JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الأذن الداخلية الماوس هي جهاز اللوحاء المستمدة من الحواس التي التنموية البرنامج وضعت خلال فترة الحمل. نحن تعريف في الرحم تقنية نقل الجينات التي تتكون من ثلاث خطوات: الفأر البطن بطني، microinjection transuterine، و في الجسم الحي electroporation. نحن نستخدم الفيديو الرقمية المجهر لإثبات حاسم تقنيات الجنينية التجريبية.

Abstract

الأذن الداخلية الثدييات على 6 ظهائر الحسية متميزة: 3 عرف في الأمبولات من القنوات نصف دائري؛ بقع في utricle والكييس، وعضو كورتي في القوقعة ملفوف. وعرف وبقع تحتوي على خلايا شعر الدهليزي أن transduce المحفزات الميكانيكية إلى أيد بالمعنى الخاص للتوازن، في حين أن خلايا الشعر السمعي في جهاز كورتي هي محولات الطاقة الأولية لعقد جلسات استماع 1. خلية مواصفات مصير هؤلاء في ظهائر الحسي والتشكل من القنوات الهلالية والقوقعة تجرى خلال الأسبوع الثاني من الحمل في الماوس ويتم الانتهاء إلى حد كبير قبل الولادة 2،3. وتجرى بشكل روتيني دراسات التنموية في الأذن الداخلية من خلال الماوس حصاد الأجنة وراثيا في مختلف المراحل الجنينية أو بعد الولادة إلى التبصر في الأساس الجزيئي لل/ والخلوية أو الظواهر المورفولوجية 4،5. نحن نفترض أن نقل الجينات إلى الأذن الداخلية الماوس النامية في الرحم < / em> في سياق المكاسب والخسائر من دراسات وظيفة يمثل نهجا مجانية إلى transgenesis الماوس التقليدية للاستجواب من الآليات الوراثية الكامنة وراء تطور الثدييات الأذن الداخلية 6.

نموذج تجريبي لإجراء دراسات misexpression الجينات في الأذن الداخلية الماوس النامية أثبتت هنا يحل في ثلاث خطوات عامة: 1) البطن بطني، 2) microinjection transuterine، و 3) في electroporation الجسم الحي. البطن بطني هو أسلوب البقاء على قيد الحياة الماوس الجراحية التي تسمح لجهات خارجية من الرحم للوصول تجريبية لزرع الأجنة 7. microinjection Transuterine هو استخدام مشطوف بال micropipettes الزجاج، وشعري لإدخال التعبير البلازميد في تجويف الحويصلة الأذنية أو otocyst. في الجسم الحي electroporation هو تطبيق موجة مربع، والبقول الحالية مباشرة إلى قيادة التعبير البلازميد إلى 8-10 الخلايا الاصلية.

الحمار = "jove_content"> نحن سبق وصفها هذا نقل الجينات electroporation القائم على تقنية وشملت مذكرات مفصلة عن كل خطوة من البروتوكول 11. يمكن للتقنيات الفأر الجنينية التجريبية يكون من الصعب معرفة من النثر والصور الثابتة وحدها. في العمل الحالي، ونحن شرح الخطوات 3 في الجينات إجراء التحويل. الأهم من ذلك، نحن نشر الرقمي المجهر الفيديو لاظهار وجه التحديد كيفية: 1) تحديد اتجاه الجنين في الرحم، 2) إعادة توجيه الأجنة لاستهداف الحقن لotocyst، 3) microinject الحمض النووي مختلطة مع حل الصبغة الكاشفة في otocyst في أيام الجنينية 11.5 و 12.5، 4) electroporate في otocyst حقنه، و 5) الأجنة التسمية electroporated لاختيار ما بعد الولادة عند الولادة. ونحن نقدم نماذج تمثيلية من الأذن الداخلية transfected بنجاح، ودليل التصويرية لأكثر الأسباب شيوعا للmistargeting otocyst؛ مناقشة كيفية تجنب الأخطاء المنهجية المشتركة، والمبادئ التوجيهية الحالية للكتابة في الرحم زين رعاية الحيوان بروتوكول نقل.

Protocol

1. بطني البطن

  1. تخدير أحد السدود التي هي أجنة في يوم الجنينية 11.5 (E11.5؛ ظهر اليوم تم الكشف عن المكونات المهبل هو يوم 0.5 من التطور الجنيني) عن طريق الحقن داخل الصفاق من حل صوديوم مخدر بنتوباربيتال (7.5 ميكروليتر لكل غرام من وزن الجسم). عامل مخدر حل: 180 ميكرولتر من 50 ملغ / مل حل الصوديوم بنتوباربيتال و 100 ميكرولتر من الايثانول المطلقة؛ 320 ميكرولتر من 65 ملغ / مل سلفات المغنيزيوم مائي (ينظم لهجة الرحم)، و 400 ميكرولتر من البروبيلين جليكول (غير قابلة للامتزاج مع مركبة مائي وعضوي المكونات).
  2. تقييم اكتمال التخدير عن طريق إجراء التجارب المؤذية المنبهات: أزمة مخلب؛ قرصة الذيل، وبرمشة استجابة للمس الخد وvibrissae. تطبيق مرهم معقم للعين على القرنيات.
  3. حلق الفراء البطن من منطقة فوق العانة إلى القفص الصدري مع المقص وشفرة غرامة (اوستر # 40 شفرة). تطهير البطن مع الايثانول 70٪، 10٪ اليود البوفيدون (Betadine)، وهوالثانية والايثانول 70٪، بالتسلسل. مكان الماوس البطن الجانبية أسفل على الستارة معقم ومن ثم وضع على وسادة التدفئة أو لوحة دافئ (37 درجة مئوية) لمدة 2-5 دقائق.
  4. شق الجلد في منطقة البطن في خط الوسط مع بطني الكرة ذات الرؤوس مقص. تمديد شق لمدة 10-14 ملم. تحديد ألبا الخط، وهو، أبيض اوعائي الفرقة النسيج الضام على طول خط الوسط بطني من جدار البطن. شق في ألبا الخط مع الكرة يميل مقص وتوسيع شق 10-14 ملم. ري على الفور في البطن مع prewarmed (37 درجة مئوية) lactated رينغر حل.
  5. عناصر خارجية قرني الرحم بالملقط حلقة دون تطبيق الضغط المفرط على مواقع التوطين. ري قرون تخريجها الرحم مع prewarmed، حل رينغر lactated.

2. Transuterine Microinjection

  1. افتعال سميك الجدران، ماصة البورسليكات الزجاج microinjection الشعرية مع الخصائص التالية: 12-16 μم القطر الخارجي وشطبة 20 درجة. على مجتذب P-97 سوتر ماصة مع خيوط مربع صغير، واستخدام البرنامج التالي: حرارة = اختبار المنحدر بالإضافة إلى وحدات (3)؛ الضغط = 200؛ سحب = 0؛ سرعة = 46؛ مرة = 100). مع beveler BV-10 سوتر، استخدم 104C (الذهب) قرص جلخ لماصات قطرها كبير. مخزنة التعبير Resuspend البلازميد في ميكروغرام 3-4 / ميكرولتر في فوسفات الكالسيوم الحرة المالحة (درجة الحموضة 7،2-7،4). إضافة أخضر سريع بلوري إلى دوامة المركزة، والحمض النووي بلطف لمدة 30 ثانية، وتدور في 10000 جم لمدة 10 ثانية. يتم تحديد الحد الأدنى للأخضر سريع المطلوبة لتعقب بصريا على فعالية حقن تجريبيا. ردم ماصة مشطوف مع الحمض النووي / حل سريع الخضراء. ربط ماصة microinjection المحملة على حامل ماصة للحاقن الضغط (Picospritzer باستخدام> النيتروجين نقي بنسبة 99٪ والغاز المصدر).
  2. Transilluminate الرحم مع كثافة منخفضة، وعلى ضوء الهالوجين لتصور الجنين داخل موقع غرس لها. التعرف على BEAتينغ القلب، وحويصلات الدماغ، وبراعم الأطراف، الوليدة البطين ال 4 من الدماغ المؤخر، والعين. ري الرحم كل دقيقة 2 مع prewarmed، lactated حل رينغر للحفاظ على الماء. تطبيق ضغط لطيف على الرحم لإعادة توجيه جنين والتعرف على المعالم التشريحية المشار إليها أعلاه.
  3. توجيه جنين للتعرف على وريد رئيس الأولية التي الأمامية والخلفية فروع الجهة الوسيطة في الأراضي التي يقيم otocyst. لا يمكن otocyst المناسب أن ينظر من قبل تضوء الرحم. يقع في منتصف الطريق بين otocyst الفروع الأمامية والخلفية من وريد رئيس الأولية التي، جنبا إلى جنب مع الجذع الرئيسي للالسياق، تشكل شكل توجد القوائم أو القائمين على ملعب لكرة القدم الاميركية. وotocyst هو في منتصف الطريق بين توجد القوائم.
  4. إدراج ماصة حقن عن طريق الرحم في مسار تماشيا مع موقع مفترض لotocyst. نبض microinjector مرة واحدة بعد مرورا uterلنا تصور الصبغة الكاشفة وتقريبي في موقع رأس ماصة. دفع ماصة تحت السيطرة ميكرومتر والنبض مرة أخرى لتقييم عمق. مزيد من التقدم في ماصة في اللحمة المتوسطة رئيس الجانبية ونبض مرارا وتكرارا. وسوف ناجحة تستهدف otocyst تكشف عن شكل مدبب من قناة اللمف الباطن ظهريا والإسكالوب شل شكل من الدهليز. lactated حل رينغر الافراج عن الضغط على الرحم، وإزالة ماصة من الجنين / الرحم في اقتراح واحد، وعلى الفور لري الرحم مع prewarmed،.

3. في الجسم الحي Electroporation

