالماء الكريات منزوع الأيونات جزيئات مرتين وتنقيتها وتجميد المجفف وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   3. علقت سوء الربط بين تعديل SCM النانوية في 0.1M العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 6.5) مع تركيز 10mg/ml وحضنت مع 10 ٪ من الوزن الببتيد EGFR محددة (YHWYGYTPQNVI - GGGGC) لمدة 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع التحريك البطيء.
   4. وقد تم جمع جزيئات الببتيد مع تعديل الطرد المركزي الفائقة في 16000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. تم غسلها بالماء الكريات منزوع الأيونات جزيئات مرتين وتنقيتها وتجميد المجفف وتخزينها في 4 درجات مئوية.

2. توصيف EGFR استهداف النانوية

1. حجم الجسيمات وزيتا المحتملة القياس
   علقت النانوية في مجال المياه مع تركيز 1mg/ml. وتم تحليل التعليق باستخدام Zetasizer نانو (مالفيرن المؤتمر الوطني العراقي). وأجري تحليل حجم الجسيمات خارج بزاوية 90 درجة تشتت عند 25 درجةوقد تم قياس جيم زيتا المحتملة في المعلمات الافتراضية مؤشر عازلة ، ثابت الانكسار واللزوجة من الماء عند 25 درجة مئوية.
2. المجهر الإلكتروني
   وقد شنت النانوية مجفف بالتجميد على جبل عينة الألمنيوم وبصق المغلفة مع البلاديوم لتعزيز الموصلية وتقليل تراكم الاتهامات. شوهدت عينات لالتشكل تحت سطح حقل هيتاشي انبعاث 4800 المسح المجهر الالكتروني في 3 كيلوفولت.
3. الإلكترون مطياف لتحليل المواد الكيميائية (ESCA)
   تجميد المجفف صياغة السيطرة ، وقد تم تحليل PEGylated النانوية الببتيد وتعديلها من قبل ESCA. وقد أجريت عليه في ESCA الوطنية ومركز التحليل السطحي للمشاكل الطبية الحيوية (NESAC / BIO) ، جامعة واشنطن (سياتل ، واشنطن).
   1. وضعت العينات في فراغ عالية جدا ومعرضة للانخفاض الطاقة شعاع الأشعة السينية ، والتي يسببها انبعاث الالكترونات الضوءيه من الثانوية من السطح.
   2. بواسطة بالتآمر الكشف عن عدد الإلكترونات بوصفها وظيفة من بنتم تعيين قرع الطاقة ، والطيف الذرى لوحظ أن كل المكونات الكيميائية.
   3. تم إجراء تحليل عالي الاستبانة C1s الأطياف لتحديد التركيب الكيميائي الدقيق من المواد الهيدروكربونية (CC أو CH في 285mV) ، الأثير (CO) في 286.4mV) ، والكربونيل (C = O في بالسيارات 288.1) ، وتكوين النسبية لكل وظيفة كان يحددها المنطقة تحت المنحنى.
4. استقرار البلازميد مغلفة
   وأكد استقرار البلازميد الحمض النووي للتغليف الحمض النووي عن طريق تشغيل على استخراج المواد الهلامية مسبقة الصنع. وهضمها النانوية مع البروتيني ملغ / مل تحتوي على 0.2 في برنامج تلفزيوني (30 دقيقة عند 37 درجة مئوية) و 0.2 U / مل الدناز (10min في درجة حرارة الغرفة) بشكل منفصل ، في نفس الوقت أو بالتتابع. ثم تم تحميلها على عينات 1.2 ٪ agarose هلام (GP) (E - جل ، Invitrogen ، كاليفورنيا) في تركيز 100ng/well في حجم 18μL لكل بئر. تم تحميل البلازميد عاريا كما تم تشغيل والتحكم في هلام 75 V لمدة 30 دقيقة. واستخدمت كوداك الرقمية الأشعة السينية العينة (DXS) نظام لتصور بيستخدم المعامل transluminescence مع الأشعة فوق البنفسجية.
5. تقرير التحميل البلازميد
   علقت النانوية مغلفة البلازميد في 1mg/ml ويتفاعل مع البروتيني 0.2mg/ml عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وكان الحل في طرد 13000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، وجمعت طاف واختبار لتركيز البلازميد مع مقايسة Picogreen (Invitrogen). تم احتساب نسبة التغليف بقسمة تركيز مغلفة البلازميد مع تحميل الأولية بنسبة 0.5 ٪ (ث / ث).

3. وفي الدراسات المخبرية في ترنسفكأيشن Panc - 1 خلايا سرطان البنكرياس

1. ظروف خلية ثقافة
   Panc - 1 - 1 وCapan غدية خطوط خلية البنكرياس ، تم الحصول على خلايا غدية SKOV3 خط المبيض والمعاهد الوطنية للصحة ، 3T3 الخلية الليفية خط الفئران من ATCC. وقد نمت Panc - 1 - 3T3 والمعاهد الوطنية للصحة مع DMEM المتوفرة مع L - الجلوتامين ، القلم بكتيريا و 10 ٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ ، في حين Capan - 1 المطلوب توفيره DMEM 20 ٪ مصل بقري جنيني.كان يزرع في SKOV3 RPMI - 1640 المتوفرة مع مصل بقري جنيني من 10 ٪.
2. تحليل اللطخة الغربية للتعبير عن EGFR
   1. جمعت lysates خلية من خلايا 2000000 وتحليلها لتركيز البروتين الكلي باستخدام مقايسة BCA (بيرس). وقد استخدم المعاهد الوطنية للصحة ، كما 3T3 السيطرة السلبية ، وكان يستخدم SKOV3 ومراقبة إيجابية للتعبير عن EGFR.
   2. تم تشغيل 10 ميكروغرام من استخراج البروتين الكلي في مرحلة ما قبل الصب الصوديوم دوديسيل الكهربائي للهلام كبريتات - بولي أكريلاميد (SDS - PAGE) في نظام 135V لمدة 90 دقيقة.
   3. في وقت لاحق ، نقلت جل على غشاء PVDF بواسطة نظام جاف iBlot التنشيف (Invitrogen).
   4. تم حجب الغشاء مع الحليب الخالي من الدسم 5 ٪ في توين المحتوية على المياه المالحة تريس العازلة (TBS - T) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   5. وقطعت وحضنت مع غشاء 1:1،000 التخفيف من الأجسام المضادة الأولية بيتا الأكتين الأرانب و1:1،000 التخفيف من الأجسام المضادة الأولية EGFR الأرنب بين عشية وضحاها على حدة في 4 درجات مئوية.
   6. تم غسلها ثم مرتين مع غشاءTBS - T وحضنت مع 1:2،000 التخفيفات الثانوية المضادة للأرنب حصان الفجل مفتش - البيروكسيداز مترافق في TBS - T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   7. بعد الشطف الأضداد الزائدة مع TBS - T والمياه ، وتمت إضافة 4 مل الركيزة ECL (بيرس ، روكفورد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع أغشية وحضنت لمدة 5 دقائق.
   8. ثم كانت العصابات Chemiluminescent كوداك الرقمية تصور باستخدام الأشعة السينية العينة (DXS) النظام.
3. دراسات الجدوى زنزانة مع تركيبات مختلفة
   1. ونمت الخلايا Panc - 1 في 96 - جيدا في لوحات 10000 الخلايا لكل بئر في 200μL من DMEM تستكمل بين عشية وضحاها.
   2. استعيض المتوسطة النمو مع وسائل الاعلام الحرة التي تحتوي على مصل تركيزات مختلفة من الجسيمات النانوية مع 0 ، 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 ، 6 ملغ / مل. وقد استخدم 1mg/ml PEI ، وهو المعروف البوليمر الموجبة السامة للخلايا ، كما تحكم إيجابية.
   3. تم علاج الخلايا النانوية مع 200μL لمدة 6 ساعات ثم استبدال كاشف MTS 20μL و100μL كاملةثقافة الإعلام.
   4. بعد آخر حضانة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO ₂ ، تم قياس الامتصاصية من الناتج formazan في 490nm مع لوحة Biotek القارئ SynergyHT (Winooski ، VT).
   5. وأعرب عن الجدوى في المئة من الخلايا كما أن نسبة امتصاص الخلايا البوليمر المعالجة النسبي للسيطرة السلبية (0mg/ml) مضروبة في 100 وظيفة ، وخططت للتركيز البوليمر.
4. دراسات الخلية الاتجار
   1. وقد استخدم رودامين B ثيوسيانات (RBITC) لالمتقارن على الجيلاتين thiolated عن طريق تفاعل مع مجموعة أمين. بعد غسيل الكلى وlyophilization ، وصفت RBITC كان يستخدم لتحضير الجيلاتين thiolated النانوية.
   2. قبل desolvation ، كانت مختلطة مع 25μL PicoGreen 1mg البلازميد لمدة 1 دقيقة ، وأضيفت إلى حل البلازميدات المسمى الجيلاتين. وأدلى صياغات مختلفة وفقا للطريقة السابقة.
   3. ونمت الخلايا Panc - 1 - 6 جيدا في لوحات تحتوي على الزجاج مع غطاء ينزلق 200000 خلايا عإيه جيدا. بعد نمو بين عشية وضحاها ، وعولج من 2ml المسمى النانوية في كل جيدا مع تركيز 1mg/ml في المتوسط ​​حرة المصل.
   4. بعد نقطة زمنية مختلفة ، من 15 دقيقة إلى 6 ساعات ، تم استبدال المتوسطة مع مستنبت يحتوي 1μg/ml Hoest من 33342 (Invitrogen) للحضانة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استعيض 2ml حل بارافورمالدهيد 4 ٪ في كل بئر لإصلاح الخلايا. ثم تم غسلها مع الخلايا PBS مرتين.
   5. وقد شنت Coversilps على الشرائح الزجاجية. وقد استخدم ليزر متحد البؤر مضان المجهر لالتقاط صور ثابتة من الخلايا.
5. تقرير من الكفاءة النوعية ترنسفكأيشن بواسطة المجهر مضان مع pEGFP - N1 مغلفة النانوية
   1. وكانت مغلفة pEGFP - N1 البلازميدات إلى النانوية وعلقت وسائل الإعلام الحرة في المصل مع تركيز يعادل البلازميدات 10μg لكل مل لعلاجات أخرى.
   2. Panc - 1 زرعت الخلايا بين عشية وضحاها في لوحات contai 6 - جيدانينغ الزجاج غطاء ينزلق مع 200000 في الخلايا بشكل جيد. وعولج من 2ml pEGFP - N1 النانوية مغلفة البلازميدات في كل بئر. كانت مختلطة 20μg من البلازميدات مع Lipofectin 20μl ، الموجبة كاشف ترنسفكأيشن الدهن ، وانه كان يستخدم في مراقبة إيجابية ، بينما تم استخدام الخلايا غير المعالجة ومراقبة سلبية.
   3. وحضنت الخلايا مع الصيغ المختلفة لمدة 6 ساعات.
   4. استعيض المتوسطة مع الخلايا المتوسطة الثقافة وكانت في مرحلة ما بعد transfected لمدة 24 ساعة و 48 و 72 و 96.
   5. بعد ترنسفكأيشن الوظائف ، تم استبدال المتوسطة مع مستنبت يحتوي 1μg/ml Hoest من 33342 (Invitrogen) وحضنت مع الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   6. وقد شنت Coverslips على الشرائح الزجاجية والتعبير عن ولوحظ GFP في الخلايا عن طريق مجهر مضان. حصلت الفرق على النقيض التدخل (DIC) والصور باستخدام أوليمبوس BX61 مضان المجهر والصور الرقمية ومعالجتها مع برنامج J صورة.
6. تحديد الكمية من الكفاءة ترنسفكأيشن بواسطة ELISA مع pEGFP - N1 مغلفة النانوية
   1. وكانت مغلفة pEGFP - N1 البلازميدات إلى النانوية وعلقت وسائل الإعلام الحرة في المصل مع تركيز يعادل البلازميدات 10μg لكل مل لعلاجات أخرى.
   2. Panc - 1 زرعت الخلايا خلال الليل في 6 لوحات جيدة مع 200000 في الخلايا بشكل جيد. وعولج من 2ml pEGFP - N1 النانوية مغلفة البلازميدات في كل بئر. كانت مختلطة 20μg من البلازميدات مع Lipofectin 20μl ، الموجبة كاشف ترنسفكأيشن الدهون ، والتي كان استخدامها لمكافحة الخلايا غير المعالجة الايجابية وكانت تستخدم لمراقبة سلبية.
   3. وحضنت الخلايا مع الصيغ المختلفة لمدة 6 ساعات.
   4. استعيض المتوسطة مع الخلايا المتوسطة الثقافة وكانت في مرحلة ما بعد المحتضنة لمدة 24 ساعة و 48 و 72 و 96.
   5. بعد ترنسفكأيشن الوظائف ، تم جمع lysates خلية من كل بئر وتحليلها لتركيز البروتين الكلي باستخدام مقايسة BCA (بيرس).
   6. وكذلك لوحة COAمع تيد 100μl 1:1000 من التخفيفات من الأضداد وحيدة النسيلة المضادة للGFP في كل بئر. بعد مرور فترة الحضانة 2 ساعة ، وجرفت وحة مع PBS - 0.5 ٪ (W / V) توين - 80 لمدة 4 مرات.
   7. أضيفت 300μl مخازن TBS حظر في كل بئر والمحتضنة لمدة 2 ساعة. ثم تم غسلها ثم لوحة مع PBS - 0.5 ٪ (W / V) توين - 80 لمدة 4 مرات.
   8. أضيفت 30μg من البروتينات في كل مجموعة في لوحة وحضنت بين عشية وضحاها في 4 درجة. ثم تم غسلها ثم لوحة مع PBS - 0.5 ٪ (W / V) توين - 80 لمدة 4 مرات.
   9. أضيفت 100μl من التخفيفات 1:2400 من أضداد GFP الثانوية المتعلقة الفوسفاتيز القلوية إلى كل بئر والمحتضنة لمدة 1 ساعة. ثم تم غسلها ثم لوحة مع PBS - 0.5 ٪ (W / V) توين - 80 لمدة 4 مرات.
   10. أضيفت 100μl ركائز الفوسفاتيز القلوية إلى كل بئر والمحتضنة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. وقد تم قياس اللوحة مع التآزر BioTek القارئ لوحة HT الامتصاصية في 405nm.
   11. وأفيد كما أعرب عن تركيز GFP نانوجرام لكل ميلlligrams من البروتين الكلي.
7. تحديد الكفاءة النوعية ترنسفكأيشن بواسطة RT - PCR مع جزيئات البروتين p53 - بالوزن مغلفة البلازميد
   1. وكانت مغلفة وزن البروتين p53 - البلازميدات إلى النانوية وعلقت وسائل الإعلام الحرة في المصل مع تركيز مكافئ لمل 10μg في البلازميد لعلاجات أخرى.
   2. Panc - 1 زرعت الخلايا خلال الليل في 6 لوحات جيدة مع 200000 في الخلايا بشكل جيد. وعولج 2ml من وزن البروتين p53 - البلازميدات مغلفة النانوية في كل بئر. كانت مختلطة 20μg من البلازميدات مع Lipofectin 20μl ، الموجبة كاشف ترنسفكأيشن الدهون ، والتي كان استخدامها لمكافحة الخلايا غير المعالجة الايجابية وكانت تستخدم لمراقبة سلبية.
   3. وحضنت الخلايا مع الصيغ المختلفة لمدة 6 ساعات.
   4. استعيض المتوسطة مع الخلايا المتوسطة الثقافة وكانت في مرحلة ما بعد المحتضنة لمدة 48 ساعة.
   5. تم استخراج مرنا من كل بئر باستخدام الحمض النووي الريبي السامية الصرفة العزلة مجموعة (روش ، انديانابوليس ، IN) وقياسها مع Nanodrop 2000 (Thermo العلمية وWilminton ، DE).
   6. وقد تم RT - PCR باستخدام QIAGEN في خطوة واحدة RT - PCR مجموعة (QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا). الاشعال للالبروتين p53 ، باكس ، بي سي إل 2 ، بيتا الأكتين ، DR5 ، Apaf - 1 ، بوما ، تم تصنيعه من قبل Survivin Eurofins MWG Operon (هانتسفيل ، الجامعة).
   7. تم تقييم منتجات PCR مع الكهربي الهلامي وحللت بكسل من العصابات [كدنا] مع برنامج ImageJ.
8. palsmid تحديد الكمية من الكفاءة العلاجية مع جزيئات البروتين p53 - بالوزن مغلفة
   1. ومغلفة وزن البروتين p53 - البلازميد الى النانوية وعلقت وسائل الإعلام الحرة في المصل مع تركيز مكافئ لالبلازميدات 10μg لكل مل لمزيد من العلاج.
   2. Panc - 1 زرعت الخلايا خلال الليل في 6 لوحات جيدة مع 200000 في الخلايا بشكل جيد. وعولج 2ml من وزن البروتين p53 - البلازميدات مغلفة النانوية في كل بئر. كانت مختلطة 20μg من البلازميدات مع Lipofectin 20μl ، الموجبة كاشف ترنسفكأيشن الدهون ، والتي كان استخدامها لمكافحة إيجابية وكانت الخلايا المعالجةاستخدامها لمكافحة السلبية.
   3. وحضنت الخلايا مع الصيغ المختلفة لمدة 6 ساعات.
   4. استعيض المتوسطة مع الخلايا المتوسطة الثقافة وكانت في مرحلة ما بعد المحتضنة لمدة 24 ساعة و 48 و 72 و 96.
   5. كان يستخدم لونين التكثيف / نفاذية الأغشية / الميت كيت موت الخلايا المبرمج الخلية (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) لتسمية الخلايا أفكارك ، والخلايا والخلايا الحية نخرية بأصباغ مختلفة.
   6. وقد استخدم التصوير iCys بحوث عداد الكريات من CompuCyte (ويستوود ، MA) لتحليل ومقارنة مستويات الخلايا بعد العلاج. استنادا إلى صور مجهرية مضان ، تم تسجيل كثافات من جميع الألوان ورسم مقابل التهم والنسب المئوية لحساب وكانت مجموعات سكانية مختلفة.
   7. وتمت مقارنة لسيطرة سلبية ، مما يعني انه لا يوجد علاج للخلايا ، وتحسب الخلايا أفكارك التغييرات أضعاف بها والمدرجة في الرسم البياني.
   8. وقد استخدم 3.8.8 - ONE آبو كاسباس 3 متجانسة / 7 الفحص عدة (Promega ، ماديسون ، ويسكونسن) لدراسة عRO - أفكارك النشاط بعد ترنسفكأيشن من البروتين p53 - بالوزن البلازميد. وقد استخدم 1mg/ml PEI كعنصر تحكم السلبية للقضاء على كل نشاط مبرمج. بعد ترنسفكأيشن الوظائف ، تم علاج الخلايا مع رودامين 110 مكرر (N - CBZL - aspartyl - L - غلوتاميل - L - valyl - L - أميد حمض الأسبارتيك ؛ DEVD - Z - R110) ، الذي هو ركيزة من caspase 3 / 7 ، لمدة تصل إلى 18 ساعة.
   9. وقد تم قياس التآزر مع لوحة لوحة HT BioTek القارئ لمضان في 490/520 نانومتر. استنادا إلى كثافة مضان أخضر ، يمكن تقييم الموالية لأفكارك النشاط.

4. ممثل النتائج

1. التوليف وChatacterization النانوية المستهدفة EGFR

تم توليفها EGFR استهداف الببتيد المعدلة النانوية كما أظهر مخطط في الشكل 1. تميزت النانوية التي أعدتها desolvation لحجم الجسيمات وزيتا المحتملة. التهمة حجم متوسط ​​والسطحية للجسيمات أعدت من gelatins thiolatedيتم سرد مع درجات مختلفة من thiolation في الجدول 1. كانت أقطار الجسيمات النانوية يعني مختلفة بين 150-250 نانومتر. النانوية Thiolated أصغر بالمقارنة مع حجم جزيئات الجيلاتين ، قد يرجع ذلك إلى تشكيل ثاني كبريتيد جسر داخل الجزيئات. مع تعديلات سطحية مختلفة ، زادت أحجام النانوية. وكانت إمكانات زيتا تركيبات مختلفة حول بالسيارات -20. SEM مع التحليل ، وقد لوحظت أحجام والمورفولوجيا السطحية والشكل الكروي للجزيئات وبما يتطابق مع نتيجة Zetasizer. وكانت الكفاءة تحميل الحمض النووي في جزيئات النانوية الجيلاتين والجيلاتين thiolated أعلى من 95 ٪ (الجدول 1).

الرقم التفاعلات الكيميائية 1. مخطط ، وتعديل سطح النانوية توضح thiolated الجيلاتين مع نمو البشرة الواقعص مستقبلات (EGFR) الببتيد ملزمة من خلال هل بولي (PEG) (جلايكول الإثيلين).

توصيف النانوية

صيغة	القطر جسيمات متناهية الصغر (نانو متر)	زيتا المحتملة (السيارات)	البلازميد الكفاءة تحميل الحمض النووي (٪)
هلام NP	151.4 ± 23.5	-17.1 ± 5.23	95.6 ± 2.2
SH - NP جل	132.6 ± 17.9	-24.6 ± 5.16	97.0 ± 3.8
SH - جل PEG	179.0 ± 30.9	-22.3 ± 9.50	95.8 ± 6.5
SH - جل PEG الببتيد	230.8 ± 41.5	-18.1 ± 4.02	94.8 ± 5.1

تابلي 1. حجم الجسيمات ، تهمة السطحية ، والبلازميد الكفاءة تغليف الحمض النووي للرقابة وEGFR استهداف جزيئات الجيلاتين الجيلاتين وthiolated.

عالية الدقة C _1S كان يستخدم التحليل الطيفي الإلكترون بمسح للتحليل الكيميائي (ESCA) لتحليل مكونات سطح الجيلاتين thiolated (SH - NP جل) ، الربط بين تعديل thiolated الجيلاتين (SH - جل PEG) وEGFR استهداف الببتيد معدلة والجيلاتين thiolated النانوية (SH - جل الببتيد PEG). وأظهرت النتائج في الجدول 2 شدة ذروة CH (الهيدروكربونية) ، ثاني أكسيد الكربون (الاثير) ، وC = O (الكربونيل) الفئات المعرضة لل285.0 ، 286.3 ، 288.1 ، وجمعية مسجلة ، على التوالي. وزاد ثاني أكسيد الكربون في اشارة الأثير بعد التعديل PEG وانخفضت بعد الاقتران الببتيد. في حين انخفض تكوين النتروجين بعد التعديل وزيادة الربط بعد التعديل الببتيد ، والتي أكدت وجود EGFR استهداف الببتيد على النانوية. أكدت ESCA مزيد من التحليل والربط الببتيد تعديل السطح.

الإلكترون الطيفي للتحليل الكيميائي التركيب السطحي النانوية

صيغة	C 1S (٪)	يا 1S (٪)	N 1S (٪)
SH - NP جل	59.3 ± 0.8	22.9 ± 0.5	12.9 ± 0.1
SH - جل PEG	58.2 ± 0.6	28.0 ± 1.2	9.5 ± 0.7
SH - جل PEG الببتيد	56.7 ± 0.8	25.9 ± 0.7	12.3 ± 0.6
صيغة	CC (٪)	ثاني أكسيد الكربون ، N (٪)	C = O (٪ )
SH - NP جل	51.5	26.6	21.9
SH - جل PEG	17.1	63.1	19.8
SH - جل PEG الببتيد	33.1	42.8	24.1

الجدول 2. C _1S ذات دقة عالية من التحليل الطيفي الإلكترون بمسح للتحليل الكيميائي (ESCA)

وكانت من أجل دراسة استقرار البلازميد مغلفة ، وتعامل مع النانوية البروتيني أو بشكل منفصل الدناز ، simuntaneously أو بالتتابع. بعد الكهربي ، وقد أظهرت النتائج في الشكل 2 محمية DNA البلازميد مغلفة في النانوية من قبل جميع النانوية ومستقرة ، البلازميد الحمض النووي مماثلة لالمجردة. وقد أظهرت هذه الدراسة أن جميع هذه الجسيمات النانوية يمكن تغليف والحفاظ على هيكل البلازميد بعد التغليف.

/ files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>
الشكل 2. الاستقرار من الحمض النووي البلازميد مغلفة في الجيلاتين thiolated ، thiolated الربط بين تعديل الجيلاتين ، وEGFR الببتيد المعدلة النانوية الجيلاتين thiolated بواسطة agarose هلام إستشراد. وعولج النانوية مع 0.2 ملغ / مل من البروتياز لإثبات البلازميد تغليف الحمض النووي داخل مصفوفة جسيمات متناهية الصغر

2. الأساس التعبير EGFR في خلايا سرطان البنكرياس

وقد تم تحليل اثنين غدية البنكرياس خطوط الخلايا البشرية (Panc - 1 - 1 وCapan) من قبل لطخة الغربية للتعبير عن EGFR. الإنسان غدية المبيض (SKOV3) والفئران الليفية ((NIH - 3T3) وقد تم اختيار الخلايا كما الضوابط الإيجابية والسلبية ، على التوالي. بيتا الأكتين تم تحليل ومراقبة التحميل البروتين. Panc - 1 الخلايا أظهرت ارتفاع التعبير EGFR مقارنة Capan - 1 وكان يستخدم هذا الخط ثم الخلية ليلي في الدراسات المختبرية

3. السمسة السيطرة وSurfaThiolated CE - التعديل النانوية الجيلاتين

وبغية تقييم التفاعل الخلوي للالنانوية ، أجرى فحوصات السمسة الخروج بعد العلاج مع النانوية. استنادا إلى النتائج في الشكل 3 ، فإن كلا من التحكم وتعديل سطح النانوية كانت آمنة نسبيا وحيويا في الخلايا - 1 Panc حتى بتركيزات عالية ، مقارنة مع PEI. أجريت الدراسات الآتية مع النانوية 1mg/ml.

الشكل 3. بقاء الخلية النسبة كدالة للتركيزات صياغة جسيمات متناهية الصغر في Panc - 1 الخلايا حسب تقييم صبغ tetrazolium (MTS) مقايسة

4. امتصاص مستقبلات الخلية توسط في خلايا Panc 1

لتأكيد الوصول سطح EGFR استهداف مستقبلات الببتيد وامتصاص بوساطة endocytotic النانوية ، تم تصميم النظام من خلال وضع العلامات لكل المشاركينmponent مع مضان مختلفة عن التصور لامتصاص الجسيمات النانوية والاتجار في الخلايا. مع هذا النظام وضع العلامات ، يمكن تحديد الحمض النووي البلازميد ، النانوية ونواة الخلية. وقد استخدم ليزر متحد البؤر مضان المجهر لالتقاط الصور عند نقاط زمنية مختلفة ، من 15 دقيقة إلى 6 ساعات. من خلال مقارنة الصور من صيغ مختلفة ، وأظهرت الببتيد النانوية الجيلاتين مترافق امتصاص سريع واطلاق سراح البلازميد في غضون 30 دقيقة. هذه النتيجة تبين كذلك أن EGFR الببتيد ، مترافق النانوية خضع الإلتقام يسرت التفاعل مع سريعة بين الببتيد ومستقبلات محددة EGFR EGFR على سطح الخلية ، التي كانت أسرع بكثير ، مقارنة مع جزيئات أخرى ، والتي خضعت لغير محددة الإلتقام.

خلية الاتجار الدراسي

الشكل 4. متحد البؤر المجهري مضان analysis من الحمض النووي مغلفة امتصاص جسيمات متناهية الصغر والاتجار في الخلايا Panc - 1. (الحمراء = رودامين المسمى النانوية ، الأخضر = PicoGreen المسمى DNA البلازميد ، والأزرق = دابي النواة التي تحمل علامات). كانت قوة الليزر 7 مرات في أقل من الأرقام الأربعة الأخيرة من اللوحة السفلى.

5. النوعي والكمي في المختبر ترنسفكأيشن مع البروتين الأخضر المحسن نيون

واستخدمت إليسا في الشكل (5) والتحليل المجهري مضان في الشكل (6) لقياس الكمي والنوعي في كفاءة الخلايا tranfection GFP - 1 Panc على إدارة معدلة ، والربط بين تعديل EGFR الببتيد المعدلة النانوية thiolated الجيلاتين. أسفرت البلازميدات ألقاها EGFR استهداف النانوية في أعلى مستوى من التعبير GFP بعد 48 ساعة بالنسبة لعناصر التحكم الأخرى ، بما في ذلك Lipofectin المعقد - DNA.

الشكل 5. GFP تعبيرهتآمر nalyzed بواسطة ELISA بوصفها وظيفة من الوقت في مرحلة ما بعد إدارة DNA البلازميد في السيطرة وEGFR النانوية المستهدفة.

Fluoresence التحليل المجهري للترنسفكأيشن GFP

الشكل 6. التحليل النوعي للتعبير البروتين الفلوري الأخضر في خلايا - 1 Panc بواسطة المجهر epifluoresence بعد 24 و 72 و 48 و 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع EGFP - N1. وقد استخدم الدنا Lipofectin معقدة كعنصر تحكم إيجابية.

6. Tranfection في المختبر مع البرية من نوع البروتين p53 في خلايا البلازميد Panc 1

تم استخراج البروتين p53 البلازميدات من النوع البري pORF - hp53 ، مع EF - 1α / HTLV المروج الهجين من E. القولونية ومغلفة في النانوية لدراسة تأثير أفكارك العلاجية. Panc - 1 عولجوا مع جزيئات الخلايا لمدة 6 ساعات وبعد transfected لمدة 24 إضافية ، 48 ، 72 ، و 96 ساعة.

منذ البروتين p53 يمكن أن تحفز الخلايا في الخلايا ، ومن أجل إنجاز هذه المهمة ، فإن العديد من عوامل النسخ المصب أن تشارك وتنظم مباشرة عن طريق التعبير عن البروتين p53 - بالوزن. من بينها ، وباكس ، كاسباس 3 ، كاسباس 9 ، DR5 وبوما وApaf 1 - أن يصل ينظمها التعبير عن البروتين p53 وبينما بي سي إل 2 ، أسفل survivin سيكون التنظيم. وكان من أجل النظر في مستويات هذه العوامل النسخ ، استخراج مرنا من خلايا Panc 1 - بعد 48 ساعة بعد واستخدامها لترنسفكأيشن RT - PCR. تم تقييم المنتجات مع الكهربي الهلامي وحللت مع العصابات ImageJ. واستنادا إلى النتائج أظهرت في الشكل 7 ، survivin انخفضت بشكل ملحوظ مع العلاج النانوية EGFR استهدفت الجيلاتين thiolated بالمقارنة مع العلاجات الأخرى التي ينظر اليها أي تغيير واضح في بي سي إل 2 ، والتعبير عن باكس كاسباس 3 ، كاسباس 9 ، DR5 ، وApaf PUMA - 1increased النانوية مع العلاج المستهدفة.

les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>
الرقم 7. قورنت مستويات مرنا من العوامل المصب من وزن البروتين p53 - التعبير RT - PCR بعد 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

بعد بالوزن البروتين p53 - ترنسفكأيشن ، استخدمت الكروماتين التكثيف / نفاذية الأغشية / الميت عدة الأبوطوزيس الخلية لتمييز الخلايا أفكارك ، والخلايا والخلايا الحية نخرية بأصباغ مختلفة. وقد استخدم التصوير iCys بحوث عداد الكريات من CompuCyte (ويستوود ، MA) لتحليل ومقارنة مستويات الخلايا بعد العلاج. وتمت مقارنة لسيطرة سلبية ، وتحسب الخلايا أفكارك التغييرات أضعاف بها والمدرجة في الشكل 8. EGFR استهدفت nanopaticles الجيلاتين thiolated أظهرت أعلى السكان الخلية أفكارك بعد ترنسفكأيشن بالوظائف. تحليل caspase 3 / 7 النشاط أظهرت أيضا أن EGFR النانوية التي تستهدف استيعاب سريع وكان أعلى مستوى من النشاط في خلايا أفكارك Panc - 1.

الرقم 8. تحليل Cytometric المؤيدة للنشاط في مجال مراقبة أفكارك WT - transfected Panc البروتين p53 - 1 الخلايا باستخدام التصوير iCys ° عداد الكريات

Discussion

وأعدت الرقابة واستهدفت EGFR النانوية thiolated الجيلاتين مع تغليف الحمض النووي الكفاءة والاستقرار. وكانت أحجام الجسيمات من كل هذه النظم في نطاق 150-250 نانومتر في القطر. وقد ثبت زيتا المحتملة لهذا النظام هو نظام سلبية قليلا. مع تحليل SEM ، كانت أحجام النانوية مع نفس النتيجة Zetasizer. ويمكن تحليل ESCA تأكيد الربط والببتيد تعديل السطح.

وأظهر تحليل لطخة غربية أن Panc - 1 الخلايا قد تعبير EGFR مستويات عالية ، وكان يستخدم هذا الخط لخلية في الدراسات المختبرية. وكانت كل من التحكم وتعديل سطح النانوية أقل نسبيا السامة للخلايا في الخلايا Panc 1 - مقارنة PEI.

وأظهرت الدراسات الاتجار خلية امتصاص السريع وإطلاق سراح من البلازميد EGFR استهداف الخلايا النانوية في Panc - 1. أدى تسليم الحمض النووي البلازميدات مع مراسل معربا عن EGFR استهداف النانوية في أعلى المستوياتGFP التعبير النسبية لعناصر التحكم الأخرى ، بما في ذلك Lipofectin المعقد - DNA. مع النظام نفسه ، أثار ترنسفكأيشن مع وزن البروتين p53 - البلازميد مسار المصب أفكارك وموت الخلايا المبرمج في الخلايا السريعة التي يسببها Panc - 1.

هذه النتائج الأولية تشير إلى أن EGFR استهداف جزيئات الجيلاتين thiolated يمكن أن تكون بمثابة نظام DNA الولادة الآمنة والفعالة للعلاج بالجينات لعلاج سرطان البنكرياس.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
نوع B الجيلاتين ، بلوم 225	سيغما الدريخ	G9391
2 - iminothiolane هيدروكلوريد	سيغما الدريخ	I6256
pEGFP - N1 البلازميد	إيليم بيوفارم	N / A
pORF - hp53 كولاي	Invivogen	porf - hp53
غليوكسال الحل (40wt. ٪ في H 2 O)	سيغما الدريخ	128465
جليكاين	سيغما الدريخ	410225 - 250G
QIA تصفية عدة ميغا البلازميد	Qiageن	12281
بيكمان نابذة فائقة السرعة جنيه 80K	بيكمان	N / A
المناطق الحرة وحدة التحكم ليتر 6 تجميد نظم الجاف	Labconco	7753020
MPEG - SCM ، 2000 ميغاواط دا	Laysan	MPEG - SCM - 2K - 1G
سوء الربط بين المجلس الاعلى للقضاة ، 2000 ميغاواط دا	Jenkem التكنولوجيا	A5001 - 1
Zetasizer نانو	مالفيرن	Zetasizer نانو ZS
هيتاشي الانبعاثات مجال المسح الضوئي المجهر الالكتروني 4800	هيتاشي	S - 4800 UHR FE - SEM
ضليع في الرياضيات - IT PicoGreen dsDNA الكاشف وأطقم	Invitrogen	P7589
Lipofectin ترنسفكأيشن الكاشف	Invitrogen	18292011
DMEM	Mediatech cellgro	10 013 سم
RPMI	Mediatech cellgro	50 020 PB
بيرس الفحص البروتين BCA كيت	الحرارية العلمية	23225
iBlot الجاف نظام التنشيف	Invitrogen	IB1001
XCell SureLock مصغرة الخلية وحدة وصمة عار XCell الثاني كيت علامة CE	Invitrogen	EI0002
بيرس ECL الغربية التنشيف الركيزة	الحرارية العلمية	32109
كوداك الرقمية الأشعة السينية العينة (DXS) النظام	الة ألتصوير اليدوية	N / A	؛
CellTiter 96 AQ ueous خلية حل واحد الفحص الانتشار (MTS)	Promega	G3580
BioTek SynergyHT وحة قارئ	BioTek	N / A
Nanodrop 2000	الحرارية العلمية	N / A
خطوة واحدة RT - PCR طقم	Qiagen	210212
الكروماتين التكثيف / نفاذية الأغشية / موت الخلايا المبرمج الميت كيت خلية	Invitrogen	V23201
الاشتقاق واحد متجانس كاسباس 07/03 الفحص عدة	Promega	G7790
Hybaid PCR سبرينت الحرارية Cycler	الحرارية العلمية	N / A
EGF مستقبلات جسم	الخليةإشارات	2232
β - أكتين جسم	الخلية إشارات	4967
أرنب المضادة للمفتش ، HRP مرتبطة جسم	الخلية إشارات	7074
جسم الفأر وحيدة النسيلة GFP	نوفوس البيولوجية	NB600 - 597
جسم الماعز GFP النسائل المتعددة (الفوسفاتاز القلوية)	نوفوس البيولوجية	NB600 - 1502
الفوسفاتيز الركيزة كيت	الحرارية العلمية	37620