الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Summary

الكروماتين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) هو وسيلة ل من جديد الكشف عن التفاعلات لونين، لفهم أفضل للتحكم النسخي.

Abstract

ويتم تنظيم الجينوم في هياكل ثلاثية الأبعاد، واعتماد العليا التشكل داخل المساحات ميكرون الحجم النووية ^{7، 2، 12.} أبنية هذه ليست عشوائية وتنطوي على التفاعل بين الجينات والمروجين العناصر التنظيمية ^13. الربط من عوامل النسخ متواليات التنظيمية ليجلب محددة شبكة من تنظيم النسخ والتنسيق ^{1، 14.}

وقد وضعت لونين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لتحديد هذه الهياكل العليا لونين ^5،6. يتم إصلاح الخلايا ويتم التقاطها بواسطة التفاعل المكاني التساهمية DNA البروتين الروابط المتبادلة. للحد من الضوضاء غير محددة والحد من التعقيد، وكذلك لزيادة خصوصية تحليل التفاعل لونين، لونين مناعي يستخدم (رقاقة) ضد العوامل المحددة لتخصيب البروتين شظايا لونين من الفائدة قبل ربط القرب. ربط تنطوي نصف linkers تشكل في وقت لاحق الروابط التساهمية بين أزواج من شظايا الحمض النووي المربوطة معا ضمن مجمعات لونين الفردية. تقييد انزيم مواقع MmeI المرافقة في linkers نصف تسمح استخراج المقترنة يبني مجتمع طلال أبوغزاله للرابط، علامة النهاية (الحيوانات الأليفة) على الهضم MmeI. كما هي المعقدة البيروكسيديز وlinkers نصف، وتنقية هذه التركيبات PET باستخدام streptavidin المغناطيسي الخرز. وligated الحيوانات الأليفة تنقيته مع محولات الجيل القادم التسلسل وفهرس للشظايا التفاعل يتم إنشاؤها عن طريق الجيل المقبل من التعاقب مثل الجينوم محلل البورشيد. ثم يتم تنفيذ رسم الخرائط وتحليل المعلومات البيولوجية للتعرف على رقاقة التخصيب ملزمة المواقع ورقاقة التخصيب التفاعلات ونين ^8.

لدينا انتاج شريط فيديو لإثبات الجوانب الحاسمة للبروتوكول شيا-PET، وخاصة إعداد شريحة ونوعية المعالج تلعب دورا رئيسيا في نتائج مكتبة شيا-PET. كما البروتوكولات هيطويلة جدا، وتظهر فقط الخطوات الحاسمة في الفيديو.

Protocol

A. الكروماتين مناعي (رقاقة) (انظر الشكل 1)

1. يشابك المزدوج من الكروماتين ملزمة البروتينات وحصاد الخليوي

(في الساعة 02:10 من الفيديو)

لونين مناعي (رقاقة) هو الخطوة الأولى الحاسمة المشاركة في بناء مكتبة شيا-PET. هذه الخطوة مهمة للحد من مستوى الضوضاء الخلفية التعقيد، وإضافة نوعية. وإعداد شريحة تحتاج إلى أن يكون الأمثل لنوع من الخلايا وعامل في المصالح. ويستند هذا البروتوكول على مكتبة البلمرة RNA-PET شيا II أعدت من خلايا MCF-7 ⁹ شيدت في مختبرنا. لضمان أن المكتبة الناتج هو من التعقيد ما يكفي، ونحن نوصي باستخدام 1 × 10 ⁸ خلايا لإعداد المواد رقاقة. اعتمادا على خط الهدف والخلية، ويمكن الحصول على العائد يكون بين 100 إلى 300 نانوغرام نانوغرام. من المستحسن أن يجب استخدام الحد الأدنى من 100 نانوغرام رقاقة للمشاركةnstruct مكتبة شيا-PET مع دورات PCR أقل من 20 لتقليل التكرار خلال التسلسل. سوف كميات أكبر من المواد رقاقة تسمح للمزيد من التخفيضات في التكرار، وتحسين نوعية المكتبات.

1. التخزين المؤقت غسل 1 × 10 ⁸ خلايا MCF-7 (ما يعادل خمس لوحات 500 ² سم مربع من 2 × ⁷ خلايا 10) مرتين مع الفوسفات المالحة (PBS) قبل تحسنت في 37 ° C.
2. تشعبي MCF-7 1.5 مم مع الخلايا الطازجة EthylGlycol مكررا (SuccinimidylSuccinate) (EGS)) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (22 ° C) مع التناوب في غطاء الدخان الكيميائي.
3. إضافة الفورمالدهيد 37٪ لتركيز النهائي من 1٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (22 ° C) مع التناوب في غطاء الدخان الكيميائي.

4. إخماد crosslinkers بإضافة 2 M جليكاين إلى تركيز النهائي من 200 ملم. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة(22 ° C) مع التناوب.

5. تجاهل crosslinkers مروي في قارورة النفايات وغسل الخلايا مرتين مع PBS الباردة.
6. تجاهل PBS الحصاد والخلايا عن طريق كشط. حصاد حفاظ على الخلايا على الجليد. شطف مع لوحة PBS 5ml (مع مثبطات الأنزيم البروتيني ("+ PI") وأضاف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لتعظيم مجموعة من الخلايا.
7. بيليه الخلايا عند 1،800 XG (3،000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، والشروع في تحلل الخلايا. بدلا من ذلك، تخزين بيليه في -80 ° C.

2. انحلال الخلايا

(في 04:15 من الفيديو)

1. إعادة تعليق بيليه في 15 مل 0.1٪ SDS العازلة يزيس (HEPES 50 مم pH7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، EDTA 1 ملم، تريتون 1٪ X-100، 0.1٪ Deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ SDS + PI) بشكل دقيق من قبل pipetting. تدوير لمدة 15 دقيقة في C. ° 4
2. بيليه الخلايا هي lysed في 800 ×ز (2،000 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
3. تجاهل طاف وتحلل الخلايا وكرر مرة واحدة في خطوة 2.1 و 2.2.
4. المعزولة النووية بيليه مستعد لتحلل النووية. بدلا من ذلك، مخزن بيليه في -80 ° C.

3. يزيس النووية

(الساعة 05:00 من الفيديو)

يتم تنفيذ تحلل النووية للافراج عن لونين لونين crosslinked قبل التجزئة. في حالة عدم وجود الغشاء النووي، يمكن sonicated لونين crosslinked باستخدام ألطف الأحوال. في بعض الأحيان، وقوة صوتنة قد لا تكون كافية لتفريق الغشاء النووي في هذه الحالة، سيتم الحصول على أقل ونين لأنه سيتم تجاهل نواة سليمة بعد الطرد المركزي. ومع ذلك، قد تحتاج إلى أنواع مختلفة من الخلايا ظروف مختلفة.

1. إعادة تعليق بيليه نواة معزولة في 15 مل 1٪ SDS العازلة يزيس (50 ملم HEPES pH7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، EDTA 1 ملم، 1٪ تريتون X-100، الصوديوم 0.1٪ Deoxycholate، 1٪ SDS + PI). نقل نوى التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة (أوك ريدج أنبوب الطرد المركزي (البولي بروبلين)) وتناوب لمدة 15 دقيقة في C. ° 4
2. بيليه بيليه نواة هي lysed في 47810 XG (20،000 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في C. ° 4
3. صب طاف بيليه وانقطاع مع طرف ماصة P1000.
4. غسل بيليه مع 30 مل 0.1٪ SDS العازلة يزيس (+ PI).
5. تدوير لمدة 15 دقيقة في C. ° 4
6. بيليه لونين في 47810 XG (20،000 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في C. ° 4
7. تجاهل طاف وتكرار غسل مرة واحدة في خطوة 3،4 حتي 3،6 قبل الشروع في تجزئة لونين. بدلا من ذلك، مخزن لونين بيليه في -80 ° C.

4. تجزئة الكروماتين

(في 07:03 من الفيديو)

1. نقل الكروماتين بيليه لجولة البوليسترين 14 مل أنبوب اختبار القاع.
2. إضافة 1 مل 0.1٪ SDS يزيس العازلة (+ PI) إلى المؤسسة العامة لونينllet. ضمان عدم وجود فقاعات في الخليط وهذا سوف يؤثر على كفاءة صوتنة.
3. القص الكروماتين DNA إلى حجم من أزواج قاعدة 200 حتي 600 مع برانسون الرقمية ديسروبتر الخلية Sonifer (السعة 35٪ و 9 دقائق (30 ثانية على، 30 ثانية عن)) والحفاظ على عينات الباردة في جميع الأوقات لمنع الانهاك قبل تنفيذ صوتنة في غرفة باردة (انظر الشكل 2).
4. عكس تشعبي على قسامة من لونين وتحقق الكفاءة تجزئة مع الخطوات التالية. (لا تظهر الخطوات التالية في شريط الفيديو).
   • قسامة 10 ميكرولتر من لونين بعد صوتنة.
   • sonicated الطرد المركزي لونين في 16110 XG (13200 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في C. ° 4
   • نقل طاف لأنبوب جديد وإضافة 2 ميكرولتر من محلول K بروتين.
   • احتضان لمدة 30 دقيقة عند 50 ° C.
   • حل العكسية crosslinked لونين على هلام الاغاروز 1.5٪.
   • Repeaر صوتنة إذا أحجام DNA تكون أكبر مما كان متوقعا.
5. أجهزة الطرد المركزي في 16110 المحللة المتبقية XG (13200 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل sonicated لونين (طاف) في أنبوب جديد قبل preclearing مع الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك، sonicated متجر لونين في -80 درجة مئوية حتى يتم جمع لونين كافية لبدء المعالج.

5. غسل، وطلاء Preclearing من الأجسام المضادة لالخرز

(الساعة 08:17 من الفيديو)

1. Preclearing من الكروماتين
   1. 300 ميكرولتر من استخدام الخرز المغناطيسي G بروتين واحد IP.
   2. يغسل ثلاث مرات مع 5 حبات الخرز مل العازلة غسل (PBS، 0.1٪ تريتون X-100). وهذا المستقبل يغسل تشمل البروتين المغناطيسي الخرز G تتكون من الخطوات التالية. ضمان الخرز المغناطيسي لا تجف.
      • استعادة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف.
      • Discard طاف.
      • إعادة تعليق الخرز مع العازلة.
      • تدوير لمدة 5 دقائق في C. ° 4
      • أجهزة الطرد المركزي في XG 129 (800 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      • استعادة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف.
      • تجاهل طاف.
   3. الجمع بين لونين sonicated مع الخرز prewashed، لإزالة خلفية من لونين ملزمة لالخرز.
      • إبقاء 10 ميكرولتر من لونين sonicated باسم "الإدخال" لتخصيب الاختيار اللاحقة التي PCR الكمي (qPCR). تخزين في C. ° 4
   4. تدوير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية
   5. sonicated الطرد المركزي لونين في XG 129 (800 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة في C. ° 4
   6. وضع أنبوب المكثف على الجسيمات المغناطيسية.
2. طلاء جسم لالخرز المغناطيسي
   1. قسامة 300 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي G البروتين لأنبوب جديد.
   2. يغسل ثلاث مرات مع الخرز 5ml الاحتياطي اغسل الخرز (PBS، 0.1٪ تريتون X-100).
   3. إضافة وحدة تخزين ما يعادل (كخطوة 5.1.3) من الاحتياطي اغسل الخرز.
   4. إضافة 35 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (8WG16) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
   5. تدوير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية
   6. غسل الأجسام المضادة المغلفة الخرز مرتين مع 5 مل العازلة غسل الخرز.
   7. استعادة الأجسام المضادة المغلفة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف.

6. لونين مناعي

(الساعة 10:03 من الفيديو)

للحد من مستوى التعقيد والضوضاء الخلفية، وتستخدم الأجسام المضادة ضد العوامل المحددة لتخصيب البروتين شظايا محددة من لونين الفائدة قبل ربط القرب ^6.

هنا، استخدمنا بوليميراز RNA الماوس وحيدة النسيلة IIالأجسام المضادة (8WG16) التي اعترفت شكل الشروع في البروتين. بواسطة شظايا الحمض النووي تخصيب التي ترتبط مع RNA بوليميراز الثاني، والنوعية للمكتبة ويمكن زيادة، مما يتيح تحديد التفاعلات ونين بعيدة المدى بين المروجين بالموقع والمناطق التنظيمية المقابلة ^9.

1. تجاهل غسل العازلة من الأجسام المضادة المغلفة الخرز مع مساعدة من الجسيمات المغناطيسية المكثف.
2. sonicated نقل لونين (طاف من الخطوة 5.1.6) مع مساعدة من الجسيمات المغناطيسية المكثف لجسم المغلفة الخرز (من الخطوة 5.2.7).
3. تدوير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية

7. غسل وشطف من مجمعات البروتين DNA-Immunoprecipitated

(في 11:13 من الفيديو)

1. غسل الكروماتين immunoprecipitated حبات ثلاث مرات مع 5 مل 0.1٪ SDS العازلة يزيس.
2. يغسل مرة واحدة مع الخرز 5 مل العازلة عالية الملح اغسل (50 درجة الحموضة 7.5 ملي HEPES، 350 مم كلوريد الصوديوم، EDTA 1 ملم، 1٪ تريتون X-100، Deoxycholate الصوديوم 0.1٪، 0.1٪ SDS).
3. يغسل مرة واحدة مع 5 حبات العازلة ليثيوم كلوريد غسيل مل (10 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 250 مم LiCl، 1 ملم EDTA، 0.5٪ Nonidet P-40، Deoxycholate الصوديوم 0.5٪).
4. تجاهل غسل العازلة إعادة تعليق غسلها والخرز مع 1 مل العازلة TE.
5. تدوير لمدة 5 دقائق في C. ° 4 العينة على استعداد لتحديد الكميات ورقاقة الاختيار تخصيب اليورانيوم. مرة واحدة تم جمعها كافية المواد رقاقة، العينة جاهزة للبناء في مكتبة شيا-PET. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية، ويجب القيام به لضمان نجاح بناء مكتبة شيا-PET. قد يتم تخزين رقاقة الخرز التخصيب لمدة تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية في حين يخضع تحديد الكميات والشيكات تخصيب رقاقة، وتراكم المواد كافية.
   1. أزل وعكس تشعبي-"الإدخال" DNA والخرز رقاقة التخصيب مع الخطوات التالية. (لا تظهر الخطوات التالية في شريط الفيديو.)
      • أزل 20٪ من رقاقة التخصيب مع 200 ميكرولتر الخرز رقاقة العازلة شطف (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 10 ملي EDTA، 1٪ SDS). تدوير لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. أجهزة الطرد المركزي في 6100 مزال الخرز XG (800 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المجمعات رقاقة مزال (طاف) إلى أنبوب جديد مع مساعدة من الجسيمات المغناطيسية المكثف.
      • مجمعات رقاقة عكس تشعبي "المدخلات" ومزال مع 2 ميكرولتر K بروتين (تركيز النهائي من 0.2 جم / مل) لمدة 2 ساعة في 50 ° C.
      • نقل العكسية crosslinked "الإدخال" DNA الحمض النووي ومزال رقاقة الكثافة إلى 2 مل عالية MaXtract (على التوالي). أضف 200 ميكرولتر 25:24:1 الرقم الهيدروجيني الفينول كلوروفورم كحول أيزو أميلي-7.9 إلى الأنابيب في غطاء الدخان الكيميائي وقلب لتخلط جيدا. تدور الأنابيب لمدة 5 دقائق في 16110 XG (13200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      • نقل إلى المرحلة المائية العلوي أنبوب جديد ويعجل عكس crosslinked الطرافة DNAH 20 ميكرولتر الصوديوم M 3 درجة الحموضة 5،5 خلات، 200 ميكرولتر الأيزوبروبانول و 1 ميكرولتر 15 ملغ / مل Glycoblue. احتضان في C ° -80 لمدة 30 دقيقة وDNA بيليه لمدة 30 دقيقة في XG 16110 (13200 دورة في الدقيقة) في C. ° 4
      • بعد الطرد المركزي من DNA عجلت الأيزوبروبانول، وغسل DNA بيليه مع الايثانول الجليد الباردة 75٪ مرتين و resuspend بيليه DNA في 20 ميكرولتر العازلة TE.
   2. Quantitate "الإدخال" DNA (من الخطوة 5.1.3) ورقاقة الحمض النووي عن طريق فحص picogreen ^10.
   3. إجراء فحص PCR عن طريق تخصيب النوعية (qPCR).

B. تحليل التفاعل الكروماتين باستخدام المقترنة النهائيين تسلسل الدلالية (شيا-PET)

والنصف الثاني من الفيديو تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية في بناء مكتبة شيا-PET.

1. نهاية إحباط شظايا الحمض النووي رقاقة

هذا الفصل من الفيديو على قضيتي منقطة العين، إجراء خطوة بخطوة من الخرز المغناطيسي الغسيل لإزالة الأنزيمات والملح التخزين المؤقت للتفاعل السابقة (الخطوة 1.1، 12:22 حتي 12:54 من الفيديو) وإجراءات إنشاء التفاعلات الأنزيمية التي تنطوي الخرز المغناطيسي في خليط التفاعل (الخطوة 1.2، 12:54 حتي 13:25 من الفيديو).

1. غسل رقاقة الخرز التخصيب مرة واحدة مع العازلة TE الجليد الباردة. وهذا المستقبل يغسل تشمل الخرز المغناطيسي تتكون من الخطوات التالية.
   • أجهزة الطرد المركزي في 6100 x ج (800 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   • استعادة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف.
   • تجاهل طاف.
   • إضافة إلى المخزن المؤقت الخرز.
   • خلط الخرز مع العازلة عبها العمل.
   • أجهزة الطرد المركزي في 6100 x ج (800 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   • استعادة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف.
   • تجاهل طاف.
2. لملء في overha sonicatedNGS، إعداد سيد مزيج الاحتياطي مع 70 ميكرولتر × 10 لالبلمرة DNA T4 و 7 ميكرولتر dNTPs ملي 10 و 615،8 ميكرولتر المياه نوكلياز خالية. مزيج دقيق و resuspend الخرز غسلها مع مزيج ماجستير. إضافة ميكرولتر 7،2 9،7 U / ميكرولتر بوليميراز DNA T4 إلى الحجم النهائي من 700 ميكرولتر. خلط واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التناوب (باستخدام التكنولوجيا الحيوية Intelli-Palico خلاط RM-2L، F8، دورة في الدقيقة 30، U = 50، ش = 60). ردود الفعل اللاحقة أداء جميع الأنزيمية مع الخطوات التالية.
   • تمييع مخازن التفاعل مع نوكلياز خالية المياه.
   • إضافة كافة الكواشف الأخرى (باستثناء الإنزيمات) إلى المخزن المؤقت المخفف.
   • مزيج دقيق. إعادة تعليق الخرز / بيليه مع مزيج التفاعل.
   • إضافة إلى إنزيم الخرز معلق / بيليه (حافظ على برودة مربع على الانزيمات الفوق في جميع الأوقات لضمان أقصى قدر من النشاط الأنزيمي).
   • ختم الأنبوب مع parafilm.
   • ضمان الخرز بشكل جيد في جميع أنحاء مختلطة incubatio كاملن.
3. تجاهل خليط التفاعل ويغسل الأملاح العازلة المتبقية والانزيمات ثلاث مرات مع العازلة غسل الجليد الباردة (10 ملي تريس، الكلور درجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم).

2. ربط المعقدة البيروكسيديز من Linkers نصف لرقاقة الحمض النووي

هذا الفصل من الفيديو يسلط الضوء على خصائص أليغنوكليوتيد] نصف رابط المستخدمة في بناء شيا-PET واستخدام الباركود تكوين النوكليوتيدات للتمييز بين المنتجات ربط غير محددة ومعينة (13:28 حتي 14:24) من فيديو). الفصل كما يظهر الإجراء خطوة بخطوة إنشاء رد فعل ربط نصف رابط (الخطوة 2.2، 14:24 حتي 15:54 من الفيديو).

يتم تقديم نوعين من نصف المعقدة البيروكسيديز linkers في هذا البروتوكول، وهي مصممة مع الباركود الداخلية من أربعة النيوكليوتيدات (TAAG أو ATGT) وموقع الاعتراف لنوع IIS تقييد MmeI انزيم (TCCAAC). بعد رقاقة إثراءمنة، sonicated تنقسم بالتساوي شظايا لونين إلى قسمين مأخوذة وligated الأولى مع وجود فائض من B إما نصف أو نصف رابط A-رابط ^5،9.

1. تقسيم رقاقة الخرز التخصيب إلى قسمين مأخوذة عن نصف رابط ربط الحمض النووي عن طريق المعقدة البيروكسيديز linkers نصف أو نصف A-B linkers على التوالي. هذين نصف linkers يكون تسلسل النوكليوتيدات نفس، باستثناء أربع دول في وسط النيوكليوتيدات التي تخدم (A نصف رابط مع TAAG؛ نصف رابط مع ATGT B) كما الباركود النوكليوتيدات. عند دمجها خلال ربط القرب، وعمليات ربط عشوائي غير محددة بين مجمعين شرائح مختلفة يمكن تحديدها من سكان متواليات مع linkers AB مغاير، بالمقارنة مع عمليات ربط محددة والتي يمكن تحديدها من سكان متواليات مع AA BB homodimer أو linkers .
2. Ligate رقاقة التخصيب مع 140 ميكرولتر الخرز 5 × T4 DNA العازلة مع يغاز PEG، 3.5 ميكرولتر 200 نانوغرام / ميكرولتر المعقدة البيروكسيديز نصف linkers A أو B، 553،5 ميكرولتر نوكلياز-مجانا ماء و 3 ميكرولتر 30 U / ميكرولتر الحمض النووي يغاز T4 (T4 إبقاء يغاز DNA على الفوق مربع برودة في جميع الأوقات وغير مستقرة حتى ligases على الجليد). ختم الأنبوب مع parafilm واحتضان بين عشية وضحاها في 16 ° C مع التناوب.

3. شطف وربط القرب من شظايا الحمض النووي رقاقة

هذا الفصل من الفيديو يشرح دور EB العازلة، وتريتون X SDS-100 خلال شطف المجمعات لونين من الخرز ويدل أيضا على إجراء خطوة بخطوة إنشاء رد فعل التعميم (الخطوة 3.9، 15:54 ل 17:10 من الفيديو).

بعد ligating في linkers نصف إلى شظايا لونين، يتم الجمع بين كل من الكسور ومزال من الخرز. وعندئذ شظايا الحمض النووي التفاعل تكون متصلا بواسطة تسلسل رابط كاملة خلال ربط القرب.

باستخدام الباركود تكوين النوكليوتيدات، ويمكن تصنيف تسلسل إلى ثلاث فئات، المتتاليات هي وايال مغاير linkers AB (ATGT الباركود / TAAG) وتسلسل مع AA homodimer أو linkers BB (TAAG الباركود / TAAG أو ATGT / ATGT) لتمييز منتجات ربط غير محددة ومعينة على التوالي ^9.

وبالتالي، فإن استخدام linkers نصف اثنين مع الباركود النوكليوتيدات مختلفة من التجارب يسمح مواصفات مختلفة أو متماثلة، وكذلك لرصد غير محددة معدل ربط بين المجمعات خيالية شرائح مختلفة ^5.

1. يغسل نصف رابط ligated-الخرز ثلاث مرات مع العازلة غسل الجليد الباردة (10 ملي تريس، الكلور درجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم).
2. الجمع بين كل من أنابيب من نصف رابط ligated-الخرز على النحو التالي.
   • استعادة واحدة من أنابيب من نصف رابط ligated-الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف ("أنبوب").
   • الحفاظ على أنبوب آخر من نصف رابط ligated-الخرز على الجليد ("B مترو الأنفاق").
   • تجاهل غسل العازلة (من الخطوة 3.2.1) وأنبوب ROM A ونصف نقل رابط ligated-الخرز (من الخطوة 3.2.2) من B الأنبوبة إلى أنبوب. بينما أنبوب لا يزال على جمع الجسيمات المغناطيسية
   • إضافة ميكرولتر العازلة 700 غسل الجليد الباردة إلى B أنبوب لجمع أي المتبقية نصف رابط ligated-الخرز ويتم الجمع بين كل من ضمان أنابيب من نصف رابط ligated-الخرز بشكل صحيح. نقل المخزن المؤقت في غسل A. أنبوب تجاهل فارغة B. الأنبوبة
3. الفوسفات نصف رابط ligated-الخرز مع 70 ميكرولتر 10 × T4 DNA يغاز العازلة (NEB)، 616 ميكرولتر المياه نوكلياز خالية و 14 ميكرولتر U 10 / ميكرولتر من الحمض النووي كيناز عديد النوكليوتيد T4. احتضان لمدة 50 دقيقة في C ° 37 مع التناوب.
4. استعادة فسفرته نصف رابط ligated-الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف وتجاهل مزيج التفاعل.
5. أزل نصف رابط ligated-DNA الكروماتين مع 200 ميكرولتر معقدة الاحتياطي شطف الطازجة (TE العازلة، 1٪ SDS). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (22 °C) مع التناوب.
6. نقل إلى أنبوب شطافة الطازجة وشطف الخرز مع 900 ميكرولتر العازلة EB. نقل طاف في أنبوب نفس الجمع بين elutions.
7. نقل شطافة إلى جمع أكواب من عاملي تصفية أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 16110 XG (13200 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (22 ° C).
8. عزل SDS بإضافة 90 ميكرولتر تريتون X 20٪-100 وقلب لتخلط جيدا. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 ° C.
9. يتم تنفيذ التعميم في ظل ظروف المخففة للغاية من أجل ربط الأحداث لصالح الفرد داخل المجمعات لونين عبر ربط الأحداث مع التقليل ربط بين لونين مختلفة المجمعات التي من شأنها أن تؤدي إلى جزيئات الحمض النووي غير المرغوب فيها خيالية. العمل على الجليد، ونقل شطافة مروي إلى أنبوب 50 مل الصقر وإضافة 7776 ميكرولتر نوكلياز خالية المياه، 1000 ميكرولتر 10 × T4 الاحتياطي يغاز DNA (NEB) و 33.33 ميكرولتر 30 U / ميكرولتر الحمض النووي يغاز T4. احتضان بين عشية وضحاها في 16° C.

4. عكس يشابك وتنقية DNA

هذا الفصل من الفيديو يظهر الإجراء خطوة بخطوة من الفينول: كلوروفورم استخراج (الخطوة 4.3، 17:11 حتي 17:59) وحتى قريبة من DNA مكعبات بعد الطرد المركزي في الخطوة 4.4.

1. عكس تشعبي والبروتين تتحلل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر 20 ملغ / مل حل K بروتين. احتضان لمدة 2 ساعة في C. ° 50
2. نقل الكروماتين DNA إلى الكثافة العالية MaXtract 50 مل وإضافة 9ml نوكلياز خالية المياه للحصول على الحجم النهائي من 19 مل.
3. إضافة 19 مل 25:24:1 الرقم الهيدروجيني الفينول كلوروفورم كحول أيزو أميلي-7.9 إلى الأنبوب في غطاء الدخان الكيميائي وقلب لتخلط جيدا. تدور الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1،800 XG (3،000 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
4. نقل المرحلة المائية العلوية إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي أوك ريدج (تفلون FEP) والحمض النووي لونين راسب مع 1.9 مل الرقم الهيدروجيني M 3 خلات الصوديوم 5،5، 19 مل isopropanرأ و 5 ميكرولتر Glycoblue. يضاف Glycoblue لتعزيز الرؤية من بيليه.
5. احتضان في C ° -80 لمدة ساعة على الأقل. يسمح الحل المجمدة لذوبان الجليد قبل الطرد المركزي في 38720 XG (18،000 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في C. ° 4
6. بعد الطرد المركزي من DNA عجلت الأيزوبروبانول، وغسل DNA بيليه مع الايثانول الجليد الباردة 75٪ مرتين و resuspend بيليه DNA في 34 ميكرولتر العازلة EB. نقل الخليط DNA إلى أنبوب مل 1.7 LoBind DNA.
7. إعادة تعليق بيليه DNA في 34 ميكرولتر العازلة EB.
8. (ريبونوكلياز العلاج الاختياري لغسل اللاحقة والخطوات تنقية في البروتوكول شيا-PET تعمل على إزالة تلوث RNA والتفتيش اليدوي للتسلسل شيا-PET من المكتبات في المنزل لدينا عرض أية آثار تلوث RNA).
   • أداء ريبونوكلياز الهضم عن طريق إضافة 10 ميكرولتر ريبونوكلياز ONE رد فعل العازلة × 10، و 55 ميكرولتر المياه نوكلياز خالية و 1 ميكرولتر 10 U / ميكرولتر ريبونوكلياز ريبونوكلياز ONE. احتضان عند 37° C لمدة ساعة.
   • نقل الكروماتين DNA في 2 مل عالية الكثافة MaXtract. إضافة 100 ميكرولتر 25:24:1 الرقم الهيدروجيني الفينول كلوروفورم كحول أيزو أميلي-7.9 إلى الأنبوب في غطاء الدخان الكيميائي وقلب لتخلط جيدا. تدور الأنبوب لمدة 5 دقائق في 16110 XG (13200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة (22 ° C).
   • نقل إلى المرحلة المائية العلوي أنبوب جديد ويعجل عكس crosslinked DNA مع 10 ميكرولتر درجة الحموضة M 3 خلات الصوديوم 5،5 و 100 ميكرولتر الأيزوبروبانول. احتضان في C ° -80 لمدة 30 دقيقة وDNA بيليه لمدة 30 دقيقة في XG 16110 (13200 دورة في الدقيقة) في C. ° 4
   • بعد الطرد المركزي من DNA عجلت الأيزوبروبانول، وغسل بيليه مع الايثانول DNA الجليد الباردة 75٪ مرتين و resuspend بيليه DNA في 34 ميكرولتر العازلة EB.

5. تجميد DNA-PET شيا لالخرز Streptavidin

إدخال هذه المحادثات الفصل عن وجودمن موقع الاعتراف MmeI وT المعقدة البيروكسيديز موجودة في نصف أليغنوكليوتيد] رابط لتسهيل استخراج مجتمع طلال أبوغزاله للرابط، بنيات علامة ("الحيوانات الأليفة"، 18:02 حتي 19:10 من الفيديو). وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الفصل من الفيديو يعطي أيضا عرض سريع الخطوة العامة لل5.2، الإجراء خطوة بخطوة إنشاء رد فعل PCR (الخطوة 6.1، 19:10 حتي 20:00 من الفيديو) واستئصال ناجحة شيا-PET DNA (الخطوة 6.9 20:00 حتي 20:30).

نصف linkers A B تحتوي المرافقة ومواقع الاعتراف MmeI، مما يسمح هذا التقييد IIS انزيم نوع لخفض أزواج قاعدة 18/20 المصب من المواقع المستهدفة ملزمة لتوليد قصيرة "العلامات" من جزء لونين، وإنتاج تقرن مجتمع طلال أبوغزاله للرابط، العلامة بنيات ("الحيوانات الأليفة").

لتمكين تنقية يبني PET بواسطة streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي، يتم تعديل كل نصف رابط A و B مع البيوتين، مما يسمح للأسر وتنقية من بنيات شيا-PET.

1. الإفراج جaptured شيا-PET DNA عن طريق إضافة 5 ميكرولتر 10 × NEBuffer 4 و 5 ميكرولتر 500 ميكرومتر الطازجة (10 X) S-أدينوزيل مثيونين (SAM) و 1 ميكرولتر 2 U / ميكرولتر MmeI لDNA معلق. يمكن إخماد MmeI الزائدة عن طريق إضافة 5 ميكرولتر غير المعقدة البيروكسيديز نصف linkers إلى مزيج التفاعل لMmeI تكون ذاتية المثبطة في الزائدة. احتضان لمدة 2 ساعة في 37 ° C.
2. لالتقاط صدر شيا-PET 50μl DNA نقل، معلق من الخرز streptavidin M-280 إلى أنبوب DNA LoBind. يغسل مرتين مع الخرز 2 × ضم وتجليد وغسل العازلة (2 × B & W: 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA، 2 M كلوريد الصوديوم). الخرز resuspend في 50 ميكرولتر العازلة X B & W (2) ونقل 50 ميكرولتر من مزيج الهضم (من الخطوة 5.1) إلى أنبوب واحد. تخلط جيدا واحتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب.
3. استعادة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف وتجاهل طاف. غسل حبات مرتين مع 150 ميكرولتر 1 × ضم وتجليد وغسل العازلة (1 × B & W: 5 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 0.5 مم EDTA، 1 M كلوريد الصوديوم).
4. Ligate 454 GS20 محولات لشيا-PET DNA مع 5 ميكرولتر 10 × T4 DNA الاحتياطي يغاز (لاحظ أن الاحتياطي يغاز المستخدمة في هذه الخطوة يختلف من الخطوة 3.9، يغاز الاحتياطي المستخدمة في هذه الخطوة من الشركة نفسها التي يوفر يغاز DNA T4)، و 4 ميكرولتر 200 نانوغرام / ميكرولتر 454 GS20 محول A، و 4 ميكرولتر 200 نانوغرام / ميكرولتر 454 باء محول GS20، 36 ميكرولتر المياه نوكلياز خالية و 1 ميكرولتر 30 U / ميكرولتر الحمض النووي يغاز T4. احتضان بين عشية وضحاها في C ° 16 مع التناوب. ويمكن أيضا شيا-PET DNA يتم ligated مع البورشيد-NN محولات، وفي هذه الحالة نوصي التضخيم من المكتبة باستخدام PCR PCR PE1.0 التمهيدي والتمهيدي PE 2.0 شراؤها من البورشيد.
5. استعادة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف وتجاهل طاف. يغسل ثلاث مرات مع 150 الخرز ميكرولتر 1 × B & W الاحتياطي.
6. نيك ترجمة شيا-PET DNA مع 5 ميكرولتر 10 × NEBuffer 2، 2.5 ميكرولتر dNTPs 10 مللى، 38.5 ميكرولتر المياه نوكلياز خالية و 4 ميكرولتر 10 كولاي U / ميكرولتر الحمض النووي بوليميريز احتضان بين عشية وضحاها I. فيدرجة حرارة الغرفة (22 ° C) مع التناوب.
7. استعادة الخرز باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف وتجاهل طاف. يغسل ثلاث مرات مع 150 الخرز ميكرولتر 1 × B & W الاحتياطي.
8. إعادة تعليق الخرز مع 50 ميكرولتر العازلة EB.

6. التضخيم من الحمض النووي شيا-PET

1. إعداد ردود الفعل PCR مع 2 تعليق الخرز ميكرولتر، 21 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز، 1 ميكرولتر 10 ميكرومتر البورشيد 1-454 التمهيدي، 1 ميكرولتر 10 ميكرومتر البورشيد 2-454 التمهيدي و 25 ميكرولتر مزيج Phusion العليا ماجستير الإخلاص.
2. لتحديد عدد الدورات اللازمة لتوليد المنتجات PCR كافية لتسلسل، إقامة ثلاثة اختبار ردود الفعل PCR مع دورات 16 و 18 و 20. لا تتجاوز 20 دورات إذ أننا وجدنا أن القيام بذلك في تعقيد النتائج مكتبة منخفضة جدا.

الخطوة الأولي	30 ثانية	98 ° C	(تمسخ)
18 حتي 25 دورات	10 ثانية	98 ° C	(تمسخ)
	30 ثانية	65 ° C	(الصلب)
	30 ثانية	72 ° C	(الإرشاد)
الخطوة النهائية	5 دقائق	72 ° C	(الإرشاد النهائي)

3. تحديد عدد دورة ادنى حد ممكن عن طريق تشغيل ردود الفعل PCR على هلام الانحدار 4-20٪ TBE وتلطيخ مع الأخضر SYBR I، وضمان وجود مجموعة من أزواج قاعدة 223، والذي هو طول DNA-PET شيا.
4. تضخيم بقية الخرز شيا-PET streptavidin DNA محددة في PCR على نطاق واسع مع ودورات PCR أقل عدد ممكن في حين لا يزال الحصول على عائد يكفي لالتسلسل.
5. إعادةالخرز المطالبة من جميع ردود الفعل PCR باستخدام الجسيمات المغناطيسية المكثف وحمام سباحة طاف جديدة لاثنين من أنابيب LoBind DNA. يعجل كل أنبوب من طاف من يضيف 60 ميكرولتر الصوديوم M 3 خلات، 2 ميكرولتر GlycoBlue و 600 ميكرولتر الأيزوبروبانول إلى ردود فعل المجمعة.
6. احتضان في C ° -80 لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي في 16110 XG (13200 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في C. ° 4
7. بعد الطرد المركزي من DNA عجلت الأيزوبروبانول، وغسل DNA بيليه مع الايثانول الجليد الباردة 75٪ مرتين و resuspend بيليه DNA في 100 ميكرولتر العازلة TE ميكرولتر تحميل و 5 X صبغ 6.
8. توزيع المنتجات PCR بالتساوي في آبار جل TBE 6٪. تشغيل هلام في 1 عازلة TBE X في 200 V لمدة 35 دقيقة وصمة عار مع SYBR الأخضر I. تصور الجل مع Transilluminator قارئ المظلمة.
9. المكوس بعناية الفرقة BP 223 من هلام وأداء "هلام سحق" استخراج DNA بروتوكول على النحو التالي:
   • وضع الجل شظايا رفعه في microc مل 0،6أنابيب entrifuge التي تم مثقوب في أسفل بإبرة 21-G.
   • وضع كل أنبوب داخل أنبوب 1.5 مل غطاء المسمار وأجهزة الطرد المركزي في 16110 XG (13200 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في C. ° 4
   • أضف 200 ميكرولتر العازلة TE الرقم الهيدروجيني 8.0 إلى كل أنبوب وضمان مغمورة تماما القطع هلام في المخزن المؤقت.
   • تجميد في C ° -80 لمدة ساعة واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
   • نقل القطع هلام مع العازلة في كل أنبوب لكأس تصفية تصفية جهاز للطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي في 16110 وXG (13200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
   • شطف كل أنبوب 1.5 مل مع 200 ميكرولتر العازلة TE درجة الحموضة 8.0 و الشطف العازلة نقل إلى كل وحدة التصفية عند الانتهاء من الدوران الأول.
   • بركة مرشح من خلال ويعجل مع الأيزوبروبانول.
   • إعادة تعليق بيليه DNA مع 15 ميكرولتر العازلة TE.

7. تحقق الجودة فيد التضخيم من الحمض النووي شيا-PET

1. المضي قدما في فحص الجودة باستخدام DNA اجيلنت 1000 الفحص أو اجيلنت DNA حساسية عالية الفحص على Bioanalyzer اجيلنت 2100.
2. ينبغي للمخطط رحلاني من فحص DNA اجيلنت عرض واحد فقط الذروة جنبا إلى جنب مع خط الأساس قبل الانتقال إلى شقة الجينوم التسلسل البورشيد منظمة شات محلل.
3. قبل البورشيد الجينوم التسلسل منظمة شات محلل، شيا-PET DNA يجب أن يكون مثالي تركيز يقل عن 10 نانومتر. إجراء 4-PCR الكمي نقطة وفقا لالبورشيد qPCR الكمي دليل بروتوكول لتحديد كمية العينة لتحميل على الخلية التدفق. بدلا من ذلك، إجراء نقطة واحدة الكمية PCR على النحو التالي:
   • يخفف من سيطرة قالب إلى 100 م، الساعة 10 و 1. كما هو موضح في البروتوكول البورشيد الكمي qPCR، يتم تعريف قالب تحكم مثل أي مكتبة أعدت لتسلسل على منصة البورشيد وينبغي أن تكون مشابهة ممكن من حيثحجم القالب، والمحتوى ونوع GC المكتبة.
   • تمييع DNA-PET شيا إلى 10 م.
   • انشاء ثلاث مكرارت PCR لكل التخفيف بنسبة 0.1 ميكرولتر التمهيدي qPCR 1.1، 0.1 ميكرولتر التمهيدي qPCR 2.1، 5 ميكرولتر LightCycler480 DNA SYBR الأخضر ميكس ماجستير I، 3.8 ميكرولتر المياه نوكلياز خالية و 1 ميكرولتر من القالب مع العلم روش LightCycler التطبيقية 480 في الوقت الحقيقي PCR النظام. وتشمل عنصري تحكم السلبية باستخدام 1 ميكرولتر من المياه نوكلياز خالية كقالب.
     • الأولي تمسخ
       • 95 ° C 5 دقائق 4.8 ° C / S
     • توسيع
       • 95 ° C 10 ثواني 4.8 ° C / S
       • 60 ° C 1 دقيقة 2.5 درجة C / S
       • 72 ° C 30 ثانية 4.8 ° C/ s
     • ذوبان كيرف
       • 95 ° C 5 ثوان 4.8 ° C / S
       • 65 ° C 1 دقيقة 2.5 درجة C / S
       • 95 ° C 5 في الاستحواذ ° C
     • تبريد
       • 40 ° C 10 ° C 2.0 ثانية / ثانية
   • ضمان أن الضوابط السلبية لا تظهر أي التضخيم وأن الانحراف المعياري للقيم ط م هو أقل من 0.1 قبل حساب تركيز القوالب مكتبة على أساس منحنى القياسية الناتجة عن التخفيفات قالب السيطرة.
4. مجموعات توليد على سطح الخلايا تدفق البورشيد عن طريق تحميل INT 13:05س الكتلة CBOT البورشيد نظام توليد وفقا لتعليمات تظهر على الشاشة.
5. انتقل إلى DNA-PET تسلسل شيا محلل البورشيد على منظمة شات الجينوم باستخدام تسلسل التمهيدي البورشيد 3-454 وتسلسل التمهيدي البورشيد 4-454 في ممر واحد لمعرفة نوعية للمكتبة. تخزين المتبقية شيا-PET DNA في -20 ° C. إذا كان لديه مكتبة جيدة البيانات، وإعداد نموذج لأشواط إضافية من 4 إلى 8 حارات حسب الحاجة بناء على نتائج عينة حارة للحصول على 18 حتي 20000000 قراءة فريدة من نوعها.
   • كمية DNA-PET شيا تحميلها على تدفق الخلايا يعتمد إلى حد كبير على نسخة من البرنامج تحليل البيانات التسلسل، استوديو البورشيد لمراقبة التسلسل. للنسخة 2.9، ويتراوح تركيز التحميل من ثلث إلى نصف الحد الأقصى لعدد كل البلاط، وهو ما يعادل حوالي 21 مليون تمرير تصفيتها يقرأ مع حوالي 9.5 مليون من الحيوانات الأليفة يقرأ.
   • تحميل خفضت هو ضروري لضمان صحة قاعدة الدعوة وأو تسلسل الباركود من linkers. هذا الخطأ يحدث عندما يتم التسلسل عدد كبير من النيوكليوتيدات مماثلة، كما هو الحال إذا كان التسلسل رابط، للحصول على معلومات المتوازية. إذا لم يتم المطلوب على المعلومات المتوازية، وعدم قراءة linkers، وبعد ذلك يمكن استخدام كامل تركيز تحميل.
6. ويمكن تحويل الملفات qSeq من قبل المتصل حاليا قاعدة لمزيد من التحليل باستخدام أداة شيا-PET وفقا لدليل أداة التثبيت شيا-PET (الإصدار 4.1) ^8.

C. الممثل شيا-PET النتائج

اقمنا بنجاح شيا-PET المكتبات باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني الأجسام المضادة (8WG16) في خلايا MCF-7 (CHM160 وCHM163) ⁹ باستخدام 672 نانوغرام من المواد رقاقة كما هو موضح أعلاه. التشخيص الأولي الجل تشغيل هذه المكتبة تضخيم PCR-، كما ذكر في الخطوة 6.2 من بروتوكول شيا-PET، عرض الفرقة مشرق ومحددة جيدا فيحجم المتوقع من أزواج قاعدة لجميع الدراجات 223 PCR المستخدمة (انظر الشكل 4).

تم استخدام 16 دورات PCR لتضخيم مكتبة شيا-PET وتم الحصول على المحصول الكلي إلى 17.1 نانوغرام. ولوحظ وجود واحد، ذروة مخطط رحلاني مكثفة في الحجم المتوقع من أزواج قاعدة 223 عن طريق تحليل الحمض النووي اجيلنت 1000 على النحو المذكور في الخطوة 7.1 من بروتوكول شيا-PET (انظر الشكل 5).

الشكل 1. نظرة عامة على رقاقة. MCF-7 الخلايا المزدوج عبر ربط مع مكررا EthylGlycol (SuccinimidylSuccinate (EGS) والفورمالدهايد بشكل تسلسلي، مما أدى إلى روابط تساهمية بين لونين المجاورة مكانيا. تم الحصول على لونين عبر ربط من الخلايا MCF-7 الثابتة من تحلل الخلايا وتحلل النووية. تعرض بعد ذلك لونين إلى تجزئة لمجموعة من الأزواج الأساسية حجم 200-600. قبل وبعد مسح لونين sonicated مع البروتيناتن الخرز المغناطيسي لإزالة G غير محدد DNA، وimmunoprecipitated لونين قبل تطهيرها بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة المغلفة الخرز لالتقاط لونين من الفائدة.

الشكل 2. تحليل جل من لونين شظايا sonicated. ويرد DNA BP 100 سلم في المسار الأول والأخير للرجوع إليها في الحجم. عرض لونين sonicated كثافة قوية بين 200 حتي 600 BP والذي يعتبر مثاليا لالتقاط التفاعلات ونين طويلة المدى.

الشكل 3. نظرة عامة شيا-PET. شظايا لونين المجزأة هي نهاية أضعفت و ligated إلى نصف المعقدة البيروكسيديز linkers التي تحتوي على مواقع المرافقة تقييد MmeI. ومزال ثم المجمعات ونين سليمة قبالة الخرز وتعرض لربط القرب تحت ظروف المخففة للغاية، بحيث شظايا الحمض النووي التفاعل هي محافظةligated erentially لأحد آخر. بعد عكس عبر ربط DNA لإزالة البروتينات المرتبطة، ويتم الهضم خارج MmeI للافراج عن مجتمع طلال أبوغزاله للرابط، علامة (PET) يبني، والتي تنقيته ثم ملزمة انتقائية لstreptavidin الخرز. وligated بنيات PET مع محولات عالية الإنتاجية للتسلسل.

الشكل 4. تحليل هلام من حيوانات أليفة شيا بعد التضخيم PCR. ويرد DNA بمقدار 25 نقطة في سلم حارة 1 و 5 للرجوع إليها في الحجم. الممرات 2 إلى 4 منتجات PCR ولدت بعد 16 و 18 و 20 دورات من التضخيم PCR من 2 ميكرولتر من قالب حبة يجمد، على التوالي. هذه هي مكتبة النجاح، كما يتضح من نطاقات مشرق واضحة المعالم، في حجم المتوقع من 223 سنة مضت. يتم إنشاء تشويه غير محددة عند زيادة عدد الدورات PCR بينما يتم إجراء أقل عصابة من كل رد فعل PCR تتكون من dimers التمهيدي.

الشكل 5. اجيلنت تحليل Bioanalyzer 2100 من تنقية البورشيد-454 محول ligated شيا الحيوانات الأليفة. القبض على الشاشة من electropherograms اجيلنت Bioanalyzer 2100 أنشأ حسابا باسم مكتبة ناجحة، مع ذروة مكثفة على واحد في الحجم المتوقع من 223 سنة مضت. نلاحظ أن Bioanalyzer اجيلنت فحص تقارير عادة ما يكون حجم ارتفاع طفيف مما كان متوقعا، وفي هذه الحالة، يتم عرض المطلوب في ذروة 237 BP بدلا من 223 سنة مضت. هذا هو ضمن نطاق الخطأ 10٪ من الفحص اجيلنت.

Discussion

شيا-PET هو طريقة تم تطويرها لتحديد التفاعلات طويلة المدى في تنظيم النسخ. واحدة من العوامل الحاسمة التي تحدد نوعية مكتبة شيا-PET هي نوعية المواد رقاقة.

البروتوكول هو موضح في الفيديو يتضمن استخدام السلع والخدمات البيئية والفورمالديهايد لعبور الارتباط الخلايا. فإن استخدام الفورمالدهايد جنبا إلى جنب مع كاشف عبر ربط 2 تحمل الذراع يعد التبادل تساعد في الربط من البروتينات التي لا يمكن أن تكون ملزمة الفورمالديهايد وحدها ^3،11،15. لقد وضعنا المكتبات مع هذه الطريقة التي أثبتت مواقع الربط قوية وطويلة المدى التفاعلات ^9. ومع ذلك، قد عبر ربط وينبغي أن يكون الأمثل ظروف رقاقة لكل عامل في المصالح، وأنه من المهم عدم الإفراط تشعبي كما الكثير عبر ربط سيؤدي إلى صعوبات في تجزئة من قبل صوتنة، ويؤدي ربما في التفاعلات ونين زائفة . لونين التفاعلاتوينبغي التحقق من صحة التي حددتها شيا-PET بطريقة مختلفة، مثل التهجين في الموقع مضان ^4.

نوصي ما لا يقل عن 100 نانوغرام من المواد لونين. ولئن كنا قد شيدت المكتبات نوعية جيدة من 50 نانوغرام من المواد لونين، لاحظنا أن كميات كبيرة من المواد بدءا يسمح بناء شيا-PET المكتبات مع دورات PCR أقل من 16، وبالتالي تقليل amplicons والتكرار من كل مكتبة. هذا أقل التكرار يرتبط به أعلى فريدة من نوعها، وكذلك تعيين نسبة عالية من البيانات القابلة للاستخدام، وبالتالي تمكين تفاعل أكثر شمولا لونين مع عدد أقل من الخريطة حارات التسلسل. ينبغي أن الحجم النهائي معبأة من الخرز في كل أنبوب يكون 50 ميكرولتر ميكرولتر 100 لوالخرز المغناطيسي وsepharose و على التوالي. وإذا كان حجم حبة معبأة هو أقل من المعلن، وتحقيق الحد الأدنى لحجم محملة مسبقا وبالمثل مسح فارغة الخرز المغناطيسي أو sepharose و لتقليل الخسائر في DNA الحاملة للحبةق في الخطوات اللاحقة. وينبغي أن تستخدم لمرة واعادوا نصائح او نصائح واسعة الأساسية لpipetting الخرز sepharose و.

وقد أدرجت التعديلات التالية بعد بروتوكول شيا-PET المنشورة سابقا ^5. أولا، تم استخدام الخرز المغناطيسي G لتقليل الخسائر خلال عينة يغسل. وبالإضافة إلى ذلك، حددنا نطاقات غير محددة مع أحجام تقريبية من 100 شركة بريتيش بتروليوم BP و138 إلى تكون amplicons الذاتي ligated linkers نصف أو / والمحولات. وبالتالي، خفضنا تركيز المعقدة البيروكسيديز linkers نصف و 454 محولات GS20 للحد من نطاقات غير محددة خلال التضخيم PCR. تم تخفيض حجم ربط القرب من 50 مل إلى 10 مل لتقليل الخسائر خلال عينة الخطوات اللاحقة تنقية وحفظ أيضا على تكاليف كاشف. ونحن أيضا زيادة فترة حضانة لشل شيا-PET DNA لالتقاط حبات لضمان القصوى لشيا-PET DNA على الخرز streptavidin.

خلال ربط القرب الخطوة، عمليات ربط خيالية ثار لا تمثل الحقيقية في التفاعلات المجراة لونين يتم إنشاؤها حتما بطريقة غير محددة وبشكل عشوائي. وبالتالي، لتقييم جودة البيانات من أي تجربة شيا-PET، ويقدر معدل الخيمرية من استخدام اثنين من مختلف linkers نصف مع محددة TAAG الباركود النوكليوتيدات وATGT ^5. بعد التسلسل الإنتاجية العالية، ويتم تحليل متواليات شيا لأول مرة-PET لتكوين رابط الباركود وتسلسل مشتقة من منتجات محددة ومنتجات ربط ربط غير محددة يمكن تمييزها ^8. النسبة المئوية للتعرف الوهم (أي heterodimers linkers AB) الموجودة في منزلنا في MCF-7 RNA البلمرة II-PET المكتبات شيا هو أقل من 15٪.

وتصنف فيما بعد شيا-PET متواليات إلى فئتين، هما الذاتي ربط الحيوانات الأليفة والحيوانات الأليفة ربط بين. ويتم الحصول على الحيوانات الأليفة ربط الذاتي من التعميم ربط الذاتي من لونين شظايا في حين يتم اشتقاق ربط بين الحيوانات الأليفة من أناnter-ربط بين اثنين من شظايا الحمض النووي مختلفة. هذا الأخير هو ثم تقسيمها إلى ثلاث فئات مختلفة استنادا إلى المسافة الجينية من كل علامة على نفس الصبغي (داخل الصبغي ربط بين الحيوانات الأليفة) أو التي يتم تعيينها إلى كل من به صبغيين مختلفة (interchromosomal ربط بين الحيوانات الأليفة). قمنا بتطوير برنامج أداة شيا-PET حزمة لفرز الفئات المختلفة ^8. وسوف يستند هذا على شظايا الحمض النووي الموجودة في المكتبة. عموما، سوف شظايا أصغر رقاقة تعطي دقة أعلى وقطع لهذه المكتبات البلمرة RNA-PET شيا II حوالي 4 كيلو بايت.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تمييز الحقيقي من التفاعلات لونين الضجيج العشوائي عن طريق حساب عدد من الحيوانات الأليفة ربط بين كتلة في التفاعل، وبعبارة أخرى، قال مجموعة من العد PET عالية لديها أعلى احتمال كونه تفاعل حقيقي لونين ⁸ .

لتصفية ايجابيات كاذبة لدينايرتفع من المراسي عالي التخصيب التي يمكن أن تشكل ربط بين الحيوانات الأليفة عن طريق الصدفة العشوائية، كما تم وضع إطار التحليل الإحصائي وضعت لتشكل تشكيل عشوائية من الحيوانات الأليفة أي ربط بين بين اثنين من المراسي ^8.

في الختام، هذه التقنية تسمح شيا-PET رسم خرائط شبكات التفاعل لونين على نطاق عالمي. تنفيذ المعالج في شيا-PET يسمح في الحد من التعقيد ومكتبة ضجيج في الخلفية. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف رقاقة خصوصية لونين التفاعلات، وتمكن من دراسة التفاعلات لونين المحددة المرتبطة عوامل النسخ خاص ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
4-20٪ التدرج TBE هلام	إينفيتروجن	EC6225BOX	الخطوة B، 6.3
5 × يغاز DNA T4 العازلة مع PEG	إينفيتروجن	46300018	B الخطوة، 2.2
6٪ TBE هلام	إينفيتروجن	EC6263BOX	الخطوة B، 6.8
اجيلنت DNA 100 الفحص	اجيلنت تكنولوجيز	5067-1504	B الخطوة، 7.1
اجيلنت DNA حساسية عالية الفحص	اجيلنت تكنولوجيز	5067-4626
اجيلنت Bioanalyzer 2100	اجيلنت تكنولوجيز	G2940CA
أجهزة الطرد المركزي أنابيب مرشحات (SPIN-X)	كورنينج	CLS8160	الخطوة B، 3.7 و 6.9
الظلام قارئ Transilluminator	كلير بحوث الكيميائية	DR46B	الخطوة B، 6.8
Sonifier الرقمية المحمولة ديسروبتر	برانسون	450D-0101063591	خطوة، 4.3
DynaMag-2 المغناطيس (المغناطيسي المكثف الجسيمات)	إينفيتروجن	123-21D	خطوة خطوة 7.5.1، B، لجميع الخرز المغناطيسي الغسيل الخطوات
DynaMag-15 المغناطيس (المغناطيسي المكثف الجسيمات)	إينفيتروجن	123.01D	الخطوة A، 5 و 6
DynaMag-PCR (المغناطيسي المكثف الجسيمات)	إينفيتروجن	49-2025	الخطوة B، 6.5
البلمرة DNA القولونية القولونية I	NEB	M0209	الخطوة B، 5.6
GlycoBlue	Ambion	AM9516	خطوة خطوة 7.5.1، B، 4.3 و 6.5
البورشيد الجيل الكتلة CBOT النظام	البورشيد	SY-301-2002	B الخطوة، 7.4
محلل البورشيد الجينوم منظمة شات	البورشيد	SY-301-1301	B الخطوة، 7.5
البورشيد PE الاشعال	البورشيد	PE-102-1004	B الخطوة، 5.4 (إذا لزم الأمر)
Intelli-خلاط	Palico التكنولوجيا الحيوية	RM-2L	الخطوة B، أي مع دوران حضانات
LightCycler 480 نظام PCR في الوقت الحقيقي	روش	04 640 268 001	الخطوة A، B الخطوة 7.5.3، 7.3
LightCycler480 DNA SYBR الخضراء I MasterMix	روش	03 752 186 001	B الخطوة، 7.5.3
M-280 Streptavidin Dynabeads	إينفيتروجن	11206D	الخطوة B، 5.2
المغناطيسي (Dynabeads) بروتين G	إينفيتروجن	100.03D	الخطوة A، و5.1.1 5.2.1
MaXtract عالية الكثافة (2ml)	QIAGEN	129056	الخطوة 7.5.1،
MaXtract عالية الكثافة (50ML)	QIAGEN	129073	B الخطوة، 4.2
MmeI	NEB	R0637	R0637
ريبونوكلياز ONE ريبونوكلياز	Promega	M426C	B الخطوة، 4.8
RNA البلمرة II (8WG16) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة	كوفانس	MMS-126R	الخطوة A، 5.2.4
أنابيب الطرد المركزي البلوط ريدج (البولي بروبلين)	Nalgene	3119-0050	خطوة، 3.1
أنابيب الطرد المركزي البلوط ريدج (تفلون FEP)	Nalgene	3114-0050	B الخطوة، 4.3
Phusأيون عالية الإخلاص ماجستير ميكس	Finnzymes	F-531	الخطوة B، 6
Picogreen (كوانت-IT) dsDNA الكاشف	إينفيتروجن	P11495	الخطوة A، 7.5.2
البوليسترين اختبار القاع جولة تيوب	BD العلوم البيولوجية	352057	خطوة، 4.1
أقراص البروتيني كوكتيل المانع (كامل، EDTA خالية)	روش	11873580001	خطوة، 1.6 وما بعده
بروتين K الحل (20mg/ml)	Fermentas	E00491	الخطوة A، 4.4، 7.5.1 B الخطوة، 4.1
T4 DNA يغاز	Fermentas	EL0013	B الخطوة، 2.2، 3.9 و 5.4
T4 DNA يغاز العازلة (NEB)	NEB	B0202S	B الخطوة، 3.3 و 3.9
T4 DNA البلمرة	Promega	M4215	B الخطوة، 1.2
T4 كيناز عديد النوكليوتيد DNA	NEB	M0201	الخطوة B و 3.3
TruSeq SBS كيت V5-GA	البورشيد	FC-104-5001	الحكام لنظام الجينوم البورشيد منظمة شات محلل
TruSeq PE-V2 الكتلة كيت CBOT-GA	البورشيد	PE-300-2001	أن يكون استخدام مع الكتلة البورشيد CBOT نظام توليد
SYBR الخضراء I	إينفيتروجن	S-7585	B الخطوة، 6.3 و 6.8
إكس سيل SureLock النظام الكهربائي ميني خلية	إينفيتروجن	EI0001	B الخطوة، 6.3 و 6.8

اسم	تسلسل		تعليقات
المعقدة البيروكسيديز نصف linkers A (200ng/μl)	أعلى	5 'GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3'	250 nmole نطاق HPLC تنقية الداخلية البيوتين DT (9)
	النغفة يرقانة النبر	5 'GTT GGA TAA GAT ATC GC 3'	250 nmole نطاق HPLC تنقية
المعقدة البيروكسيديز نصف linkers B (200ng/μl)	أعلى	5 'GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3'	250 nmole نطاق HPLC تنقية الداخلية البيوتين DT (9)
	النغفة يرقانة النبر	5 'GTT GGA ATG TAT ATC GC 3'	250 nmole نطاق HPLC تنقية
غير المعقدة البيروكسيديز نصف linkers (200ng/μl)	أعلى	5 'GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3'	250 nmole نطاق الصف PCR
	النغفة يرقانة النبر	5 'GTT GGA TCC GAT ATC GC 3'	250 nmole نطاق الصف PCR
GS20 محول A (200ng/μl)	أعلى	5 'CCA TCT CAT GTG CCC TGC TCC CATCTG TTC CTC CCT CCC TGT AGN N 3 '	250 nmole نطاق الصف PCR
	النغفة يرقانة النبر	5'CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG GAT CAG GGA TGA GG 3 '	250 nmole نطاق الصف PCR
GS20 محول B (200ng/μl)	أعلى	5 'AGA CTG CAC GCA ACA GGG GAT CAA AGG GGC ACA CAG GGG ATA GG 3'	250 nmole نطاق الصف PCR
	النغفة يرقانة النبر	5 'CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AGN N 3'	250 nmole نطاق الصف PCR
البورشيد-NN محولات	أعلى	5 'ACA CTC TTT CCC ACG TAC ACG CTC TTC CGA TC 3'	250 nmole نطاق HPLC تنقية انظر الخطوة B و 5.4
	النغفة يرقانة النبر	5 'فوس - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3'	فسفرته 250 nmole نطاق HPLC تنقية نهاية 5 'انظر الخطوة B و 5.4
البورشيد 1-454 (إلى الأمام) التمهيدي (10 ميكرومتر)	5 'AAT GAT ACG GCG ACC ACC ACC GAG ATC TAC GTG CTA TCC CCT TGC CTT G 3'		250 nmole نطاق الصف PCR
البورشيد 2-454 (العكسية) التمهيدي (10 ميكرومتر)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3'		250 nmole نطاق الصف PCR
qPCR التمهيدي 1.1 (10 ميكرومتر)	5 'AAT GAT ACG GAG ACC ACC GCG AT 3'		10nmole نطاق الصف PCR
qPCR التمهيدي 2.1 (10 ميكرومتر)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3'		10nmole نطاق الصف PCR
البورشيد التمهيدي التسلسل 3-454 (100 ميكرومتر)	5'TGC GTG TCC CAT CTG TTC CTC CCT CCC TGT AG 3 '		100nmole نطاق HPLC تنقية
البورشيد التمهيدي التسلسل 4-454 (100 ميكرومتر)	5'GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AG 3 '		100nmole النطاقHPLC تنقية