  1. ري الرحم مع حل قارع الأجراس في lactated. حل تطبيقها حديثا قارع الأجراس lactated هو ضروري لزوجين كهربائيا الأقطاب مجداف على غرار إلى الرحم. يبلل السطوح التنغستن من الأقطاب مع وقارع الأجراس lactated. مركز otocyst حقنه في طريق الأقطاب. بلطف ضغط الرحم مع السلطة الفلسطينية electroporationddles. الكاثود هي على اتصال مع جدار الرحم الجانبية لحقن otocyst والقطب الموجب على اتصال مع جدار الرحم المتاخمة للotocyst uninjected. يؤدي الى نبض موجة مربع قطار مع التبديل دواسة القدم على electroporator. المعلمات Electroporation هي: 5، 50 ميللي ثانية البقول بنسبة 43 فولت في النبضة و 950 ميللي ثانية تأخير interpulse. ري فورا الرحم بعد تسليم القطار نبض. تسجيل الحالية تسليمها إلى الأنسجة: 60-100 mAmps يكفي لtransfect الأسلاف الظهارية أذني. حقن وelectroporate 4-6 و الأجنة E11.5 في السد.
  2. تنفيذ، مستقل 2 microinjection transuterine من ديكستران فلوري مائي (اليكسا فلور 488 إذا كان التعبير البلازميد يشفر بروتين أحمر فلوري أو أليكس فلور 594 إذا كان التعبير البلازميد يشفر ببروتين أخضر) إلى البطين ال 4 من هذه الأجنة التي داخلي آذان حقن بدقة وعلى الأقل 60 mAmps الحالية في النبضة وكان ديlivered خلال electroporation. سوف ديكستران فلوري تكون قابلة للكشف عند الولادة في الدماغ المؤخر، وتمكين مجموعة من الجراء التي تم التلاعب بها آذان الداخلية خلال مرحلة التطور الجنيني (انظر 3.5).
  3. ري قرون الرحم مع وقارع الأجراس lactated. معاودة قرون الرحم في تجويف البطن. مسح تجويف الرحم مع 2-4 مل من prewarmed، حل رينغر lactated والسماح للفيضان إلى استنزاف للخروج من موقع على شق وثنى العقيمة. استبدال اللف مع مادة جافة ومعقمة. خياطة جدار البطن مع إبرة من غير قطع وخياطة 6-0 resorbable. نحن نفضل غرزة تشغيل، وتأمين كل غرزة أخرى، على جدار على حد سواء في منطقة البطن والجلد.
  4. تجف الفراء والسدود وتدير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات مثل Meloxicam عن طريق الحقن تحت الجلد. عودة السد إلى القفص انتعاش prewarmed على الستارة العقيمة. رصد وتسجيل التنفس والسدود، شق سالكية موقع، والمهبل لإفرازات دموية. النزيف هو التهاب المفاصل الروماتويديإعادة ولكن إذا كان الحاضر وبلا هوادة، الموت ببطء السد في حين انها لا تزال تحت تأثير التخدير. لاحظ الوقت الذي يستعيد وعيه ويحاول أن ambulate. عودة السد إلى مستعمرة الماوس عندما تظهر بوادر من الأكل والشرب وبدأت في بناء العش. عادة، يحدث هذا في غضون 12 ساعة.
  5. عند الولادة (يوم بعد الولادة 0)، وضع فلاش في منطقة الدماغ المؤخر من كل الجرو في القمامة للكشف عن ديكستران فلوري باستخدام مجهر stereofluorescence تشريح مع GFP أو تكساس مرشح الأحمر، حسب الاقتضاء. عودة إلى سد المرضعات فقط تلك الجراء التي تعرض العلامات الدماغ المؤخر.

4. ممثل النتائج

figure-protocol-7251
الشكل 1. تم حقن نقل Electroporation بوساطة الجينات إلى القوقعة النامية. otocyst E11.5 مع بروتين التعبير الترميز الخضراء المعززة البلازميد فلوري (EGFP) وelectroporated (نبض هيئة تنظيم الاتصالاتفي المعلمات: 5، 43 فولت والبقول بنسبة 50 ميللي ثانية / نبض و 950 ميللي ثانية تأخير interpulse). أ) ممثل الأذن الداخلية من يوم واحد بعد الولادة 6 (P6) الجرو الذي otocyst تم حقن وelectroporated في E11.5 يدل التعبير EGFP من القاعدة من خلال بدوره منتصف القوقعة. تمت إزالة الجدار الجانبي من القوقعة من مطلع الاوسط وقمة فقط. لم transfected الأسلاف E11.5 التي تؤدي إلى قمة. B) جبل الجامعة المناعية من القوقعة في (أ) مع الشعر علامة الخلية، الميوسين 7A (Myo7a)، يشير إلى أن التعبير EGFP يتبع مسار للجهاز كورتي ويكون موضعيا بشكل صارخ لظهارة الخلية الحاملة للشعر الحسية. ج) والأذن الداخلية ممثل من جنين E18.5 otocyst التي تم حقن وelectroporated في E11.5. إسقاط ليزر متحد البؤر يوضح التعبير EGFP في Myo7a إيجابية خلايا الشعر الحسية. D) ليزر متحد البؤر الإسقاط من ظهارة والحسية قوقعة من الجهاز E18.5 كورتي تشير EGFP expression في خلايا الشعر الداخلية (IHC)، خلايا الشعر الخارجي (OHC)، وخلايا phalangial الداخلية (IPC)، وخلايا عمود (PC)، وخلايا دايترس "(DC). شريط النطاق في (ب) ينطبق على (A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية الماوس النامية: الأذن الداخلية الماوس يطور من اللوحاء أذني خلال الأسبوع الأول من التنمية postimplantation 12،13. بعد يوم الجنينية 9.5 (E9.5)، فقد invaginated في اللوحاء وتحولت إلى حويصلة مملوءة بسائل يسمى otocyst 2. السلائف أذني في حويصلة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر هيومانا الصحافة للحصول على إذن لنشر تلفيق ماصة microinjection الرقم الذي ظهر أصلا في الصفحة 130 من مرجع 11؛ لاري Dlugas ستيفن وونغ، OHSU وزارة الاتصالات للتربية وللبالفيديو، لاري Dlugas لتصميم الفيديو والتحرير؛ آدم M. O 'كوين، مصمم مميز، Trion / Envirco لتصميم عادتنا تدفق رقائقي الأفقي غطاء محرك السيارة وغولدسميث ليه لتوفير التخطيطي التقنية؛ فيكتور مونتيروسو، MV، ماجستير، دكتوراه، وChatkupt توم، DVM، OHSU قسم الطب المقارن، للاسترشاد مع شركائنا حيوان بروتوكول الرعاية، والتقنيات الجراحية، ونظام وقائي للوعي، مارسيل بيريت، جنتيل، DVM، MS، لتبادل النشرات له على تقنيات خياطة البيطرية؛ إدوارد Porsov، MS، لتصميم لدينا برنامج Adobe Premiere Pro والفيديو المجهر محطة عمل الكمبيوتر، والأبيض وليا جوناس هينكلي من LNS السفلية (بورتلاند، أو). وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد القومي للصمم وآلات موسيقية أخرىص اضطرابات التواصل: DC R01 008595 و 008595-R01 العاصمة 04S2 (لJB) وP30 DC005983 (ولاية أوريغون السمع مركز البحوث الأساسية غرانت، بيتر جيليسبي، الباحث الرئيسي).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
الجزئي حالة تعقيم ROBOZ RS-9900a 8X8.5X1.25 بوصة
كرة ذات الرؤوس مقص أدوات العلم غرامة 14109-09
حلقة ملقط أدوات العلم غرامة 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
الملقط أدسون الأنسجة أدوات العلم غرامة 11027-12
إبرة سائق أدوات العلم غرامة 12502-12
حساسية الحقنة صينية بيكتون Dickison 305536
خاط 6-0 Syneture GL-889 0.7 خياطة المعدة والأمعاء متري
Lactated رينغر حقن USP باكستر 2B2323
سريع أخضر سيجما ألدريتش F7258
البورسليكات الزجاج الشعرية هارفارد جهاز 30-0053
Nembutal الصوديوم الحل الحفاوة شركة ادوية NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O فيشر العلمية M63-500
البروبيلين غليكول فيشر العلمية P355-1
الإيثانول سيجما ألدريتش E7023-500
Meloxicam بورنغير Ingeheim ندى 141-219
Micropipette بولير سوتر الآلات P-97 FB255B خيوط مربع؛ تشاور كتاب الطبخ الماصة من الصكوك سوتر
Microelectrode Beveler سوتر الآلات BV-10 104C القرص تجليف لماصات كبيرة، راجع دليل المالك لنظرية الميلا
Micropipette حامل نذير الآلات MP-S15T ل1.5mm ماصة القطر الخارجي والإناث ميناء الضغط لأنابيب Picospritzer.
ملاقط على غرار قطب كهربائي بروتك الدولية المحدودة CUY650P5 5 مم القطر الخارجي
مربع الموجة Electroporator بروتك الدولية المحدودة CUY21EDIT Footpedal الموصى بها
PICOSPRITZER الثالث باركر Hannifin 051-0500-900 Footpedal الموصى بها
التحكم اليدوي Micromanipulator هارفارد جهاز 640056
أفقي مقعد تدفق رقائقي نظيفة Envirco عرف تعديلات على 630-10554 LF. عرض معلومات تكميلية لالتخطيطي غطاء محرك السيارة.
لايكا stereofluorescence تشريح microcope مع محرك Lumencor ضوء SOLA بارتلز وبدينة وLumencor MZ10F مع محرك Lumencor ضوء SOLA ويوصى Footpedals لتركيز وMZ10F لتحريك محرك ضوء SOLA
اليكسا فلور 594 ديكستران إينفيتروجن D22913 10mg/ml، مائي
اليكسا فلور 488 ديكستران إينفيتروجن D22910 10mg/ml، مائي
بيئى DRI الراعي الاختصاص عنق الرحمالمتطلبات البيئية www.ssponline.com

References

  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
  4. Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
  5. Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
  6. Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
  7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
  12. Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
  13. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
  14. Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
  15. Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
  16. Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
  17. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).
  18. Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
  19. Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

64 otocyst electroporation microinjection transuterine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved