العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Summary

ونحن نقدم بروتوكول للثقافة عالي النقاء الخلايا العصبية قرن آمون من أدمغة فئران قبل الولادة من دون استخدام خلية طبقة المغذية الغروية.

Abstract

وتستخدم على نطاق واسع الثقافات الأولية من الفئران والخلايا العصبية قرن آمون الفئران للكشف عن الآليات الخلوية في علم الأعصاب. من خلال عزل وتنامي الخلايا العصبية الفردية، والباحثين قادرون على تحليل الخصائص المتعلقة بالاتجار الخلوية، وبنية الخلية والفردية توطين بروتين باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات الحيوية. نتائج من مثل هذه التجارب لاختبار حاسم نظريات معالجة أساس العصبية للذاكرة والتعلم. ومع ذلك، وتستند النتائج لا لبس فيه من هذه الأشكال من التجارب على قدرته على النمو مع الثقافات العصبية تلوث الحد الأدنى من غيرها من أنواع خلايا الدماغ. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم وسائل الاعلام الخاصة المصممة لنمو الخلايا العصبية وتشريح دقيق من الأنسجة الجنينية الحصين لتحسين نمو الخلايا العصبية السليمة مع التقليل من أنواع الخلايا الملوثة (أي الخلايا النجمية). يمكن الجنينية الماوس الأنسجة الحصين يكون من الصعب عزل من الأنسجة القوارض مماثلة نظرا لحجم العينة لديssection. نعرض تقنيات تشريح مفصل من الحصين من الجنينية الجراء الفار يوم 19 (E19). بمجرد أن يتم عزل الأنسجة قرن آمون، ويتحقق انفصال لطيف من الخلايا العصبية مع تركيز مخفف من التربسين وتعطيل آلية تهدف إلى خلايا منفصلة من النسيج الضام مع توفير الحد الأدنى من الضرر لخلايا فردية. ويرد وصف مفصل لكيفية تحضير الماصات لاستخدامها في تعطيل. وتقدم كثافة الطلاء الأمثل لالمناعة مضان بروتوكولات لتعظيم نجاح زراعة الخلايا. ويقدم هذا البروتوكول تقنية سريع (حوالي 2 ساعة) وفعالة للثقافة من الخلايا العصبية من الأنسجة الماوس قرن آمون.

Protocol

1. انشاء قبل الحصاد

1. لتوليد الجراء قبل الولادة لحصاد الخلايا العصبية، والجدول الزمني بين تربية الفئران 19 يوما قبل يوم من العزلة الخلايا العصبية. (C57BL / 6 الفئران الذين تتراوح أعمارهم استخدمت 2-8 أشهر في التزاوج لأغراض تطوير هذا البروتوكول). ويمكن تأكيد التزاوج الناجح من خلال الكشف عن المكونات المهبلي في تأكيد الإناث، وخفقان أو المرئية من الحمل
2. في اليوم قبل الخلايا العصبية العزلة:
   1. لالمناعي التطبيقات، coverslips الزجاج معطف في لوحة 24-جيدا مع طلاء ضوء 03:01 الكولاجين 1، ذيل الجرذ: بولي-D-يسين حل.
   2. لتطبيقات زراعة الخلايا، ومعطف النسيج الحجم المناسب ثقافة وير البلاستيكية التي تحتوي على طلاء ضوء 03:01 الكولاجين 1، ذيل الجرذ: بولي-D-يسين حل.
3. راحة لوحات وكشف في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
4. تغسل الصحون مع هانك معقم ميزان محلول ملحي (HBSS) قبلللاستخدام. ويمكن ملء صفائح مطلية مع HBSS وتخزين ما يصل الى اسبوع واحد في 4 درجات مئوية في الظلام.

2. الأنسجة الحصاد

1. العقم هو دائما عامل عندما تزايد زراعة الخلايا الأولية وعلى هذا النحو، ينبغي ممارسة أكبر قدر من الحذر لضمان بيئة أكثر معقمة ممكن. مع الحرص على الاهتمام تقنية معقمة، ويمكن الانتهاء تشريح الأولي والحصاد من الأنسجة العصبية لهذا البروتوكول خارج لتدفق رقائقي غطاء محرك السيارة مع الحد الأدنى من خطر التلوث. بعد موسم الحصاد الأولي، ينبغي إجراء جميع الخطوات اللاحقة تحت ظروف معقمة أقصى داخل غطاء محرك السيارة تصنيف للثقافة الخلية.
2. الموت ببطء فأر حامل في حوالي 19 يوما بعد الإخصاب بواسطة قطع الرأس. لا ينصح باستخدام التخدير إلى الموت ببطء الأنثى الحامل كما هو معروف التخدير تسبب موت الخلايا في الدماغ (Stratmann، وآخرون، 2010). استخدام معقم مقص تشريح وملقط، وخلق فتحة في الجانب منتصف بطني منماوس لتكشف تماما تجويف الجسم. يمكن تعقيم الأدوات باستخدام الكحول واللهب المكشوف.
3. وسيكون مقر الجراء قبل الولادة نحو الخلفي من تجويف الجسم الماوس، ويجب أن يكون مرئيا بسهولة في الرحم. مع ملقط معقم مشبع، وفتح الرحم وإزالة الجراء. قطع رأس الجراء مع مقص العقيمة الطازجة ورئيس المركز إزالة على شاش معقم تحت المجهر تشريح. يمكن العقيمة، والصكوك تكون مشبع لهب تنظيفها باستخدام الكحول واللهب المكشوف قبل وأثناء الاستخدام.
4. باستخدام مقص معقم أو مشرط، الجمجمة مفتوحة من الجرو من رقبته من الخلف إلى الأنف. يمكن عادة هذا الإجراء يتم الانتهاء من ادخال طرف واحد من مقص في الثقبة الفقرية ومن ثم الشروع الأمامية. إزالة بعناية للدماغ كامل مع الملقط. وضع الدماغ على شاش معقم. باستخدام مشرط معقم، وإزالة المخيخ وشق أسفل خط الوسط من الدماغ لفصلها إلى نصفين (الشكل 1) .
5. فهم جزء صغير من السحايا المحيطة الحصين مع ملقط معقم وتسحبه بعيدا بلطف. على الرغم من أنه ليس من الضرورة القصوى لإزالة السحايا قبل عزل الحصين، ويمكن وجود للسحايا جعل تشريح الحصين أكثر صعوبة نظرا لصلابة للغشاء. في كلتا الحالتين، سوف تكون أكثر الحصين واضحة للعيان بعد أن تم إزالة السحايا. الحصين هو بنية المنحني الذي يبدأ في الجزء الأعلى من نصف الكرة الأرضية والانحناءات البطني (الشكل 2). كما، مقعر الداخلية، والجانب (الذيلية) يواجه البطين، وهي بالفعل الحرة. لذلك، لعزل الحصين، ويحتاج المرء إلى قطع على طول الجانب الخارجي محدب. بعد تشريح، رفع بلطف كل الحصين مع ملقط معقم الأنسجة ونقل إلى صحن زراعة الأنسجة الصغيرة مع حرارة (37 درجة مئوية) HBSS تحت غطاء محرك السيارة خلية ثقافة. ويمكن الجمع بين أنسجة المخ من الجراء متعددة.

"> 3. النسيج التفكك

1. باستخدام مشرط معقم، أنسجة المخ فرم بلطف في 3 مل من HBSS معقم في صحن 100 ملم زراعة الأنسجة.
2. نقل الأنسجة المفروم وHBSS إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 1.5 مل من HBSS و 0.5 مل من محلول التربسين 0.25٪ إلى إجمالي حجم 5 مل.
3. قبعة وعكس بلطف الأنبوب 4-5 مرات لخلط. في محاولة لتجنب الفقاعات تنتج مثل الحمض النووي التي صدرت من الأنسجة هضمها سوف تتمسك فقاعات وتسبب في النسيج المفروم لتعويم بدلا من تسوية إلى الجزء السفلي من أنبوب (الشكل 3).
4. احتضان الأنسجة قرن آمون في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، على النحو الوارد أعلاه أنبوب قلب كل 5 دقائق.
5. السماح للأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب.
6. إزالة بعناية حل الزائدة باستخدام ماصة معقمة، وترك الأنسجة دون عائق في الجزء السفلي من الأنبوب.
7. غسل بيليه الأنسجة مع 5 مل من HBSS على 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كرر ما مجموعه 3 مرات. السماح للأنسجة لتسوية تماماإلى أسفل الأنبوب في كل مرة قبل الانتقال الى الخطوة التالية غسيل.
8. إزالة غسل النهائي من بيليه واستبدال الأنسجة مع 2 مل من HBSS الطازجة.

4. الخلايا العصبية سحن

1. قبل البدء في خطوات سحن، وسوف تحتاج إلى إعداد النار مصقول الماصات باستور. استخدام ناسخ Bunson، عقد 9 بوصة معقم ماصة باستير طرف (الشكل 4A) في لهب حتى قطر لفتح ماصة ما يقرب من 0.5 ملم في حجم وحواف افتتاح ماصة تم تقريب قليلا (الشكل 4B). السماح للماصة لتبرد تماما قبل البدء في عملية سحن.
2. باستخدام معقم طبيعي 9 بوصة ماصة باستير، يسحن بلطف الأنسجة ما مجموعه 7 مرات. قطعة نسيج أكبر من المعتاد في هذه النقطة، وينبغي أن يسمح لتسوية إلى أسفل الأنبوب قبل الانتقال الى الخطوة التالية.
3. نقل وطاف لأنبوب جديد مل العقيمة 50 مخروطي.
4. إلى الأنسجة المتبقية، إضافة 2 مل من HBSS معقمة ويسحن ما مجموعه 5 مرات باستخدام النار مصقول ماصة باستير.
5. السماح لجميع القطع المتبقية أكبر الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب، والجمع بين طاف مع طاف السابقة ليصبح المجموع 4 خلايا العصبية مل فصلها.

5. خلية التصفيحات

1. عد الخلايا فصلها باستخدام عدادة الكريات.
2. وكقاعدة عامة، مرة واحدة وقد تم تحديد أرقام الخلية، طرح 20٪ من هذا العدد النهائي لحساب أي موت الخلايا التي قد تحدث بعد الطلاء.
3. يمكن مطلي الخلايا باستخدام التوصيات الواردة أدناه:
   لcoverslips في لوحة 24 جيد - 6 × ⁴ 10 خلية / جيدا في 0.5 مل
   لمدة 60 ملم لوحات زراعة الأنسجة - 4 × 10 ⁵ خلية / لوحة في 3 مل
   مقابل 100 ملم لوحات زراعة الأنسجة - 6 × 10 ⁶ خلية / لوحة في 6 مل
4. خلط أرقام الخلية المناسبة مع حجم المشار إليه من وسائل الإعلام التصفيحات Neurobasal (Neurobasalوسائل الإعلام التي تحتوي على الملحق B27 [1 مل / 50 مل]، 0.5 ملي الحل الجلوتامين، 25 جلتاميت ميكرومتر (السيد 147.13 جم / مول)، البنسلين (10000 وحدة / مل) / الستربتوميسين (10000 ميكروغرام / مل) [250 ميكروليتر / 50 مل] ، 1MM HEPES (السيد 238.3 غرام / مول)، و 10٪ الحصان الحرارة المانحة مصل معطل) وإضافة إلى لوحات الخلايا. لوحات دوامة بلطف لتوزيع الخلايا بالتساوي. يضاف مرحبا الجهات المانحة مصل الحصان إلى وسائل الإعلام التصفيحات لتخصيب الخلايا خلال ال 24 ساعة الأولى من النمو. كانت الخلايا في وقت لاحق مفطوم من مصل الدم، وعاد إلى بيئة خالية من المصل بواسطة تخفيض التسلسلي للمصل في كل بديل وسائل الاعلام. وينبغي أن يلاحظ أيضا أنه في حين أن الغلوتامات في تركيزات أعلى سامة بالنسبة للمزارع الخلايا العصبية، على تركيز أقل واضاف هنا، وسوف يمنع المرفق من الخلايا غير العصبية ^11. ومع ذلك، فقط لأنه يمكن ان تضاف الى وسائل الاعلام لتصفيح ال 24 ساعة الأولى في الثقافة وغادر في وقت لاحق من أي وسيلة إعلامية لمنع التغذية العصبية للخلايا.
5. فالدانتيل الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ حاضنة بين عشية وضحاها.
6. إزالة نصف حجم وسائل الاعلام من الخلايا واستبدالها مع نفس الحجم من وسائل الإعلام تغذية Neurobasal (وسائل الإعلام التي تحتوي على Neurobasal B27 الملحق [1 مل / 50 مل]، 0.5 ملي الحل الجلوتامين، البنسلين (10000 وحدة / مل) / الستربتوميسين (10000 ميكروغرام / مل) [250 ميكروليتر / 50 مل]، 1 HEPES ملم (السيد 238.3 غرام / مول).
7. ويجب أن تغذى الخلايا العصبية كل 4 أيام وذلك بإزالة نصف وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع نفس الحجم من جديد وسائل الاعلام التغذية Neurobasal. وينبغي أن تبدأ العمليات العصبية لتكون واضحة في يوم 1 (الشكل 5A)، وأصبحت سائدة من قبل يوم 10 (الشكل 5B).

6. ممثل النتائج

أصبحت القدرة على النمو والثقافة الخلايا العصبية الأولية جزءا لا غنى عنه في علم الأعصاب. الثقافات الابتدائية تسمح للباحث لتحليل مسارات محددة الخلوية والكيميائية تعديل والعلاج، والهدف في الموضعalization وأنماط النمو في بيئة تسيطر عليها. كثير من هذه الإجراءات استخدام منهجية متطورة لتصور تغييرات محددة في الردود الخلية. في هذه الحالة، يتم استخدام الخلايا العصبية الحصين لدراسة المسارات العصبية المحددة التي سيكون من الصعب، إن لم يكن مستحيلا لتحليل في الدماغ سليمة. إعداد السكان متجانسة بالقرب من الخلايا العصبية من مناطق معينة من الدماغ هو أمر حاسم لدراسة وظيفة الدماغ. يمكن أن الآثار الجزيئية في الخلايا العصبية الفردية تكون مفيدة في تحديد مسارات أعلى النظام مثل الذاكرة أو التعلم. كما يعطي هذا البروتوكول الثقافات نقي نسبيا من الخلايا العصبية قرن آمون، من دون الحاجة إلى وجود طبقة وحدة التغذية من الخلايا الغروية، وتستخدم هذه الخلايا العصبية بسهولة للدراسات المناعي. ومع ذلك، كما هو الحال مع كل ثقافة الأولية من الأجهزة التي تحتوي على أنواع خلايا متعددة، يمكن لبعض الخلايا التي تلوث أقل المطلوب أن يحدث. في عزل الخلايا العصبية، يمكن أن تلوث بواسطة الخلايا الدبقية مشكلة مشتركة. خلايا دبقية جيمكن الكشف عنها بسهولة 1 على التصوير المجهري للثقافة والصرف الخاصة بهم يختلف اختلافا كبيرا من الخلايا العصبية الهدف (الشكل 6). فإن تأثير تلوث الخلية الدبقية تعتمد على الاستخدام المخطط للثقافات. إذا كان يتم استخدام الخلايا المناعية لفحص مضان، يمكن أن تلوث الدبقية لا شيء أكثر من مجرد إزعاج عند محاولة تصوير الخلايا العصبية الفردية. ومع ذلك، إذا الثقافات العصبية هي لاستخدامها في تحليل الكيمياء الحيوية، ويمكن لأي تلوث كبير من الخلايا الدبقية يسبب تغيرات كبيرة في النتائج. وترد وسائل لمعالجة تلوث الخلية الدبقية مزيد من المناقشة.

بمجرد أن يتم عزل الخلايا العصبية بنجاح، ونمت في الثقافة، وتطبيق واحد نموذجي هو فحص العمليات الخلوية المناعية مضان التقنيات. كما هو موضح في الشكل 7، يمكن ملطخة عضيات، مثل الميتوكوندريا، وذلك باستخدام الصبغات الحيوية إضافة إلى وسائل الإعلام ثقافة قبل لإصلاحأوجه. يمكن أن البروتينات الخلوية الذاتية يمكن تصور محدد من الخلايا المناعية باستخدام معيار تقنيات مضان (الشكل 8). مرة واحدة يتم إصلاح الخلايا العصبية، ويمكن إدخال أجسام مضادة محددة للبروتينات ذات أهمية بالنسبة للخلية، ويمكن تصور هذه البروتينات باستخدام مجهر مضان. الخلايا العصبية مثقف كما توفر للباحث مع وسائل لدراسة آثار بروتين فرد على وظائف الخلايا العصبية. باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات بما في ذلك transfections الحمض النووي، electroporation أو تنبيغ فيروسي، يمكن overexpressed البروتينات في الخلايا العصبية (الشكل 9). كيف يمكن أن الخلايا العصبية تستجيب لآثار الإفراط في التعبير عنه والبروتينات لديها استنتاجات مباشرة بشأن الكيفية التي قد يستجيب الدماغ، ويوفر إمكانية تحديد أهداف الخلوية للعلاجات الدوائية. تفاصيل هذه الأنواع من التجارب تتجاوز نطاق هذه الورقة ولكنها لا توضح أن الثقافات التي أعدتها هذه التقنية هي مناسبة لمجموعة واسعة من ليالي لأسفلtream التطبيقات. ومع ذلك، فإن البساطة العامة لهذا البروتوكول، وكذلك، فإن الفترة الزمنية القصيرة اللازمة لإعداد هذه الثقافات العصبية تجعل من هذا وسيلة مثالية للاستخدام في مختبر علم الأعصاب اليوم.

الشكل 1. تشريح للدماغ فأر قبل الولادة. الشق الأول هو أسفل خط الوسط من الدماغ فصله إلى نصفين.

الشكل 2. الموقع من قرن آمون في الدماغ قبل الولادة الماوس. يتم نقل المخطط إلى تصور جانبا الحصين ويلاحظ من المنحني "اللوبيا" هيكل نوع في هذه المنطقة البعيدة من كل نصف الكرة الغربي.

الشكل 3. التفكك من الأنسجة قرن آمون في حل التربسين.

الشكل 4. باستور نصائح ماصة تستخدم في سحن من الأنسجة قرن آمون. (أ) عادي طرف باستور ماصة. (ب) الحريق مصقول طرف باستور ماصة. يحيط علما حواف مدورة وانخفاض تقريبي 50٪ في حجم افتتاح ماصة.

عزل الشكل 5. الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام هذا الإجراء، ومطلي ملحوظة في وسائل الإعلام. (أ) نمو الخلايا 1 يوم بعد الطلاء. العمليات العصبية تبدأ في أن تكون واضحة خلال يوم 1. (ب) نمو الخلايا لمدة 10 أيام بعد الطلاء، وتشعبت neurites والتداخل.

الشكل (6). قرن آمون العصبية الملوثة مع الخلايا الدبقية نمت لمدة 7 أيام وملطخة MitoTracker علامة عضية الأحمر CM-H2XRos (إينفيتروجن # M7515) وحوالةالمديرية مع GFP-LC3 باستخدام Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن # 11668019). الميتوكوندريا واضحة في جميع الخلايا وtransfected بنجاح فقط ولكن إحدى الخلايا العصبية واحدة مع التركيبة فلوري. تلوث مع الخلايا الدبقية يجعل تحليل GFP-LC3 التعبير في العمليات العصبية من الصعب تصور.

الشكل 7. الخلايا العصبية قرن آمون نمت لمدة 7 أيام وملطخة MitoTracker علامة عضية الأحمر XRos ₂ سم-H (إينفيتروجن # M7513). وتستخدم هذه الصبغة الحيوية إلى وصمة الميتوكوندريا نشط في خلايا الأنسجة. تم إصلاح الخلايا في امتصاص العرق 4٪ / برنامج تلفزيوني وتصور بواسطة المجهر الفلورسنت. الصبغة نفسها غير قابلة للفلوري حتى تتأكسد في الميتوكوندريا. ويمكن رؤية الميتوكوندريا نشطة في جميع أنحاء العمليات العصبية.

الرقم 8. الخلايا العصبية قرن آمون نمت لمدة 7 أيام، ثابتة مع بارافورمالدهيد 4٪ / برنامج تلفزيوني والمناعية ملطخة ضد وحيد النسيلة β مكافحة تويولين (سيغما # T0198). بعد الأجسام المضادة الأولية، ولاية أوريغون الأخضر المسمى الماعز المضادة للفأر الجسم المضاد الثانوي (إينفيتروجن # O11033) واضاف كان ومضان تصور بواسطة المجهر.

وقد نما الرقم 9. الثقافات العصبية قرن آمون لمدة 5 أيام وtransfected مع GFP-LC3β بناء الحمض النووي باستخدام Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن # 11668019). في يوم 7، تم إصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ / برنامج تلفزيوني وaggresomes مع LC3β GFP الموسومة دمجها في الغشاء الخارجي لها وتصور باستخدام المجهر الفلورسنت. وتقع Aggresomes في جميع أنحاء الجسم خلية وneurites ويتم الرمز مع السهام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد استخدمت الثقافات قرن آمون في البيولوجيا الجزيئية لأكثر من 20 عاما. في حين من حيث المبدأ، ويمكن إجراء الثقافات الخلايا العصبية من أي جزء من الدماغ، وقد أثبتت الثقافات الحصين ليكون الأكثر شعبية نظرا لبنية بسيطة نسبيا من سكان الخلية العصبية في قرن آمون ^7. تكون ع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	بائع	فهرس العدد
جرذ الكولاجين الذيل 1	العلوم البيولوجية دينار بحريني	354236
بولي-D-يسين الحل	Chemicon	A-003-E
هانكس المتوازن محلول ملحي	إينفيتروجن	14175-095
التربسين الحل (1X) 0.25٪، سائلة	إينفيتروجن	15050-065
NeuroBasal متوسطة (1X) السائل	إينفيتروجن	21103-049
B27 الملحق (50X) السائل	إينفيتروجن	17504-044
الجلوتامين L-200 ملم (100X) السائل	إينفيتروجن	25030-149
بنسلين (10،000 وحدة / مل) / الستربتوميسين (10000 ميكروغرام / مل)	إينفيتروجن	15140-148
مرحبا الجهات المانحة الحصان مصل	اتلانتا البيولوجية	S12150H