JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقنية amperometric يقيس الإفراج الدوبامين من خلية واحدة عن طريق الكشف عن الأكسدة الحالية التي تنتجها أكسدة الدوبامين عفوية. في وقت واحد المشبك الجهد ومنهجية amperometry الكشف عن العلاقة بين الآلية "النشاط" الشاملة لنقل الدوبامين والدور التنظيمي لهذا النشاط على النقل العكسي للدوبامين.

Abstract

بعد صدوره في الدوبامين، المشقوق متشابك تمارس خصائصه البيولوجية عن طريق أهدافه قبل وبعد المشبكي-1. يتم إنهاء إشارة الدوبامين عن طريق الانتشار 2-3، الإنزيمات خارج الخلية 4، ونقل الغشاء 5. ونقل الدوبامين، وتقع في الشق شبه متشابك من الخلايا العصبية الدوبامين مسح صدر الأمينات من خلال تدفق الدوبامين الداخل (امتصاص). يمكن للنقل الدوبامين أيضا العمل في الاتجاه المعاكس للافراج عن الأمينات من الداخل الى الخارج في عملية تسمى النقل إلى الخارج أو هروب رأس المال من الدوبامين 5. أكثر من 20 عاما وذكرت سولزر آخرون على نقل الدوبامين يمكن أن تعمل في وضعين من النشاط: إلى الأمام (امتصاص) والعكس (هروب رأس المال) 5. يمكن للناقل عصبي صدر عن طريق هروب رأس المال من خلال نقل نقل كمية كبيرة من الدوبامين إلى الفضاء خارج الخلية، ولقد ثبت أن تلعب دورا رئيسيا في تنظيم الدوبامين خارج الخلية حomeostasis 6. نحن هنا تصف كيف يمكن استخدام المشبك التصحيح في وقت واحد وتسجيل amperometry لقياس الدوبامين صدر عبر آلية هروب رأس المال للقرار ميلي ثانية واحدة عندما الوقت يتم التحكم إمكانية الغشاء. لهذا، يتم قياس كامل الخلية الحالية والأكسدة (amperometric) إشارات في وقت واحد باستخدام مكبر للصوت Axopatch 200B (الأجهزة الجزيئية، مع مجموعة قليلة مرشح تمرير بسل في 1،000 هرتز لخلية كاملة تسجيل الحالي). لتوصيل amperometry تسجيل القطب الكهربائي لألياف الكربون مكبر للصوت الثاني (Axopatch 200B) ويتم وضعها بالقرب من غشاء البلازما والذي عقد في +700 بالسيارات. يمكن تسجيل خلية كاملة والأكسدة (amperometric) التيارات ويمكن أن تتولد العلاقة الحالية ذات الجهد باستخدام بروتوكول خطوة الجهد. على عكس المعتاد المعايرة وamperometric، الأمر الذي يتطلب التحول إلى التركيز، وتفيد التقارير الحالية مباشرة دون النظر في 7 حجم فعالة. وهكذا، فإن البيانات الناتجةتمثل الحد الأدنى لهروب رأس المال الدوبامين بسبب فقدان بعض الارسال في حل الجزء الأكبر.

Protocol

1. تجهيزات ومعدات

  1. جبل قفص فاراداي على رأس جدول الاهتزاز المضادة (TMI) لتقليل الضوضاء الخلفية.
  2. المشبك التصحيح في وقت واحد amperometry نظام التسجيل يتطلب مجهر مقلوب مع عدسات DIC ممتازة وطويلة المسافة عدسة العمل. الاتصال المجهر منارة لبطارية السيارة. وهذا مصدر للضوء لنظام DC مزيد من الانخفاض في الضوضاء الكهربائية.
  3. الهيدروليكية micromanipulators (Siskiyou) مزيد من الضوضاء انخفاض. في التكوين لدينا، ونحن نستخدم متلاعب الحق الوفاض لتسجيل خلية كاملة، واليسار سلم لamperometry.

2. إعداد أقطاب للتسجيل

  1. سحب أسلاك التصحيح باستخدام ماصات الكوارتز على مجتذب P-2000 (سوتر). سحب لدينا تستغرق حوالي 5 ثانية، مع دورات الحرارة اثنين. وقد أدى هذا الوقت الحرارة في المقاومة ثابت (3-4 MΩ) في منطقتنا كلها ماصات التصحيح الخلية.
  2. ملء مع القطبماصة حل يحتوي على 2 ملم والدوبامين تركيبها على تتلاعب الحق. التفاف الحاوية عقد ماصة تحتوي على حل DA مع رقائق الألومنيوم. تبقي على الجليد. الدوبامين هو قابل للأكسدة. والحفاظ على الحل على الجليد، محمية من الضوء خفض معدل أكسدة الدوبامين.
  3. إزالة بلطف (داغان) ProCFE الكربون ضوضاء منخفضة الألياف القطب amperometric من مربع التخزين، وملء مع الزئبق، وجبل على محول amperometric (كما هو مبين في الشكل 1)، ثم جبل على maniupulator الحق. حماية غيض من ألياف الكربون من التلف من خلال عقد نهاية بكثير من ألياف الكربون. تفقد الكهربائي مع مختبر المجهر للتأكد من الطرف نظيفة وسليمة.
  4. فحص سلامة من القطب amperometric عن طريق وضع القطب الكهربائي في طبق بتري أسفل الزجاج تحتوي على حل خارجي. تسجيل خط الأساس الحالية في غياب الدوبامين. إضافة 10 ميكرولتر من حل DA 1mm إلى الطبق. وخير إعادة القطب amperometricالحبال زيادة في الأكسدة الحالية. كرر هذه الخطوة في بداية ونهاية كل تجربة للتأكد من القطب amperometric يعمل بشكل صحيح.

3. إعداد الثقافة الابتدائية العصبية الدوبامين من الخلايا العصبية أو خلايا المهندسة للتعبير عن نقل الدوبامين في أسفل الزجاج أطباق بتري

  1. يغسل بلطف الخلايا أو الخلايا العصبية الدوبامين ثلاث مرات بمحلول الخارجية الدافئة.
  2. تحميل طبق بتري الزجاج السفلي على خشبة المسرح المجهر.

4. تصور الخلية وإجراء التجربة

  1. العثور على نقطة اتصال لتصور الصحيح بوضوح الخلايا. ضغطا إيجابيا على القطب التصحيح. ثم، وجلب بلطف كل من الأقطاب الكهربائية أسفل إلى الحل، وعلى مقربة من الخلية.
  2. وضع القطب الكهربائي amperometric بجوار الخلية (على الجانب الأيسر)، والقطب التصحيح على اليمين.
  3. تحقيق ختم gigaohm على الخلية مع القطب التصحيح. تمزق الختم مع الشفط لتحقيق كامل التكوين الخلية.
  4. السماح 5-8 دقيقة لغسيل الكلى من الحل الداخلي التي تحتوي على الدوبامين في الخلية.
  5. استخدام الجهد المطلوب أو خطوة بروتوكول المنحدر. الحصول على البيانات في وقت واحد من كل من ماصة التصحيح والقطب amperometric لقياس التيارات خلية كاملة وعكس نقل الدوبامين من خلال نقل الدوبامين بينما يتم التحكم في غشاء المحتملة عن طريق ماصة التصحيح.

النتائج

يمكن الجمع بين المشبك التصحيح مع amperometry قياس الجهد التي تعتمد على DAT بوساطة DA هروب رأس المال. الشكل 2A يظهر التكوين ممثل التجريبية وتسجيل هروب رأس المال DA DAT بوساطة عندما فرضت الوسط بين الخلايا وإمكانية الغشاء بواسطة ماصة التصحيح خلية كاملة. باستخدام هذه التقن...

Discussion

في وقت واحد والجهد المشبك amperometry والفوائد التالية. جميع أنواع الخلايا يمكن الوصول إليها، ويمكن استخدامها للتسجيل. تحديد الخلايا العصبية أو حيث تتم التسجيلات هو بسيط ومباشر. على وجه الخصوص، إذا تم fluorescently المسمى الخلية عن طريق إضافة علامة الفلورية للبروتين من الفائدة...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور Sanika شيروا لمراجعة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DA026947، DA021471، وNS071122).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
معدات
مخمدات اهتزاز الجدول ث / فاراداي القفص شركة التصنيع التقنية سلسلة 63-500 نستخدم نموذج 63-543
نيكون المجهر المقلوب TE-2000 نيكون توقف الآن الكسوف تي
اثنين مكبرات الصوت ضوضاء منخفضة axopatch 200B الجزيئية الأجهزة 800-635-5577
1-CV headstage BU 203 الجزيئية الأجهزة 800-635-5578
1-HL-U حامل ماصة الجزيئية الأجهزة 800-635-5579
Digidata 1440A A / D تحويل الجزيئية الأجهزة 800-635-5580
مقتل اثنين من المتلاعبين Siskyou،وسلم حق Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
الليزر ماصة مجتذب سوتر الآلات P-2000 888-883-0128
انخفاض ألياف الكربون القطب الضوضاء amperometric ProCFE www.dagan.com
انخفاض الضوضاء الكوارتز ماصة سوتر الآلات QF100-70-7،5 888-883-0128
12-فولت بطارية السيارة على نطاق واسع
شاحن بطارية السيارة على نطاق واسع
كاشف
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) سيجما S7653
HEPES سيجما H3375
سكر العنب سيجما G7528
كبريتات المغنيسيوم (MgSO 4) سيجما M2643
أحادى فوسفات البوتاسيوم (KH 2 PO 4) سيجما P5655
البوتاسيوم كلوريد (بوكل) سيجما P9333
الكالسيوم تبلور كلوريد (CaCl 2 • 2H 2 0) سيجما 223506
هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2 • 6H 2 0) سيجما M2670
EGTA سيجما E0396

References

  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
  3. Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
  4. Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
  5. Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
  6. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
  7. Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
  8. Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
  9. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
  10. Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
  11. Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

69 Voltametry Voltametry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved