السريرية اختبار وإزالة العمود الفقري الحبل في الفأر نموذج لتصلب الأنسجة العضلية الجانبية (ALS)

Summary

يتم فحص الفأر نموذج لتصلب الأنسجة العضلية الجانبية (ALS) سريريا وسلوكيا. كشرط أساسي لتحليل 1 immunohistological المرافق وصفت إعداد الحبل الشوكي بالتفصيل.

Abstract

التصلب الجانبي (ALS) هو اضطراب الاعصاب المميتة مما أدى إلى تدهور تدريجي من العصبونات الحركية. ذروة بداية نحو 60 عاما لهذا المرض متفرقة ونحو 50 سنوات لمرض عائلي. نظرا لمساره التدريجي، 50٪ من المرضى يموتون في غضون 30 شهرا من ظهور الأعراض. من أجل تقييم خيارات العلاج رواية لهذا المرض، وقد ولدت نماذج الماوس الوراثية من المرض على أساس عائلي الإنسان طفرات في الجين الهيئة العامة للسدود، مثل الطفرة (G93A) SOD1. أهم الجوانب التي لا بد من تقييمها في النموذج هي عموما البقاء على قيد الحياة، وبطبيعة الحال السريرية وظيفة الحركة. هنا، علينا أن نبرهن على التقييم السريري، وتبين البدء في عمل اختبارين محرك السلوكية وتوفير أنظمة التسجيل الكمي لجميع المعلمات. لأن في تحليل معمق لنموذج الفأر المرض وعادة ما يتطلب دراسة المناعى من الحبل الشوكي، وعلينا أن نبرهن إعداده بالتفصيل تطبيق فعلrsal استئصال الصفيحه طريقة. وأظهرت النتائج النسيجية نموذجية. فإن التطبيق الشامل لطرق الفحص صورت في دراسات عن نموذج الفأر من المرض تمكن الباحث لاختبار موثوق الخيارات العلاجية في المستقبل والتي يمكن أن تشكل أساسا لتجارب اكلينيكية على البشر في وقت لاحق.

Protocol

وقد تم شراء الحيوانات من مختبر جاكسون (# 002726) ^1. وسجل سريريا أنهم وتعرض لاختبار وظيفة الحركة (rotarod الاختبار) وقوة العضلات (شنقا اختبار الأسلاك). وقد تم تنفيذ جميع هذه الاختبارات، وقتل في وقت لاحق من هذه الحيوانات من اجل اعداد الحبل الشوكي وفقا قريبة جدا من المبادئ التوجيهية المحلية لحسن السلوك من التجارب على الحيوانات.

1. السريرية نقاط

ويتم فحص وبصرف النظر عن تقييم للفئران من وزن الجسم لعلامات العجز الحركي بما يلي 4 نقاط سجل النظام ^2:

4 نقاط: عادي (أي علامة على ضعف المحرك)

3 نقاط: الهزات أطرافه الخلفية واضحة للعيان عندما علقت من ذيله

2 نقاط: شذوذ مشية موجودة

(1) نقطة: سحب واحد على الأقل أطرافهم هند

0 نقطة: متناظرة والشلل، وعدم القدرة على الحق نفسه أو فقدان 20٪ من وزن الجسم أقصى، وفي هذه الحالة يصرح باستخدامها فورا الحيوانات ويتم إنهاء التجربة

2. اختبارات وظيفة الحركة وقوة العضلات

سلك معلق

ويستخدم هذا الاختبار لتقييم قوة العضلات ^{3 و 4.} جميع الحيوانات إجراء هذا الاختبار واحد على الأقل أو بعد يومين من اختبار rotarod. تغطية 60 سم فوق القش وضعت كل الماوس على غطاء السلك حسب المقاس مع فترات من 0.8 سم، واتجهوا بحذر رأسا على عقب، أسفل. بعد تدريب لثلاث مرات متتالية ما لا يقل عن 180 ق يقاس الكمون في الانخفاض. وتعطى كل فأر تصل إلى ثلاث محاولات الابقاء على الغطاء المقلوب لمدة أقصاها 180 ق، وتسجل أطول فترة.

