Method Article
و ذبابة الفاكهة غرفة البيض هو نموذج ممتاز لدراسة آليات توطين مرنا. من أجل التقاط أحداث الحيوية التي ترتكز عليها عمليات التعريب، مطلوب السريع التصوير عالية الدقة من الأنسجة الحية. هنا، نقدم بروتوكول للتشريح والتصوير من عينات حية بأقل قدر من الانقطاع.
حي التصوير الخلية هو أسلوب مهم ينطبق على عدد من الأنسجة ذبابة الفاكهة المستخدمة كنماذج للتحقيق في مواضيع مثل مواصفات المحور، تمايز الخلايا وتوالد 1. إعداد الصحيح للنماذج تجريبية هي الحاسمة، وغالبا ما تهمل، خطوة. الهدف من إعداد هو التأكد من ملاءمة الفسيولوجية وإلى إيجاد ظروف التصوير المثلى. للمحافظة على سلامة الأنسجة، وهذا أمر بالغ الأهمية لتجنب، نقص الأكسجة الجفاف، وتدهور أو ارتفاع درجة حرارة متوسطة 2.
غرفة البيض ذبابة الفاكهة هو نظام راسخ لدراسة المسائل ذات الصلة، ولكن ليس على سبيل الحصر، إلى تنميط الجسم، وتوطين مرنا وتنظيم هيكل الخلية 3،4. بالنسبة لغرف البيض في وقت مبكر، ومنتصف المسرح، وتصاعد في الهالوكربون النفط هو جيد للبقاء على قيد الحياة لأنه يتيح نشر خالية من الأكسجين، ويمنع الجفاف ونقص الأكسجة ولها خصائص بصرية رائعة للفحص المجهري. ايمالشيخوخة من البروتينات الفلورية هو ممكن من خلال إدخال الجينات المحورة في غرفة البيض أو حقن المادية من الحمض النووي الريبي وصفت، والبروتين أو الأجسام المضادة 5-7. على سبيل المثال، إضافة إلى البنى MS2 جينوم الحيوانات يتيح مراقبة الوقت الحقيقي من mRNAs في البويضة 8. هذه التركيبات تسمح في وضع العلامات المجراة من مرنا من خلال الاستفادة من التفاعل MS2 الحمض النووي الريبي عاثية حلقة الجذعية مع بروتين معطف 9 منه.
هنا، نقدم لبروتوكول لاستخراج المبيض وكذلك عزل ovarioles الفردية والغرف البويضة من ذبابة الفاكهة من الإناث. للحصول على وصف مفصل من الكرسي ذبابة الفاكهة oogenesis Spradling جيم ألان (1993، طبعة 2009) 10.
1. ذبابة الفاكهة التحضير المسبق للتشريح (وفقا لهاء Gavis، جامعة برينستون)
ملاحظة: بدلا من ذلك، بريميكس خميرة لصق في وعاء منفصل وإضافة إلى عجينة القارورة مع ملعقة.
2. ذبابة الفاكهة تشريح المبيض
3. عزل ovarioles
ملاحظة: كل مبيض يحتوي على حوالي 16 ovarioles تتكون من غرف بيضة 6 إلى 10 من المراحل المختلفة مرتبة مثل الخرز على الخيط 10.
ملاحظة: قبل عزل ovarioles، وضبط مصدر الضوء على مجهر تشريح حتى يتسنى للإضاءة الضربات بزاوية حادة للعينة. وهذا يعطي خلافا للعينة، ويسمح التصور من الدوائر مرحلة الشباب البيض.
ملاحظة: سيتم قطع ovarioles فردية بين مراحل الشباب (germarium لاستضافة 10) كما أقدم مراحل كبيرة جدا بحيث لا يمكن فصلها عن مبيض كامل.
ملاحظة: ثقب 1 البويضة مرحلة متأخرة مع لجنة التحقيق تشريح سيؤدي في السيتوبلازم تتسرب إلى جعل النفط واستخراج ovarioles الفردية صعبة للغاية. إذا تم ثقب البويضة مرحلة متأخرة، الانتقال إلى المبيض الطازجة.
ملاحظة: ومن المستحسن أن تشريح مبيض واحد من كل من الذباب عدة بدلا من تشريح كلا المبيضين أقل من الذباب لزيادة عدد ن من الذباب للتجربة.
ملاحظة: المعاملة الخشنة من ovariole سيؤدي في البويضات غير صحية ويمكن ان يؤدي الى القطع الاثرية في التجربة.
ملاحظة: سوف تبدأ البويضات لعرض التغييرات المظهرية بسبب التشديد على بعد 40 دقيقة يجري تشريح من المبيض (قارن 7E الشكل إلى F).
4. عزل الفرد البيض مرحلة متأخرة الغرف (وفقا لهاء Gavis، جامعة برينستون)
ملاحظة: ثقب بويضة في حين تشريح أواخر غرف بيضة المرحلة ليست كما يدين كما هو الحال مع تشريح أناndividual ovarioles لصغار مراحل.
ملاحظة: بالنسبة لغرف مرحلة البيض 14، استخدام الملقط لفهم الزوائد ظهري للتوجيه.
5. حقن إعداد
ملاحظة: للحصول على حقن البويضات مرحلة منتصف توجيه ovarioles عموديا على محور طويل من انزلاق الغطاء.
6. حقن من الحمض النووي الريبي فلوري
قبل البدء: إعداد جهاز الحقن والصغيرة تتلاعب هذه الضوابط أن يتم وضع إبرة حقن أكثر من مركز مجال الرؤية.
ملاحظة: في حال كنت تستخدم مرحلة الآلي مع قدرة نقطة زيارة فإنه من المستحسن للاحتفال كل مرحلة 8-9 البويضات للحقن قبل البداية. وهذا يسمح لزيارة سهلة وحقن البويضات المحدد.
ملاحظة: عملية حقن كله ينبغي أن تأخذ أقل من 10 ثانية عندما تنفذ على الوجه الصحيح. وطعن واسعة النطاق أو العالقة مع إبرة داخل البويضة لتسفر عن اضرار فادحة في غرفة البيض.
ملاحظة: إذا ارتكب خطأ في حين طريق الحقن، والانتقال إلى بويضة المقبل ملحوظ. لا تضيعوا الوقت على البويضات التالفة.
ملاحظة: قد تصبح إبرة انسداد أثناء جلسة حقن. في هذه الحالة، تحريك الإبرة المتاخمة لقطعة من الزجاج المكسور في مجال النفط على ساترة. خفة دمح من الزجاج وإبرة في طائرة التنسيق نفسه، والكبش بلطف الإبرة في زجاج (الشكل 6H). اختبار التي يتم unclogged الإبرة من خلال الضغط على زر الحقن ومعرفة ما إذا أي سائل يخرج من رأس الإبرة.
ملاحظة: إذا كان لفترة طويلة من الزمن قد انقضت بين العزلة غرفة البيض وحقن البويضة، البويضات سيكون من الصعب حقن وعرض التغييرات المظهري المرتبطة بالإجهاد. يمكن أن تنشأ قضايا مماثلة مع معالجة الخام من البويضة أو حقن كميات الزائدة (مقارنة أرقام 6I، J، K).
7. ويعيش تصميم التصوير التجريبي
8. ممثل النتائج
في المختبر توليفها اليكسا-546 grk RNA حقنها 1 Me31B :: GFP بيضة غرفة (7A الشكل). الحمض النووي الريبي يموضع إلى الأمامية الظهرية للبويضة، وتشكل غطاء حول النواة (7B الشكل). لمزيد من الأمثلة على توطين RNA رؤية ماكدوجال N.، وآخرون. (2003) 11.
ولا يمكن تصوير البويضات مرحلة منتصف وأواخر التعبير عن بروتين فلوري المسمى (تاو، GFP، الشكل 7C) أو أنظمة علامات الحمض النووي الريبي (grk * mCherry، الشكل 7D) من دون حقن.
الشكل 1.
= "jove_content">
الشكل 2.
الشكل 3.
الشكل 4.
الشكل 5.
الشكل 6.
الشكل 7.
حي التصوير الخلية هو فحص قوي لفحص العمليات الخلوية في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى المراقبة الميدانية بسيط مشرق، وبالإضافة إلى ذلك من تسميات فلوري إلى RNAs والبروتينات والاهتمام قد يؤدي إلى اختراقات كثيرة. هنا وقد أوجزنا بروتوكول للالبويضات التصوير المعيشة الفردية التي يمكن استخدامها في تركيبة مع فحوصات الجينية والبيوكيميائية.
في هذا البروتوكول، ونحن أيضا شرح كيفية التعامل مع التجربة الحية البويضات عن طريق الحقن. هناك احتمالات كثيرة للمادة لحقن، بما في ذلك في المختبر توليفها فلوري الحمض النووي الريبي وصفت لفحص قدرة هيكل الثانوي لتوطين RNA مباشرة (الكرة وديفيس، غير منشورة)، والأجسام المضادة التي تمنع وظيفة من البروتينات 6. والعمل في المستقبل على الارجح ادخال مكونات غيرها من العلامات والآلات الخلوية إلى البويضات المعيشة مما يمكن اختبار الآليات الجزيئية.
تي "> الحفاظ على سلامة وصحة الأنسجة أمر ضروري عند العمل مع الخلايا الحية. في هذا البروتوكول، ونحن نشير إلى عدد من الخطوات التي يمكن أن تؤدي إلى الإجهاد للغرفة البيض. على سبيل المثال، على الرغم من كونها متفوقة النفط للتصوير، يمكن للثقافة موسعة في مجال النفط أن تؤدي إلى التأكيد على غرفة بيضة. هذا يمكن رصدها بسهولة في ظل التعرض لمجال مشرق من خلال دراسة مورفولوجية النووية والموقف، وغشاء الخلية البيضية التي من شأنها أن تشوه وفقاعة تحت الضغط (قارن 7E الشكل (بهيج) لFigure7F ( وأكد)). المرحلة غرف بيضة 9 مشاهدة RNA الترجمة والحدود هجرة الخلية أكثر من 12 ساعات عدة. ومع ذلك، فإن مرحلة 7/8 غرفة بيضة ستبدأ في معرض الآثار السيئة في مجال النفط الكربون هالة بعد نحو 40 دقيقة من المبيض يتم إزالتها من ويمكن للإناث. بيضة في المرحلة المتأخرة الغرف، المرحلة 11 إلى 14 تتطور بشكل طبيعي سواء في النفط أو وسائل الإعلام مائي بسبب إفراز قشرة البيضة من الخلايا المسام في هذه المراحل 13. لقد كان الريبوrted أن إضافة الأنسولين والمتوسطة الحشرات المائية قادرة على المحافظة على مرحلة 9 البويضات لمدة تصل الى 6 ساعات 14 و germaria تصل إلى 14 ساعات و 15. في جميع الحالات، ينبغي تجنب المناورات العدوانية للغرفة البيض، كما أنه يؤكد على البويضات ويقلل من قدرتها على البقاء. التصوير أقل من البيض وغرف العناية لعلاج كل واحد بلطف أفضل وسيلة لضمان بقاء الأمثل.ليس لدينا ما يكشف.
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة ويلكوم ترست باحث أول لديفيس أولا.
وينبغي أن الأدوات المستخدمة في تشريح تكون نظيفة ولكن لا يجب أن تعقم. مسح الأدوات مع ETOH والسماح لهم لتجف قبل البداية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
غرامة فرشاة الدهان الرؤوس (فنانون السمور، جولة، حجم 00 أو 0) | متاح من معظم وسائل الفن الامدادات | فرشاة ذات نوعية جيدة من المهم | |
الهالوكربون منتجات الشركة، السلسلة 95 | الهالوكربون منتجات شركة، 887 Kinderkamack الطريق، نهر حافة NJ 07661 | الأوروبي الموزع: شركة فرنسة سولاوادي (شركة محدودة) تأكد من الأوكسجين من قبل فقاعات الهواء عن طريق النفط. | |
تغطية زلة لا. 1.5، 22 خ 50mm | دولي NO1-VWR القطة = 631-0137-22-50mm | منزل، جلاسر-22-40mm-400-070T MNJ | |
دومون No.5 - Dumostar | أدوات العلم غرامة | 11253-20 | "البيولوجيا" معلومات سرية هي أيضا جيدة لكنها هشة أكثر |
تشريح مسبار | أدوات العلم غرامة | 10140-01 | |
تشريح المجهر | أوليمبوس | SZ61 | |
CO2 وسادة | متاح من خلال http://www.flystuff.com / (A تقسيم العلمية جينيسي) | 59-114 (789060 Dutscher) | الأوروبي الموزع: Dutscher على شبكة الاتصالات العالمية. dutscherscientific. com / كما أنه من السهل نسبيا على مخصصة لبناء منصات الخاص ذبابة الخاصة |
KimCare | Kimbery كلارك، KimCare-الطبية مناديل | KLEW3020 | |
مجهر DeltaVision | التطبيقية الدقة | DC-CORE | |
Micromanipulator | Micromanipulators بيرلي من التجويف شركة مجموعة حيوية. 2260 Argentia الطريق، ميسيسوجا، أونتاريو، كندا L5N 6H7 | بيرلي PCS-5000 سلسلة، TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com / (Exfo سابقا) |
جهاز حقن | Tritech أبحاث، وشركة 2961 المخضرم افي لوس انجليس، كاليفورنيا 90064 | MINJ-1 | تعديل مع حامل لاتخاذ إيبندورف Femptotips |
حقن إبرة | إيبندورف العقيمة Femtotips الأول والثاني | 930000043 | نصائح مختلفة هي أفضل لتطبيقات مختلفة |
تحميل نصائح 20μl | إيبندورف | 5242956.003 | |
نشط خميرة جافة | فلايشمان الخميرة | # 2192 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved