نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Summary

المتفطرة السلية تشكل الأغشية الحيوية المخدرات متسامح عندما تربيتها في ظروف معينة. نحن هنا وصف أساليب لزراعة M. الأغشية الحيوية والسل، وتحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح. وهذه البروتوكولات أن تكون مفيدة لمزيد من الدراسات في آليات التسامح المخدرات في م. مرض السل.

Abstract

المتفطرة السلية، وكيل خاص بأسباب الأمراض من مرض السل البشري، لديه قدرة غير عادية على البقاء على قيد الحياة ضد الضغوط البيئية بما فيها المضادات الحيوية. على الرغم من تحمل الإجهاد من م. مرض السل هو واحد من المساهمين على الأرجح إلى العلاج الكيميائي لمدة 6 أشهر طويلة من مرض السل ^1، والآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا النمط الظاهري مميزة من مسببات المرض لا تزال غير واضحة. لقد تطورت الأنواع الجرثومية العديد من البقاء على قيد الحياة في البيئات المجهدة عن طريق تجميع الذاتي في السطح، ودرجة عالية من التنظيم المرفقة، وهياكل مصفوفة مغلفة تسمى الأغشية الحيوية ^2-4. النمو في المجتمعات ويبدو أن استراتيجية البقاء على قيد الحياة المفضل للميكروبات، ويتحقق من خلال المكونات الجينية التي تنظم مرفق السطح، والاتصالات بين الخلايا، وتجميع المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) ^5،6. ومما يسهل على الأرجح إلى التسامح الإجهاد البيئي من قبل العائد على السهم، وربما من قبل physiological التكيف من عصيات الفردية لmicroenvironments غير متجانسة ضمن بنية معقدة من الأغشية الحيوية ^7.

في سلسلة من الأوراق الأخيرة التي أنشأنا م. والسل، واللخنية المتفطرة لديها ميل قوي للنمو في هياكل متعددة الخلايا المنظمة، ودعا الأغشية الحيوية، والتي يمكن أن تحمل أكثر من 50 أضعاف الحد الأدنى من تركيز المثبطة من الأدوية المضادة للسل الإيزونيازيد والريفامبيسين ^8-10. م. مرض السل، ولكن يتطلب يثير الاهتمام والفضول شروط محددة لتشكيل الأغشية الحيوية الناضجة، في نسبة معينة من فراغ الرأس 9:01: وسائل الإعلام، فضلا عن تبادل محدود من الهواء مع الغلاف الجوي ^9. ربما يمكن أن متطلبات الظروف البيئية المتخصصة أن ترتبط إلى حقيقة أن م. مرض السل هو الممرض تلزم الإنسان، وبالتالي تكيفت مع البيئات الأنسجة. في هذا المنشور نظهر طرق زراعة M. مرض السلالأغشية الحيوية في زجاجة، وشكل لوحة 12-جيد، وهو مناسب للدراسات البكتريولوجية وكذلك الوراثية. وقد وصفت نحن على بروتوكول لسلالة ضعيفة من م. والسل، ومولودية ² 7000، مع الحذف في مواضع اثنين، panCD وRD1، التي تعتبر بالغة الأهمية للنمو في الجسم الحي من ⁹ الممرض. ويمكن استخدامها بأمان هذه السلالة في احتواء BSL-2 لفهم البيولوجيا الأساسية للمرض السل الممرض وبالتالي تجنب شرط وجود مرفق BSL-3 باهظة الثمن. ويمكن تمديد هذا الأسلوب، بعد إجراء التعديلات المناسبة في وسائل الإعلام، أن ينمو بيوفيلم من الأنواع الأخرى بالمتفطرات زروع.

وعموما، فإن بروتوكول موحد للاستزراع الأغشية الحيوية بالمتفطرات مساعدة المحققين المهتمين بدراسة الخصائص الأساسية مرونة من متفطرات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن طريقة واضحة وموجزة من الأغشية الحيوية بالمتفطرات متزايد يساعد أيضا في الجرد السريرية والدوائيةestigators لاختبار مدى فعالية دواء المحتملة.

Protocol

1. تزايد الأغشية الحيوية من M. مرض السل في زجاجة المسمار 250ml الاتحاد توج

1. وسائل الاعلام التحضير: ذوب 0.5g من KH ₂ PO _4، 0.5g من MgSO _4، 4G من الهليونين-L، 2G من حامض الستريك، 0.05g من سيترات الأمونيوم الحديديك، 60mL من الجلسرين في 900mL من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم. الأوتوكلاف، باردة وفقط قبل بدء التجربة، إضافة ZnSO معقم ₄ إلى تركيز النهائي من 0.1٪ ث / v منذ مولودية ² 7000 هو عوني التغذي بانتوثينات هذه السلالة يتطلب أيضا حامض البانتوثينيك في 10μg/mL من تركيز نهائي.

ملاحظة: هذا هو تكوين معيار وسائل الإعلام Sauton لاستخدامها لمرض السل م. ومع ذلك، يمكن إذا لزم الأمر أيضا وسائل الإعلام المتخصصة الأخرى يمكن استخدامها للأنواع الأخرى بالمتفطرات.

2. اللقاح إعداد: م. تنمو مرض السل في 7H9OADC مع 0.05٪ توين-80 لمدة أسبوع، أو OD ₆₀₀ بنسبة 0.7 إلى 1.0. وطبقا لتقديراتويمكن استخدامها مباشرة كما lture اللقاح حتى التخفيف 1:100.
3. الاستغناء عن وسائل الإعلام 25mL Sauton لزجاجة المسمار البوليسترين توج 250ml الاتحاد (كورنينج). إضافة 250μl من اللقاح على المدى المتوسط، وكأب الزجاجة بإحكام جدا ووضعه دون عائق في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع. مراقبة زجاجة مرة واحدة كل يوم للتأكد من عدم وجود تلوث.
4. في نهاية الأسبوع الثالث، وتخفيف الحد الأقصى من القمقم للسماح للمزيد من النمو من م. مرض السل في واجهة. إذا لم يتم تخفيف الغطاء في هذه المرحلة ثم فإن تركيز الاكسجين في حاوية تؤخر تحقيق المزيد من النمو من البكتيريا.

2. نمو م. الأغشية الحيوية السل في 12-جيدا لوحات

1. تعد وسائل الإعلام واللقاح من مولودية ² 7000 كما هو موضح في المقاطع A1 و A2.
2. مزيج من وسائل الإعلام مع 60mL 600μl من اللقاح. الاستغناء 4.5mL من الخليط في كل بئر من لوحة. تغطية لوحة مع غطاء. التفاف لوحة عدة مرات مع parafilm. احتضان لوحة دون عائق في حاضنة مرطب على 37 درجة مئوية لمدة 5 أسابيع.

3. تحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح في م. السل الأغشية الحيوية

1. تنمو م. والأغشية الحيوية مرض السل في شكل 12-جيدا كما هو موضح في الفرع باء يستغرق ذلك ما مجموعه نحو أسبوعين-5.
2. مرة واحدة ونضجت الأغشية الحيوية (بعد 5 أسابيع من حضانة) حقن اختيارك للمضادات الحيوية في تركيز المطلوب في وسائل الاعلام تحت الأغشية الحيوية باستخدام microtip في ماصة.

ملاحظة: إن حجم وسائل الاعلام تحت pellicles يقلل إلى حوالي 3.0mL. لذا يجب أن المحققين وفقا لذلك حساب كمية من المخدرات.

3. دوامة لوحة بلطف بحيث تنتشر تماما المضادات الحيوية على المدى المتوسط. لتحقيق نتائج يعتد بها إحصائيا، حقن عنتيبيأذني في أربعة آبار. في موازاة ذلك، حقن نفس الحجم من المذيب الذي تم حله في المضادات الحيوية في الآبار الأربعة الأخرى، وترك الماضي أربع آبار من لوحة لم يمسها. تغطية لوحة مع غطاء ووضع طبقات جديدة من parafilm حول اللوحة. وضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة الوقت المطلوب.
4. في نهاية الحضانة، وفتح لوحة وإضافة توين-80 للتركيز النهائي من 0.1٪ (حجم / حجم) في كل من الآبار. دوامة لوحة كاملة بلطف لتشتيت موحد للمنظفات. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. مزيج من كل محتوى جيد مع عدة مرات ماصة بحيث يمكن أن المحتوى كله بشكل موحد على نقل أنبوب مخروطي 15mL.
5. تدور باستمرار على محتوى أنبوب في 4000rpm لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Resuspend لبيليه في 5ml من عازلة غسيل الطازجة (PBS مع الجلسرين بنسبة 10٪ و 0.05٪ توين-80). تكرار الغسيل ثلاث مرات. Resuspend لبيليه في 5ml من غسل العازلة. يبقيه على الكرسي الهزاز لسvernight في 4 درجات مئوية.

ملاحظة: على الرغم من أن وضعت أصلا لدرجة حرارة منخفضة اللخنية M. (للحد من نموها خلال تشتت)، ويستخدم لمرض السل م وكذلك، لا يمكن على الأرجح الأنواع بطيئة النمو أن هزت في درجة حرارة الغرفة دون أي تأثير على النتيجة. يمكن أن تعصف في درجة حرارة الغرفة يكون ضروريا إذا كان يعمل في BSL-3 المرفق.

6. إعداد محقنة معقمة مزودة microtip (2-200μl) عن طريق خفض نهايته واسع إلى الحجم المناسب، من المناسب أن الحقنة والتغليف مع parafilm. تمرير مضمون كامل للأنبوب عن طريق حقنة طرف المجهزة، وجمع في أنابيب 1 15mL الطازجة. كرر هذه الخطوة 5 إلى 6 مرات حتى كنت مراقبة وقف متجانسة إلى حد ما.
7. إعداد التخفيفات التسلسلي للتعليق على لوحة والتخفيفات في لوحة 7H11OADC لتحديد عدد من المستعمرات قابلة للتطبيق في كل بئر. احتضان لوحات لمدة ثلاثة أسابيع في الحاضنة 37 درجة مئوية. تحديد الترددقبرصي من صوامد في عدد السكان بيوفيلم عن طريق حساب نسبة من عدد من المستعمرات التي تم الحصول عليها في المضادات الحيوية المعالجة لتلك التي حصلنا عليها في مذيب لوحات المعالجة.

4. ممثل النتائج

عندما تربيتها في زجاجة، والنمو من م. ويمكن رؤية مرض السل في قاعدة الزجاجة بحلول نهاية الأسبوع الأول. في نهاية الأسبوع الثاني، يمكن أن ينظر نمو غير مكتمل من البكتيريا في الهواء واجهة وسائل الإعلام، على الرغم من النمو في الهواء واجهة وسائل الإعلام مرئيا دائما في نهاية الأسبوع الثالث (الشكل 1A). في هذا الوقت لوحظ أيضا المرفق من البكتيريا على جدار الوعاء. من هذه النقطة وصاعدا نمو ثقافة يحدث في المقام الأول على واجهة الهواء وسائل الاعلام. السائل تحت سطح نمو واضح. عادة، وهيكل نضوج بحلول نهاية الأسبوع الخامس (الشكل 1B). إذا الحضانة لفترات طويلة، وسوف تبدأ في الهياكل تنزل الى قاع الإناء. يثير الاهتمام والفضول،تشديد الحد الأقصى حتى نهاية الأسبوع الثالث هو خطوة هامة في هذه العملية، وذلك لأسباب غير معروفة زجاجة فضفاض وتوج يؤخر بشكل كبير الشروع في النمو على واجهة ^9.

في شكل 12-جيدا، وينظر إلى بيوفيلم قوي في الهواء واجهة وسائل الإعلام في كل من الآبار في نهاية خمسة اسابيع (الشكل 2A). إذا لم يتم لف لوحات تماما بعد ذلك لوحظ الفرق نمو بيوفيلم. في أسوأ الحالات، يمكن أن مهمة وسائل الإعلام تبخر المماطلة في نمو البكتيريا (الشكل 2B). وبالتالي، التفاف من لوحة من الضروري على حد سواء لمنع التبخر وكذلك لتوفير البيئة لتشكيل بيوفيلم (انظر الفقرة السابقة).

عدد عصيات قادرة على البقاء في الأغشية الحيوية يحدد مع هذا الأسلوب هو تكرار للغاية. استجابة من M. السل الأغشية الحيوية يختلف مع طبيعة من المضادات الحيوية. للحصول على المضادات الحيوية للجراثيم مثل الريفامبيسين، وفقدان القدرة على الاستمرار في أعقاب bipha كذا اتجاه ^9. الانحدار السريع في جدوى خلال الأيام الثلاثة أو الأربعة الأولى، تليها مرحلة المستمرة التي نسبة مئوية صغيرة من السكان ما زالت المتمردة تماما للمضادات الحيوية بغض النظر عن تركيز المضادات الحيوية أو وقت التعرض. ويبين الشكل 3 عدد عصيات قادرة على البقاء في الأغشية الحيوية ناضجة بعد التعرض لمدة 7 أيام على 50μg/mL (50 مرات أعلى من MIC) من الريفامبيسين.

رقم 1A. ظهور في وقت مبكر من م. عصيات السل في الهواء واجهة وسائل الإعلام من البكتيريا بعد 3 أسابيع من الحضانة.

نضجت الشكل 1B. الأغشية الحيوية من م. مرض السل في الهواء واجهة وسائل الإعلام بعد خمسة أسابيع من الحضانة.

820/3820fig2A.jpg "/>
2A الرقم 5 أسابيع الأغشية الحيوية القديمة م. السل نمت في شكل جيد 12.

2B شخصية. محاولة فاشلة لتنمو M. ​​الأغشية الحيوية السل في 12 لوحة من دون parafilm جيدا.

الشكل 3. مؤامرة ممثل تبين تواتر صوامد المخدرات متسامح في م. السل الأغشية الحيوية التي تزرع في 12-جيدا شكل والمعرضين لل50μg/mL من الريفامبيسين لمدة سبعة أيام.

Discussion

الدرن (السل)، والناجمة عن الإصابة بمرض السل المتفطرة، لا يزال يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة العالمية. وتشير التقديرات إلى ما يقرب من ثلث سكان العالم مصابون بهذا المرض asymptomatically من قبل الممرض، ونحو 9 ملايين حالة جديدة تظهر في عيادة في كل عام مع أعراض مرض السل الن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	VWR international	Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles	Fisher Scientific	03-374-300
12-well tissue culture plate	VWR international	62406-165
50-mL conical tubes	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Chromatographic refrigerator	VWR international	55702-520
petri dish	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasic)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
citric acid	Sigma-Aldrich	C1857-100G
ferric ammonium citrate	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glycerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-pantothenic acid	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC Enrichment	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
250mL storage bottle	Corning	430281
12 well plates	Falcon BD	353043
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
methanol	JT Baker	9070-05
10mlLsyringe	BD Biosciences	301604
1-200μL pipet tips	VWR international	89079-458
parafilm M	VWR international	PM-996
15mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic)	Sigma-Aldrich	S0876-500G