Rotarod إختبار

ق استخدمت = "jove_content"> وجهاز rotarod (أوغو باسيلي، Comerio، ايطاليا) لقياس التناسق الحركي والتوازن والقدرة على التعلم الحركي ^{3 و 4.} أداء جيد يتطلب درجة عالية من التنسيق الحسية. يجب وضع الجهاز في بيئة هادئة وغير مزعجة، لتجنب المنبهات تتناقض لاختبارها على الحيوانات. وهو يتألف من مغزل بالمحركات الكمبيوتر التي تسيطر عليها بالتناوب والممرات خمسة لمدة خمس الفئران. تم الكشف عن السقوط من الفئران تلقائيا بواسطة الضغط على طبق من البلاستيك في الجزء السفلي. بعد يقاس تدريب لثلاث مرات متتالية ما لا يقل عن 180 ق بسرعة ثابتة من 15 دورة في الدقيقة في الوقت الذي حيوان يمكن أن تبقى على قضيب الدورية. كل حيوان يخضع لثلاث محاكمات، وأطول من دون كمون يتم تسجيل هبوط. يتم اختيار وقت من 180 ق كما قطع الوقت لأن يتم الكشف عن الغالبية العظمى من اختلافات كبيرة في التنسيق الحركي في هذا الإطار الزمني.

3. الحبل الشوكي التحضير

1. وقتل الحيوانات عن طريق نفخ CO ₂ وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية وperfused فورا transcardially مع حل PBS يعقبه حل بارافورمالدهيد 4٪.
2. من أجل إعداد الحبل الشوكي من الفأرة التضحية، يتم وضع الحيوان على جدول تشغيل ويتم إصلاح الأطراف الأربعة على الجانب من أجل فضح الجانب الخلفي من الماوس.
3. وغسل قصير مع حل الإيثانول 70٪ ينظف موقع من تشريح ويسطح معطف الشعر.
4. ثم يتم شق الجلد مع مشرط حاد في خط الوسط. من أجل تسهيل قطع يتمدد الجلد لكلا الجانبين. إذا يجب أن تكون مستعدة عضلات الساق، كما أن بشرتهم قطعي.
5. بعد الانتهاء من شق الجلد، ويتم سحبها جانبا مع زوج من ملاقط لفضح اللفافة الكامنة السطحية من الجسم.
6. عضلات الرقبة والرباط القفوي يجب ازالتها وهي كاليفورنياأعد refully. يجب الحرص على عدم شق إلى الحبل الشوكي بعمق وآفة. ويمكن أيضا للعضلات الكتف يمكن إزالتها من أجل فضح أفضل العمود الفقري.
7. ثم تتم إزالة عضلات مجاورة للفقرة من العمود الفقري بأكمله.
8. من أجل فتح laminectomies العمود الفقري عدة لا بد من القيام بها. ينبغي للمرء أن يبدأ من الجزء العلوي في الجمجمة في موقع مشترك الفهقي القذالي.
9. من الأسهل لإزالة التثبيت في الأطراف العلوية 2 وتجهد الرقبة لتكون أكثر قدرة على أداء استئصال الصفيحة الفقرية للفقرات الأولى. يتم سحب هذه بعيدا دون لمس تعرض الحبل الشوكي عنق الرحم.
10. تتم إزالة أكثر من فقرات بواسطة transecting 1 الأقواس الفقري في كلا الجانبين مع مقص الزاوية ومن ثم سحب على العمليات ظهري. يجب إزالة أجزاء الجانبي المتبقية من فقرات لتسهيل الإزالة الكاملة في وقت لاحق من الحبل الشوكي.
11. معلما التشريحية للالفقري القطنيالحبل ل هو intumescence أن هذا هو ايضا في النخاع الشوكي عنق الرحم.
12. بعد ان انتهى لاستئصال الصفيحه من الحبل الشوكي بأكمله، تأكد من أن القطع أيضا عن جذور بطني والافراج عن الحبل الشوكي من الأم الجافية للسحايا.
13. ثم يتم قطع الحبل الشوكي العنقي cranially والبدء في إزالة الحبل الشوكي.
14. أخيرا تم أيضا قطع الحبل الشوكي في ذيل الفرس، البعيدة تماما أن يكون صدر.
15. في النهاية، يتم وضع الحبل الشوكي الى حل (لامتصاص العرق مثلا 4٪) بين عشية وضحاها postfixating ويمكن معالجة أخرى. نحن cryosection عادة الحبل الشوكي كي يكون جاهزا لتحليل immunohistological.

4. ممثل النتائج

أسلوب إعداد الحبل الشوكي يمثل محور هذه المقالة الفيديو. وهو شرط أساسي لباجتزاء الأنسجة في وقت لاحق، وفي نهاية المطاف لتحليل immunohistological من الحبل الشوكيالمقاطع ل الحبل. كمثال على نتيجة نهائية، وهي workup المناعى للمنطقة القرن الأمامي للنخاع الشوكي القطني الماوس لwildtype (بالوزن)، وعلى الهيئة العامة للسدود G93A التحوير (TG) ويظهر الماوس. يمكن التعرف على الخلايا العصبية الحركية مع الأجسام المضادة لمكافحة دردش الابتدائية ووضع العلامات فلوري لاحق مع الأجسام المضادة Cy3 الثانوية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء النووية لمكافحة وصمة عار مع دابي (4،6-diamidino-2-phenylindole) (الشكل 1).

الشكل 1. photomicrographs نيون الرؤية وكشف مناعي من العصبونات الحركية المضادة للCHAT الأجسام المضادة (أحمر) ونوى الخلايا لمكافحة وصمة عار بواسطة دابي (الأزرق) في الماوس قطني القرن الأمامي للنخاع الشوكي لwildtype (بالوزن) (على اليسار) و 1 الهيئة العامة للسدود G93A المعدلة وراثيا (TG) (على اليمين) الماوس في سن ال 130 يوما. مقياس شريط: 40 ميكرون.

كما أن تحليل المناعى للالهيئة العامة للسدود والفئران G93A ليس في نطاق أساسي من هذه المادة يرجى الاطلاع على المنشور الأصلي الذي اتسمت هذه الفئران المعدلة وراثيا وتلك الأكثر حداثة التي تدرس المناهج العلاجية للإشارة أخرى ^{1، 5، 6.} وينبغي إذا يجب التمييز بين الآثار العلاجية على مستوى immunohistological محددة بوضوح أن تطبق خوارزميات التقييم الكمي يدعمها البرنامج stereological (انظر على سبيل المثال ^7).

Discussion

و(G93A) SOD1 نموذج الفأر الوراثية هو نموذج حيواني قيمة لدراسة مسار مرض فقدان العصبون الحركي تقدمية مماثلة لمرض التصلب الجانبي الإنسان ^8. وقد تم تقييم مجموعة متنوعة من نماذج معاملة مختلفة في هذا النموذج، وتمثل الأساس للاختبار في وقت لاحق الإنسان ^8-10 الدراسات ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
	الصانع	طلب معلومات
السلوكية اختبار
روتا رود لالفئران	أوغو باسيلي، Comerio، إيطاليا	# 47600
شنق جهاز سلك	تفصيل
الحبل الشوكي التحضير
عملية الجدول تشغيل مصباح قفازات واقية
"ايريس" مقص، إلى جانب الزاوية	أدوات العلوم الدقيقة، هايدلبرغ، ألمانيا	14063-09
مقص الربيع كوهان، Vannas، على التوالي	أدوات العلوم الدقيقة، هايدلبرغ، ألمانيا	15000-10
الملقط الصغير	Hammacher، زولينغن، ألمانيا	HWC 111-10
مشرط "präzisa زائد"	Dahlhausen، كولونيا، ألمانيا	11.000.00.510، والتين 10