اختبار الذيل تعليق

Summary

التحقق من صحة اختبار الذيل التعليق كإجراء تجريبي لتقييم نجاعة العلاج بالعقاقير المضادة للاكتئاب من في الفئران. وعلقت الفئران التي ذيولها لمدة ست دقائق ، ويتم تقييم الهروب السلوكيات ذات الصلة. نحن تصف الإجراءات المستخدمة في إجراء اختبار تعليق الذيل.

Abstract

اختبار تعليق الذيل هو اختبار الماوس سلوكية مفيدة في فحص العقاقير المضادة للاكتئاب المحتملة ، وتقييم التلاعب الأخرى التي يتوقع أن تؤثر على الكآبة السلوكيات ذات الصلة. وعلقت الفئران التي ذيولها مع الشريط ، في مثل هذا الموقف أنه لا يستطيع الهرب او الابقاء على الأسطح المجاورة. خلال هذا الاختبار ، وعادة في مدة ست دقائق ، وكميا السلوكيات الناتجة الهروب المنحى. اختبار تعليق الذيل هو أداة قيمة في اكتشاف دواء لسرعة عالية من المركبات المضادة للاكتئاب الفرز المحتملين. هنا ، نحن تصف التفاصيل المطلوبة لتنفيذ هذا الاختبار إضافية مع التركيز على المشاكل المحتملة التي قد تحدث وكيفية تجنبها. كما نقدم حلا لسلوك الذيل التسلق ، وهي مشكلة مشتركة ، الأمر الذي يجعل هذا الاختبار غير مجدية في بعض سلالات الفأر ، مثل استخدام على نطاق واسع C57BL / 6. على وجه التحديد ، فإننا منع تسلق الذيل السلوكيات عن طريق تمرير الماوس من خلال ذيول بلاستيكية صغيرةاسطوانة قبل التعليق. أخيرا ، فإننا بالتفصيل كيفية تسجيل يدويا السلوكيات التي تتجلى في هذا الاختبار.

Protocol

1. المواد

1. تعليق مربع

اختبار تعليق الذيل (تجارة الرقيق عبر الأطلسي) ، تتضمن تعليق الفئران فوق سطح الأرض عن طريق ذيولها. على أبسط المستويات ، فإن الإجراء لا يتطلب سوى تعليق أو شريط الحافة الرف ، والشريط. ومع ذلك ، ينبغي أن تنظر في استخدام المجرب للخلفية التي توفر النقيض الأمثل. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه من الحكمة لاتخاذ خطوات لمنع الفئران من مراقبة الحيوانات الأخرى التي يجري اختبارها. في مختبرنا ، ونحن نستخدم تصنيعها خصيصا مربعات تعليق خلفي (أربع ساعات يوميا ، بالتيمور MD) ، مصنوعة من البلاستيك مع أبعاد (55 X 60 ارتفاع العرض X العمق 11.5 سم). وذلك لمنع الحيوانات من مراقبة أو التفاعل بعضها البعض ، يتم تعليق كل فأر داخل المقصورة الثلاث الجدران الخاصة مستطيلة (55 X 15 ارتفاع العرض X العمق 11.5 سم). علق الماوس في منتصف هذا الحيز والعرض والعمق والحجم بما فيه الكفاية بحيث لا يمكن أن تجعل الماوس المشترك ntact مع الجدران. في هذا الإطار ، فإن المسافة التقريبية بين الأنف الماوس ، والكلمة هي جهاز 20-25 سم. هناك أربعة أقسام متطابقة من هذا القبيل في الجهاز مما يسمح لنا لاختبار four الفئران في وقت واحد. يتم وضع شريط الألمنيوم تعليق (1 سم. X ارتفاع 1 سم. العرض x 60 سم. طول) ، وتستخدم لتعليق كل ذيل الفأر ، على رأس منطقة الجزاء. وينبغي أن ينظر إلى الأبعاد التي نستخدمها في مختبرنا كمرجع عام. على سبيل المثال ، يمكن زيادة حجم المقصورات الفردية من مربع الذيل تعليق إذا تم استخدام سلالة كبيرة الماوس outbred (مثل CD - 1).

في الجزء السفلي من كل حجرة نضع علبة الألمنيوم للانفصال الذي يجمع البراز أو البول من الحيوانات. نستخدم المربع الرمادي الداكن للحيوانات البيضاء ومربع كريم ملون للفئران معطف من الألوان الأخرى. هذا الترتيب يتيح لنا أفضل وعلى النقيض من ذلك سجل السلوكية أكثر موثوقية للاختبار.

2. شريط

= "jove_content"> الشريط ينبغي أن تلتزم بإحكام ذيل الماوس على حد سواء وشريط التعليق ، وتكون قوية بما يكفي لتحمل الوزن من الفأرة التي يجري اختبارها (مثل نظم الوسم TimeMed ، المؤتمر الوطني العراقي ، الأزيز ريدج IL ، عرض 1.9 سم). ومع ذلك ، ينبغي أن لا يكون الشريط لزجة منذ مفرط في نهاية الدورة سيتم إزالته من الذيل. قص علينا شظايا 17 سم من الشريط ووضع علامة 2 سم من نهاية واحدة. وقد استخدم هذا الجزء سم 2 لربط الشريط إلى الذيل ، في حين استخدمت النسبة المتبقية البالغة 15 سم للتعليق الماوس.

3. مؤقت

4. جهاز تسجيل الفيديو

وهناك حاجة إلى كاميرا الفيديو وترايبود (أو غيرها من هيكل الدعم). منذ هذا الاختبار عادة ما ينطوي الحيوانات المتعددة التي يجري اختبارها في الوقت نفسه ، سوف يكون من الصعب العيش التهديف وينصح لا. ينبغي للكاميرا لتسجيل فيديو في مرحباغ القرار بما فيه الكفاية لتقديم صورة عالية الجودة التي سيتم استخدامها لاحقا لتسجيل السلوكية. دائما على يقين من أن هناك ما يكفي من الذاكرة في الكاميرا تسجيل قبل بدء الاختبار. علينا استخدام كاميرا الفيديو التي تسجل رقميا من دون استخدام وسائط مادية (أي شريط فيديو) ، والسماح لنقل مباشر من أشرطة الفيديو.

5. الأبيض ضجيج المولدات

ينبغي للضجيج المولدات قناع الأصوات البيئية على فترات متقطعة. ويوصى بصفة خاصة على استخدام ضجيج المولدات في بيئات المختبرات حيث يمكن سماع الأصوات العالية المفاجئة التي من شأنها أن باغت يحتمل الفئران. في غرفتنا التجريبية مستوى الضوضاء المحيطة (بدون ضجيج المولدات الأبيض تنشيط) هو حوالي 60 ديسيبل. إجمالي مستوى الصوت مع مولد ضوضاء بيضاء يمكنهم في الموقع حيث أجرى تجارة الرقيق عبر الأطلسي هو 70-72 ديسيبل. ومع ذلك ، ينبغي الإشارة إلى أنه يتم توفير هذه الأرقام على سبيل المثال فقط ، وينبغي لكل مختبر حدد مستويات الضوضاء الحق وفقا لبيئتها الفريدة والظروف.

6. مواد التنظيف

يجب أن تمحى مربع التعليق جيدا بعد كل دورة بمحلول التعقيم (مثل MB - 10 ، كويب مختبرات شركة ، ويلمنجتون ، دي ، أو ما شابه).

7. Climbstoppers (اختياري : يعتمد على السلالة المستخدمة)

قد الفئران من بعض الخلفيات ، مثل C57BL / 6 ، وتسلق ذيولها خلال الاختبار ^1. اسطوانات جوفاء واضحة (4 سم طول ، و 1.6 سم خارج القطر ، وقطره 1.3 سم داخل ، 1.5 غرام) التي قطعت على طول الطول الأربعة (بواسطة FourHourDay المؤتمر الوطني العراقي ، بالتيمور MD) من أنابيب البولي (# 8585K41 ، ماكماستر ، كار ، وسانتا في الينابيع ، كاليفورنيا) توضع حول ذيول الفئران لمنع تسلق مثل ذيل السلوك ^2،3. ويمكن إجراء هذه الأجهزة في أي مختبر مع الأدوات والمواد المشتركة.

2. الإجراءات السلوكية

> ينبغي أن التصميم العام التجريبية تعكس موازنة سليمة بين متغيرات محددة لتجربتك. على سبيل المثال ، في تجاربنا نحن نحاول أن تمثل كل مجموعة على قدم المساواة في كل دورة تجارة الرقيق عبر الأطلسي (أي ، إذا كان هناك مجموعات العلاج الأربعة ، وسيتم تمثيل كل في كل دورة). كما أن المواقف من الفئران يتم تناوب في هذه الطريقة التي يتم وضعها الفئران من كل مجموعة للعلاج في وضع مختلف في كل دورة.

1. وضع الكاميرا في الموقف. يجب أن تكون الكاميرا قريبة قدر الإمكان من أجل الحصول على أعلى دقة ممكنة من هذه الحيوانات.
2. ينبغي قطع الشريط شظايا التي سيتم استخدامها خلال الدورة ، وضوحا ، والتي أعدت للدورة.
3. بدء مولد ضوضاء بيضاء ، إذا المستخدمة ، قبل أن يتم عرض الفئران الى غرفة الاختبار. ينبغي أن يكون مستوى الضوضاء البيضاء إلا ما يكفي لإخفاء الضوضاء الخارجية. تجنب ارتفاع حجم وتأكد من استخدام نفس مستوى الضوضاء البيضاء لجميع الحيوانات.
4. جلب من طراز ANimals إلى غرفة الاختبار. إذا كانت الغرفة التي تتواجد الحيوانات وغرفة اختبار المجاورة لبعضها البعض مع الظروف المحيطة مماثلة ، قد لا يكون من الضروري فترة تأقلم. خلاف ذلك ، ومكان للحيوانات في قاعة الاختبار لفترة تأقلم (عادة ما لا يقل عن ساعة واحدة). أن ندرك أن الحيوانات الأخرى وضعت في غرفة واحدة يمكن الشعور العظة الشمية وبالموجات فوق الصوتية.
5. إذا كان يتم استخدام سلالة معروفة لتسلق ذيولها ، مثل C57BL6 / J ، Climbstoppers مكان حول ذيول قبل تطبيق الشريط.
6. تلتزم الشريط لذيول الفئران. استخدام ملحوظ في نهاية الشريط والتأكد من الشريط العصي في الذيل ويعود على نفسه. وينبغي تطبيق الشريط إلى نهاية جدا من الذيل مع 2-3 ملليمتر من الذيل المتبقية خارج الشريط.
7. مرة واحدة ويرد كل قطعة من الشريط إلى ذيل الماوس عصا الجزء الأوسط من الشريط على الجدران الداخلية للقفص. وهذا سيساعد على منع صراعا من قطع الشريط إلى بعضها البعض. علما بأن جقد onfinement في هذا الشكل يسبب التوتر وأنه من المهم لإتمام عملية تطبيق الشريط إلى كل حيوان في أقرب وقت ممكن.
8. حالما يتم تطبيق كافة الشريط ، بدء التسجيل والتعرف على الدورة قبل أن يتم تعليق الفئران.
9. تعليق الحيوانات عن طريق وضع نهاية خالية من الشريط على شريط تعليق أو الرف في أمر أن يوازن بين مجموعات العلاج. تعليق الفئران بطريقة لا تعيق هو عرض الكاميرا لأنه سيتم سجل TST الدورة بأكملها وعرقلة الكاميرا سوف يؤدي إلى عدم القدرة على تقييم السلوك خلال تلك الفترة. تأكد من أن جميع ينتهي الشريط معلقة موازية للشريط تعليق أو الجرف بطول مماثل من الركود لكل الماوس.
10. في نهاية الدورة (وهو عادة ست دقائق) ، وعودة الحيوانات إلى homecage وإزالة الشريط بعناية من كل ذيل من خلال سحب بلطف تشغيله. لا مزق الشريط من الذيل منذ ذلك قد يسبب الألم لهيئة التصنيع العسكريه.
11. بعد عودته الى غرفة الفئران مستعمرتهم تجاهل بولي البراز والبول من الأدراج جمع ومسح الجهاز بمحلول التعقيم.

3. تحليل السلوك

1. عموما ، وتجارة الرقيق عبر الأطلسي هو من البداية وحتى النهاية بست دقائق في الطول. خلافا لإجراء آخر فعالية مضادات الاكتئاب تستخدم على نطاق واسع ، واختبار السباحة القسري ، وسجل في الدورة بأكملها. هذا يرجع الى العام وجدت أن الفئران التي تميل إلى الجمود الظاهر في وقت سابق من تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
2. نحن في مختبرنا تحميل ملفات الفيديو مباشرة من الكاميرا إلى جهاز الكمبيوتر حيث يتم إجراء التحليل.
3. خلال التحليل السلوكي في الوقت الذي تنفق كل الماوس كما يقاس المحمول. في حين أنه من الممكن لقياس الوقت الجمود مباشرة ، وجدنا أنه من الأسهل للكشف وقياس تحركات نشطة بدلا من عدم وجود مثل هذه الحركات.
4. وأهم جانب من جوانب التحليل السلوكي تجارة الرقيق عبر الأطلسي هو تحديد ثابت لحركةق التي يتم تسجيلها كما تنقل بحسن نية. الفئران ، وخصوصا في بداية الدورة ، والسلوكيات التي تظهر بشكل علني هروب ذات الصلة. وتشمل هذه محاولة للوصول إلى الجدران لجهاز التعليق وشريط ، والهز الشديد من الجسم ، وحركة أطرافه أقرب إلى تشغيل. هذه الحركات تشكل بوضوح التنقل. هذه السلوكيات ثم تهدأ وتصبح أكثر دهاء. في مختبرنا الحركات الصغيرة التي تقتصر على الأرجل الأمامية ولكن من دون المشاركة في الساقين الخلفيتين ليست محسوبة على الحركة. بالإضافة إلى ذلك ، والتذبذبات البندول يتأرجح مثل هذا ومن المقرر أن الزخم الذي تحقق خلال نوبات التنقل في وقت سابق أيضا ليست محسوبة على الحركة.
5. في مختبرنا نستخدم ساعة توقيت البرامج التي تظهر على الشاشة لقياس الوقت (Xnote ساعة التوقيت ، وdnSoft مجموعة بحوث). وتستخدم اثنين ساعات الوقف منفصل على الشاشة. ساعة توقيت first العد التنازلي من 360 ثانية ، وينبه المراقب عند فترة التحليل السلوكي الغايات. وستو secondpwatch التي تسيطر عليها من خلال التدابير ، المراقب من الوقت الذي يقضيه المحمول. ساعة توقيت بعض البرامج لديها القدرة على تعيين مفاتيح لتشغيل وإيقاف الوظائف ، بحيث تظهر على الشاشة لوحة المفاتيح يمكن السيطرة على ساعة توقيت. بدلا من لوحة المفاتيح العادية ، ونحن نستخدم جهاز إدخال المعروف باسم "gamepad" للسيطرة على ساعات الوقف.
6. إذا كان هناك أكثر من واحد والحاضر اختبار الماوس على الشاشة هو فكرة جيدة لتغطية الحيوانات الأخرى بحيث تحركاتهم ولن يصرف المراقب. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام برنامج أو نافذة أخرى من خلال تغطية جسديا الفئران الأخرى التي تظهر على الشاشة مع ورقة.
7. قد يكون هناك بعض التحيز الذي يحدث إذا كان المبلغ الإجمالي من الوقت المنقضي التنقل للماوس خاصة مرئيا قبل الانتهاء من دورة التحليل. إذا تم استخدام ساعة توقيت على الشاشة ، فإننا نقترح لتغطية جميع ولكن ميلي ثانية واحدة من عشرى ساعة الإيقاف. من خلال تغطية المراقب ساعة توقيت وحده يعلم ما إذا كانت ساعة الإيقافأو إيقاف تشغيله في أي وقت ولكن لا يعرف الوقت الإجمالي المنقضي ، وبالتالي لا يمكن أن تتأثر بأي تحيز. باستخدام هذا النهج المراقب ، في حين العمياء للتعيينات مجموعة من الحيوانات ، لن يكون فكرة عامة عن مستوى القدرة على الحركة في كل حيوان.
8. وينبغي إجراء اختبار الموثوقية بين الفاحصين لكل مراقب جديد قبل البدء في جمع بيانات من حيوانات الاختبار. في مختبرنا كل مراقب الساعات الجديدة أولا المراقب من ذوي الخبرة في حين كان هو أو هي التهديف. بعد المراقبين جديدة للحصول على ثقة بما يكفي لتمييز الحركة من الجمود ، فهي علامة ثم في الوقت الحقيقي مع المراقب يراقب والخبرة لافتا إلى أي أخطاء. بمجرد الانتهاء من هذه المرحلة بنجاح ، فإن مراقبين جدد تحليل مجموعة محددة من أشرطة الفيديو تجارة الرقيق عبر الأطلسي التي نحتفظ بها في مختبرنا لأغراض التدريب. إلا بعد الحصول على درجة عالية من الارتباط بين الفاحصين مع المراقب خبرة لا محقق تحليل أشرطة الفيديو من تجارة الرقيق عبر الأطلسي الفعليةالتجارب. نحن أرشفة البيانات من هذه التحليلات التدريب لتشكل المعيار الداخلي للمختبر. وقد لاحظنا الفروق بين السلالات في الطريقة التي يعبرون عن التنقل (والجمود) السلوكيات ، ومتوسط ​​الوقت الجمود بين الجنسين. عندما يتم اختبار ماوس السلالة ، أو الجنس ، أو معدلة وراثيا نموذج جديد في المختبر من الضروري القيام مرة أخرى هذا النوع من التحليل الموثوقية.

4. ممثل النتائج

لقد اعتدنا على تجارة الرقيق عبر الأطلسي لتقييم المضادة للاكتئاب مثل الاستجابات لمعالجة الليثيوم في سلالات مختلفة الفأرة (الشكل 1) ^3. وتنشر تفاصيل التجريبي لهذه التجربة في وآخرون هل بن. ، 2011 ^3.

الشكل 1. الجمود في الوقت الذيل تعليق بعد اختبار ادارة الليثيوم المزمنة في خمس سلالات الفطرية الماوس. وكانت مجموعة الفئران منزلد ، وأربعة الفئران في قفص. تلقت الفئران في مجموعة العلاج الليثيوم الليثيوم طعام يحتوي على 4 جم / كجم LiCl لمدة ثلاثة أسابيع. تلقى الحيوانات مراقبة الأغذية متطابقة دون كلوريد الليثيوم. ** : P <0.01 ، *** : P <0.001 دلالة على ، مزاوج هامة اختبار t. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM. ن :10 - 12 حيوانات في كل مجموعة عن كل سلالة. (الشكل مستنسخة من ^3).

في هذا المثال ، لوحظ تأثير كبير في علاج الليثيوم المزمنة في تسليم المواد الغذائية فقط في سلالات C57BL/6J وDBA/2J. في السلالات الثلاث الأخرى ، لم يلاحظ أي انخفاض ملحوظ إحصائيا في الوقت الجمود. هذه المعطيات تشير إلى أن رد فعل مضاد للاكتئاب مثل الليثيوم لعلاج المزمن هو سلالة تعتمد كما لوحظ أيضا مع غيرها من الأدوية المضادة للاكتئاب ^4-8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تطوير تجارة الرقيق عبر الأطلسي التي Steru آخرون تأثر ⁹ من الاختبار التي سبق وضعها السباحة القسري ^10-12. يتم وضع مماثل لاختبار السباحة القسري ، وتجارة الرقيق عبر الأطلسي في الفئران في وضع لا مفر منه ولكن باعتدال المجهدة. ويعتبر عدم وجود سلوك الهروب المتعلق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials