الجلد لكمة خزعة الثقافة ازدراع لاشتقاق الخلايا الليفية الإنسان الابتدائية

Summary

بروتوكول ثقافة يزدرع الخلايا الليفية من الخزعات لكمة جلد الإنسان هو وسيلة قوية من الناحية الفنية وبسيطة لاستخلاص خلايا الجلد في غضون 4-8 أسابيع للأعمال المصرفية من حوالي 15-20 مليون خلية في عدد مرور منخفض.

Abstract

الأنسجة وخطوط الخلايا المشتقة من الفرد مع المرض هي مصادر المثالي لدراسة الظواهر الخلوية المرتبطة بتلك الأمراض. الخلايا الليفية المريض المستمدة في هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح في اشتقاق الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها المرض إلى نموذج ^1. ويمكن أيضا الممرات في وقت مبكر من هذه الخلايا الليفية أن تستخدم لالمقايسات الفنية المستندة إلى الخلايا لدراسة مسارات محددة المرض، وآليات ² والنهج فحص المخدرات لاحقة. الاستفادة من بروتوكول المعروضة على الإجراءات الأنزيمية هي 1) استنساخ هذه التقنية من كميات صغيرة من الأنسجة المستمدة من المرضى من كبار السن، مثل المرضى المصابين يعانون من مرض باركنسون، 2) نهج بسيط من الناحية الفنية على منهجيات أكثر تحديا باستخدام العلاجات الأنزيمية، و3 ) النظر الوقت: هذا البروتوكول يأخذ 15-20 دقيقة ويمكن القيام بها على الفور بعد وصول الخزعة. العلاجات الأنزيمية يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 4 ساعات ولها مشاكلoverdigestion، والحد من بقاء الخلية والمرفقات اللاحقة من الخلايا عندما لم يتم التعامل معها بشكل صحيح. يصف هذا البروتوكول تشريح وإعداد الجلد البشري 4 ملم خزعة لاشتقاق ثقافة الخلايا الليفية، ولها نسبة نجاح عالية جدا وهو أمر مهم عند التعامل مع عينات الأنسجة المشتقة من المريض. في هذه الثقافة، الكيراتينية تهاجر من الأنسجة خزعة خلال الأسبوع الأول بعد إعداد. الخلايا الليفية تظهر بعد 7-10 أيام ثمرة أول من الخلايا الكيراتينية. DMEM وسائل الإعلام ارتفاع نسبة الجلوكوز تستكمل مع FBS 20٪ تفضل ونمو الخلايا الليفية أكثر من الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية اكتسى الخلايا الكيراتينية. بعد 2 الممرات وقد تضعف الخلايا الكيراتينية خارج مما أدى إلى الثقافات الليفية متجانسة نسبيا والذي يعبر عن الخلايا الليفية SERPINH1 علامة (HSP-47). باستخدام هذا النهج، يمكن أن تستمد 15-20000000 الخلايا الليفية في 4-8 أسابيع للأعمال المصرفية الخلية. تشريح الجلد يستغرق حوالي 15-20 دقيقة، ثم يتم رصد خلايا مرة واحدة في اليومتحت المجهر، وسائل الإعلام يتم تغيير بعد كل 2-3 أيام المرفقات وثمرة من الخلايا.

Protocol

يجب أن تبقى على الجلد التي تم الحصول عليها لكمة خزعة باستخدام الإجراء القياسي ³ (على سبيل المثال تم الحصول عليها مع 4MM صك Visipunch جولة) في كامل DMEM 20٪ FBS وسائل الاعلام على الجليد. مرة واحدة قد وصلت العينة في المختبر، معالجة خزعة في أقرب وقت ممكن.

1. إعداد الجلد لكمة خزعة

الخطوات 1،1-1،3 التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية

1. إعداد مقدما: إضافة 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا. تعيين لوحة جانبا لمدة 30-60 دقيقة. نضح الحل الجيلاتين وإضافة 800 ميكرولتر من اكتمال DMEM/20٪ FBS وسائل الإعلام إلى كل بئر. ضمان كامل سطح البئر مغطاة مع وسائل الإعلام.
2. عكس غطاء العقيمة 10 سم صحن زراعة الأنسجة وإضافة 1.5 مل من DMEM / 20٪ FBS وسائل الاعلام الى منتصف الغطاء وانتشرت في إسقاط وسائل الإعلام مع غيض من ماصة المصلية.
3. باستخدام ملقط معقم، مكان رانه الجلد خزعة قطعة في وسائل الإعلام على طبق.

2. تشريح من الجلد لكمة خزعة

الخطوات من 9 2.1-2.2 التي يتعين القيام بها داخل الأفقية الرقائقي غطاء تدفق

1. وضع الجزء السفلي من صحن 10 سم على غطاء المقلوب، ونقل الجلد خزعة إلى مجهر تشريح في تدفق الصفحي هود.
2. تشريح الجلد الجولة 4 ملم خزعة إلى 12-15 قطعة بحجم بالتساوي مع حواف حادة عن طريق قطع قطعة في متساويين باستخدام مشرط واحدة لاجراء خزعة في المكان ومشرط الثانية لخفض مع تحريك المتداول في اتجاه واحد. القطع مع حواف خشنة يسهم في ضعف التعلق / خلية ثمرة.

3. نقل الجلد تشريح خزعة القطع في لوحات زراعة الأنسجة

الخطوات هي 3،1-3،6 التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية

1. وضع الجزء السفلي من صحن سم زراعة الأنسجة 10على الجزء العلوي من الغطاء المقلوب، وطبق نقل مرة أخرى إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
2. باستخدام ملقط مدبب، مكان 2-3 قطعة خزعة في كل بئر من لوحة 6 جيدا استعدادا تحتوي على 800 ميكرولتر وليس على الآبار الجافة. استخدام التنصت أو حركة انزلاق للحصول على قطعة لنعلق على الجزء السفلي من البئر. A مشرط هو مفيد لإزالة أي قطع خزعة من الملقط.
3. وضع لوحة 6 جيدا في الحاضنة 37 درجة مئوية. رصد يومي للتأكد من هناك هو فيلم من الطلاء وسائل الإعلام في قاع البئر للأسبوع الأول، ويضاف 200 ميكرولتر ~ كل يوم 2 ليحل محل أي وسيلة إعلامية تبخرت.
4. بعد أسبوع واحد، وزيادة كمية وسائل الإعلام إلى 2 مل من اكتمال FBS DMEM/20٪ وسائل الإعلام تغيير كل 2-3 أيام.
5. مرة واحدة الخلايا الليفية هي متكدسة في كل بئر إلى النقطة حيث الخلايا الليفية يتم الوصول إلى حواف البئر، ويعرض للتريبسين مرور لوحة 6 جيدا إلى 2X T75 قوارير (مرور 1). يمكن نقل قطعة نسيج كذلك. فإنها لن نعلق وغسلها سUT خلال تغيير الوسائط التالية.
6. مرة واحدة الخلايا الليفية هي متكدسة، نقلها إلى 3X T175 قوارير (مرور 2)، وتجميد في كامل وسائل الاعلام DMEM زائد DMSO 10٪ في الخلايا 1x10 ⁶ / مل في القارورة.

4. توصيف الخلايا الليفية من خلال المناعية

1. الخلايا الليفية الثقافة في 8 جيدا غرفة الشرائح المغلفة مع الجيلاتين.
2. عندما تكون الخلايا في 80٪ confluency، نضح المتوسطة من كل بئر.
3. إصلاح الخلايا في امتصاص العرق 4٪ لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. غسل الآبار 3 مرات مع 1X PBS.
5. Permeabilize الخلايا مع 150 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون X-100 (في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. غسل الآبار 3 مرات مع 1X PBS.
7. إضافة 200 ميكرولتر حل حجب (PBS + 5٪ مصل الماعز العادي (المتجهات، S-1000)) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
8. إعداد التخفيف 1:250 الألغام المضادة للSERPHIN-1 (المضادة للأرنب، MAB، سيغما، S5950-200 ميكرولتر) في عرقلة الحل.
9. Aspirate عرقلة الحل، وإضافة 150 ميكرولتر من التخفيف 1:250 من AntiSERPINH-1. احتضان عند 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو في 4 درجات مئوية خلال الليل.
10. غسل الآبار 3 مرات مع 1X PBS.
11. إعداد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماعز المضادة للأرنب 1:200 (اليكسا فلور الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L)، إينفيتروجن، A11008) في عرقلة الحل.
12. إضافة 150 ميكرولتر من 1:200 الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إلى كل بئر. احتضان لمدة 1 ساعة، في الظلام، في درجة حرارة الغرفة.
13. يغسل مرة واحدة مع الآبار 1XPBS.
14. نضح في برنامج تلفزيوني، ورفع بعناية الدوائر قبالة لتكشف فقط الشريحة.
15. تركيب الشريحة مع 2-3 قطرات من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على دابي (المتجهات، H-1200).
16. تحليل الشريحة تحت المجهر الفلورسنت.

النتائج

الكيراتينية نابتا من القطع الخزعة في أقرب وقت 48 ساعة بعد تشريح. ويمكن ملاحظة الخلايا الليفية أول ثمرة بعد حوالي أسبوع واحد من المعالجة. مرة واحدة وصلت إلى الآبار confluency، و passaged الخلايا الليفية لمدة أكثر الممرات لتصل إلى ثلاث قوارير 150 سم (T150) وcryopreserved الخلايا. نحن تولد م...

Discussion

مع هذا البروتوكول، ويمكن الحصول على الثقافات نقي نسبيا من الخلايا الليفية الجلد. الخلايا الليفية لها سمات شكلية متميزة من ممدود، أجسام الخلايا مثل مغزل، وجولة لنوى الخلايا البيضاوي، والخلايا الليفية تنمو في الانحياز وحزم عندما متموجة. تدعم وسائل الإعلام نمو الخلاي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380
Table A. Table of specific reagents and equipments.
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163
Table B. Reagents.