الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Summary

ومضان في الموقع تهجين (FISH) طريقة للكشف عن الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي بصريا باستخدام المجهر مضان. يتم إجراء تحقيق مع خصوصية لRNA فيروسي ومن ثم يمكن تحديدها باستخدام مزيج من تقنيات التهجين والمناعي. هذه التقنية توفر ميزة التعرف على توطين RNA فيروسي أو الحمض النووي في الدولة ثابتة، وتوفير المعلومات بشأن التحكم في الخلايا أحداث الاتجار فيروس.

Abstract

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles ¹.

FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis ²², FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA³. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests ^4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events ⁶. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) ⁷, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus ⁸.

Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Protocol

1. مسبار التحضير

1. خلاصة 1 ميكروغرام من ناقلات في النسخ المختبر، PKS (+) بول 236nt ⁹ مع Kpn1 الانزيم في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وتشغيل المنتج DNA خطي على هلام الاغاروز. وينبغي أن يكون جزء ما يقرب من 2500 سنة مضت.
2. قطع جزء من هلام وتنقية باستخدام مايكرو روش استخراج جل أزل كيت (يتم سرد كافة الكواشف المستخدمة في الجدول رقم 1). أداء شطف النهائي في 30 العازلة شطف ميكرولتر. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج على هلام الاغاروز للتحقق من تنقية.
3. مزيج 1 في رد فعل النسخ المختبر (انظر الوصفة أدناه) باستخدام الحمض النووي الريبي DIG روش وضع العلامات عدة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

في رد فعل النسخ المختبر:

خطي الحمض النووي	23 ميكرولتر
1X DIG RNA وضع العلامات مزيج (روش)	4 ميكرولتر
1X تراnscription العازلة	8 ميكروليتر
20U ريبونوكلياز OUT	1 ميكروليتر
80U بوليميريز الحمض النووي الريبي T7	4 ميكرولتر
مجموع	40 ميكرولتر

4. إضافة 228 U من أنا الدناز واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
5. وقف رد فعل عن طريق إضافة EDTA درجة الحموضة 8.0 إلى تركيز النهائي من 20 ملم.
6. تنقية رد فعل باستخدام أعمدة الدوران السريع من شركة روش على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة.
7. تنقية التحقيق من قبل هطول الأمطار مع 1/10 حجم DEPC المعالجة الحموضة NaOAc 3M 5.2 و 2.5 من حجم الجليد الباردة الايثانول 95٪. خلط واحتضان في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ليلة وضحاها.
8. أجهزة الطرد المركزي لجنة التحقيق لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في ز س 15000.
9. إزالة طاف ويغسل بيليه في الجليد الباردة الايثانول 70٪. منبذة مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في ز س 15000.
10. إزالة طاف وتجفيف بيليه. Resuspend لبيليه في 50 ث ميكرولترالعاطر (الدناز / ريبونوكلياز الحرة) التي تحتوي على 10 يو إينفيتروجن ريبونوكلياز OUT.
11. ويقدر تركيز التحقيق من قبل القياس الطيفي (الحمض النووي الريبي التدبير في 260 نانومتر)، وتمييع للتركيز من 5 نانوغرام / ميكروليتر. متجر في aliquots عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة قصيرة الأجل الاستخدام، أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. فمن المستحسن على القيام بمقارنات بين الحفاظ على فحص لذلك فإن لهذا قسامة.

2. خلية التثبيت

1. من المهم في البداية على خلايا البذور ملتصقة على غير المعالجة، coverslips زجاجية معقمة وبالتالي فإن confluency النهائي على حصاد ما يقرب من 70-80٪. بالنسبة لغير ملتصقة الخلايا، وتنمو بشكل طبيعي وعندما تصبح جاهزة لجمع واحتضان لهم coverslips التي تم التعامل مع 0.01٪ وزن / حجم بولي-L-يسين (سيغما الدريخ، وشركة) لمدة 1 ساعة. لنموذجي لوحة البوليسترين 12-جيدا زراعة الأنسجة (3.8 سم ^2)، ومطلي 150000 الخلايا (على سبيل المثال هيلا) في 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن. ويمكن أن يصيب الخلايا غير ملتصقة أو transfected كالمعتاد وسمح لإعلانهنا لزلات غطاء زجاجي قبل تثبيت ^3.
2. تجاهل وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع المالحة 1X الفوسفات مخزنة على استعداد في الماء المقطر مزدوجة (DPBS) لمدة 1 دقيقة. Diethylpyrocarbonate (DEPC، سيغما الدريخ، وشركة) لمعاملة سيئة ويمكن أيضا أن تستخدم 1X برنامج تلفزيوني، ويمكن في برنامج تلفزيوني بدون علاج لكن ليس لأنها قد تحتوي على انزيمات ريبونوكلياز.
3. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة لامتصاص العرق 4٪، وهو ما يكفي لتغطية الخلايا تماما. احتضان عن 15-20 دقيقة.
4. تجاهل paraformaldeyhyde وغسل الخلايا مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
5. تجاهل DPBS وإضافة 0.1 M جليكاين (المنحلة في DPBS 1X). احتضان لمدة 10 دقيقة.
6. تجاهل جليكاين وغسل الخلايا مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
7. تجاهل DPBS وإضافة 0.2٪ تريتون-X (الذائبة في DPBS 1X). احتضان ل5-10 دقيقة. إذا تلطيخ للبروتينات المغلف نويي أو النووية، permeabilize مع تريتون X-100 لمدة لا تتجاوز 5 دقائق أو توطين بروتين سيصبح منتشر.
8. تجاهل تريتون X-100، ويغسل مرة واحدة في1X DPBS ل 1 دقيقة.
9. عن التخزين الطويل الأجل، يحل محل برنامج تلفزيوني مع الايثانول 70٪، ومخزن في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أشهر. بدلا من ذلك، وتغسل مرة أخرى مع 1X DPBS والمضي لصيد السمك.

3. مضان في تهجين موضعية (سمكة)

1. إذا كانت مخزنة في coverslips في الإيثانول، يستعاض عن الايثانول مع 1X DPBS وتسمح للخلايا لترطيب لمدة 30 دقيقة. ويمكن أن يتم بين عشية وضحاها الإماهة إذا تم تخزين coverslips في 4 درجة مئوية.
2. غسل coverslips مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
3. إعداد الشرائح لاحتضان وcoverslips يوم، مع الحرص على تنظيف وتسمية لهم الخير.
4. لساترة 18mm، بإضافة 50 ميكرولتر من حل الدناز (25 وحدة / ساترة، متوفرة تجاريا) إلى الشريحة. إضافة ساترة، وتأكد من وضعه الجانب الخلية إلى أسفل، واحتضان ذلك لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. غسل coverslips مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
6. إضافة 50 مزيج تهجين ميكروليتر (انظر الوصفة أدناه) في ساترة علىشريحة واحتضان الجانب خلية ساترة أسفل ل16-18 ساعة عند 42 درجة مئوية. ينبغي أن يقوم على حضانة في علبة تحتوي على 50٪ formamide، 2X SSPE مزيج (12.5 مل formamide منزوع الأيونات، 2.5 مل 20X SSPE، 10 مل ماء).

ميكس التهجين (واحدة ساترة، و 50 ميكرولتر):

كمية من الأوراق المالية	مادة (في تركيز النهائي)
25 ميكرولتر	Formamide، 50٪ (منزوع الأيونات، أي المصدر)
5 ميكرولتر (من 10 ملغ / مل)	الحمض الريبي النووي النقال، 1 ملغ / مل (سيغما الدريخ، المؤتمر الوطني العراقي)
5 ميكرولتر (من 20X)	SSPE، 2X
5 ميكرولتر (من 50X)	Denharts، 5X
0،125 ميكروليتر (من 5 وحدات)	ريبونوكلياز OUT
5 ميكرولتر (25 نانوغرام من 5 نانوغرام / ميكرولتر)	مسبار
5 ميكرولتر	H 2 O DEPC، لجعل النهائيحجم 50 ميكرولتر

7. احتضان جانب الخلية coverslips عليها في formamide ميكرولتر 50 50٪ (المخفف في DPBS 1X) لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية.
8. غسل coverslips مرتين في SSPE 2X بواسطة تفرخ لهم الجانب الخلية إلى أسفل في 50 SSPE 2X ميكروليتر (20X SSPE المخفف في DPBS 1X) لمدة 5 دقائق كل حوالي 42 درجة مئوية.
9. غسل coverslips في 1X DPBS ل 1 دقيقة.

4. المناعي تلطيخ

1. منع coverslips عن طريق وضعها الجانب خلية أسفل في 50 حل 1X ميكرولتر حجب روش (10X روش حل حجب المخفف في DPBS 1X) لمدة 30 دقيقة.
2. احتضان الجانب خلية coverslips بانخفاض في 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. يجب تخفيفه لمكافحة DIG الأضداد وفقا لاتجاه الشركة المصنعة في 1X حل حظر. إذا كان يتم استخدام الأجسام المضادة الأخرى إلى وصمة البروتينات، يمكن إضافة أنها في تركيز الصحيح شريطة أن يتم اشتقاق كل الأجسام المضادة المستخدمة من المواصفات مضيف مختلفةالمنشأ.
3. غسل coverslips لمدة 10 دقيقة في 1X DPBS.
4. احتضان الجانب خلية coverslips بانخفاض في 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ويمكن استخدام اليكسا فلور، مترافق الأجسام المضادة (إينفيتروجن) لتوليد مجموعة واسعة من الألوان، وتستخدم في 1:500 في 1X حجب DPBS، حل 1X.
5. غسل coverslips مرتين لمدة 10 دقيقة في كل من DPBS 1X.
6. تجف الجانب خلية coverslips حتى على ورقة Whatman. مما لا شك فيه لتغطية coverslips لتجنب التعرض للضوء والتبييض.
7. بمجرد تبخرت كل السائل، وتركيب coverslips على شرائح جديدة باستخدام 8 ImmunoMount ميكروليتر (الحرارية العلمية، وشركة). اضغط بلطف إلى أسفل ساترة للقضاء على أي فقاعات الهواء.
8. تطبيق طلاء الأظافر على حواف ساترة لضمان الحصول عليها في المكان.
9. التصور من الحمض النووي الريبي والبروتينات من خلال تقنيات الفحص المجهري هو أيضا عاملا حاسما في نجاح هذه التقنية. يمكن أن الإعدادات على الاداة المستخدمة تساعد او تعيق التصور لذلك هو المفتاح الذييتم تعيين الإعدادات على مجهر بشكل صحيح وتكون متسقة من عينة واحدة لأخرى في تجربة معينة. لإعدادات المجهري مفصل، والبصريات وتركيبات الأجسام المضادة يرجى الاطلاع على المراجع ^1،10.

5. ممثل النتائج

ويمكن رؤية مثال على تلطيخ RNA الفيروسي في الشكل 2. ويعتبر الحمض النووي الريبي لفيروس HIV-1 في جميع أنحاء السيتوبلازم عرض منتشرة في معظم الأحيان، على الرغم من punctae هيولية صغيرة ليست غير شائعة. ويمكن ملاحظة خصوصية من خلال مقارنة الخلايا إيجابية إلى الخلايا المحيطة التي يتم عرضها لا مضان. كما ذكر في المقدمة، HIV-1 الذي يفتقر إلى البروتين القس التنظيمية وتنتج الحمض النووي الريبي التي يتم الاحتفاظ في نواة: هذا يمكن تصور كإشارة مشرق في النواة، وعدم وجود إشارة مضان RNA في السيتوبلازم. overexpression من البروتينات الخلوية هي أيضا قادرة على تحويل التوزيع من الحمض النووي الريبي HIV-1 الفيروسية. في الشكل 2 ، وoverexpression من البروتينات الضالعة في الاتجار حويصلة endosomal (على سبيل المثال، Rab7-الليزوزومية التفاعل البروتين (RILP) ¹¹ أو N-عضال RILP حذف (RILPN) ^11، والبروتينات التي تتداخل مع وظيفة الحركة داينين ​​[مثل p50/dynamitin ^{1، 12]،} تتداخل مع التعريب ثابتة للدولة طبيعية من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي وفقا لما يحدده تحليل FISH RILP التعبير يؤدي إلى إعادة توطين من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي إلى أنيبيب مركز منظمة (MTOC) ^13؛. RILPN يشتت أواخر الإندوسومات داخل السيتوبلازم بسبب عدم القدرة على ربط p150 ^تغر من مجمع السيارات داينين ^​​14 و كتل p50/dynamitin الوحيدات كبير من السيارات داينين ​​والنشرات الإندوسومات في وقت متأخر ولكن أيضا الفيروسي RNA الجينومية وHIV-1 البروتينات الهيكلية على هامش خلية ¹ (الشكل 2). والتلاعب في توطين الحالة المستقرة من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي، ومساهما رئيسيا للعدوى منجزيئات الفيروس، سيكون مفتاح التنمية في نهاية المطاف من العلاجات. في أيدينا، RNA فيروسي يظهر في الخلية في أقرب وقت 3 ساعات ما بعد ترنسفكأيشن وإصابة ⁽¹⁰⁾ ويصبح ملاحظتها بسهولة بواسطة هذه التقنية والأسماك 12 ساعة.

الشكل 1. وتزرع الرسم البياني للبروتوكول لFISH / إذا شارك في التحليلات. خلايا coverslips ثم ثابتة مع لامتصاص العرق. تجرى العلاجات من جليكاين وتريتون X-قبل أن يتم استخدامها إما الخلايا للسمكة / IF أو تخزينها في الايثانول 70٪ للتخزين. وميهت الخلايا المجففة للتخزين في 1X DPBS (DEPC المعالجة PBS) قبل أن يسافرا إلى سمكة / IF. يتم التعامل مع الخلايا أنا الدناز وتركت بين عشية وضحاها لهجن مع التحقيق. مرة واحدة تهجين كاملة، تغسل الخلايا مع formamide، وكذلك مع SSPE، وشطف النهائي 1X DPBS. ويطبق حظر حل للخلايا، تليها مع حضانةالأجسام المضادة الأولية. بعد الغسيل، يتم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية. اثنان يغسل النهائي في 1X DPBS استكمال إجراءات تلطيخ حيث على coverslips يتم تجفيفها والتي شنت على الشرائح للتصوير.

الشكل 2. نتائج ممثل استخدام الأسماك / إذا شارك في التحليلات. A) HIV-1 وtransfected إلى خلايا هيلا، وفي بعض الحالات مع البنى التي تسبب overexpression من البروتينات الخلوية (RILP، p50/Dynamitin وRILPΔN (1 الحذف الأميني محطة متحولة)) . تم تنفيذ FISH / إذا شارك في تحليل: تم تحديد الحمض النووي الريبي في أخضر مع أي G3BP أو LAMP1 (الحمراء) للتمييز. ب) يتم التعبير عن HIV-1 في الحله والتي تم جمعها في نقطة زمنية مختلفة. يتم تعقب الفيروسي RNA التعبير باللون الأخضر بينما اتسخت لبروتين خلوي، hnRNP A1، في الحمراء. الحانات هي حجم 10 ميكرومتر. صور معدلة من المراجع ¹ (أرقام تحديد من الفريق؛ RILP، p50/Dynamitin، وdeltaN RILP)و ¹⁷ (لوحة B).

Discussion

FISH / إذا شارك في تحليل هو طريقة يمكن الاعتماد عليها لتصور RNA فيروسي في الخلايا التي تم الآن صقلها ^9،15،16. على مدى عدة سنوات، قمنا بتطوير أسلوب راق في تلطيخ عن الحمض النووي الريبي. ويمكن استخدام هذه التقنية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا المقدمة وهذا التحقيق هو محدد لهدف الجيش الملكي النيبالي ^17. وذلك عبر تسمية لجنة التحقيق مع مجموعة دبي للاستثمار، ونحن قادرون على تصور بواسطة الحمض النووي الريبي تلطيخ بسيط. عندما يتم الجمع بين تلطيخ عن الحمض النووي الريبي والبروتينات الأخرى، FISH / إذا شارك في تحليل تصبح أداة قوية لمراقبة الهياكل الخلوية وتوطين بروتين / الحمض النووي الريبي.

خصوصية الكشف عن الحمض النووي الريبي عالية جدا. ويتضح هذا في الشكل 2. في بعض الأعمال الأصلية التي تركز على الفيروس الجيني RNA الترجمة، والأسماك المنشأة أن عدم وجود رؤيا المحاصرين RNA الفيروسي في نواة ^18. منذ هذا، وقد تم الحصول على معلومات جديدة وفيرة في الجينوم الفيروسي RNA الترجمة باستخدام الاسلوبورد ه هنا. بواسطة البروتينات الخلوية overexpressing، يمكن أن تضطر السكان ومحددة ليس كل من الحمض النووي الريبي الفيروسي في توطين إلى مناطق مختلفة من الخلية. حصلت RILP overexpression، الذي يشبه النمط الظاهري عندما يتم استنفاد hnRNP A2 بواسطة سيرنا في HIV-1-معربا عن الخلايا ^13، يؤدي إلى تراكم الحمض النووي الريبي واضح في MTOC. ويمكن دفع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي على هامش الخلية عن طريق تعطيل بروتين المحركات ناقص النهائيين، داينين: overexpression p50/Dynamitin أو ضربة قاضية لالثقيلة النتائج داينين ^​​1 سلسلة في الإفراج عن الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي من المجالات بين الخلايا لهامش الخلوية ( الشكل 2). متحولة من RILP، RILPΔN، التي لم تعد تربط محرك داينين، يشتت الإندوسومات (الموسومة بواسطة LAMP1) إلى السيتوبلازم لأنها لم تعد بنشاط ممركزة في المجالات juxtanuclear. هذه النتائج تشير الى فكرة وجود سكان من البلاستيك HIV-1 الحمض النووي الريبي الجينومية وعلى وجه الخصوص، أن مختلف برك من الجينومية-1 فيروس نقص المناعة البشريةالجيش الملكي النيبالي موجودة مع أدوار محددة في بعض الأحيان في دورة تكاثر الفيروس. وقد تم بالفعل هذه الأفكار نفسها التي حددت لهذا البروتين المشفرة بواسطة مرنا، الكمامة ^19.

هناك قيود على استخدامات FISH / إذا شارك في التحليلات التي ترتبط خيار الأجسام المضادة ومدى توافرها. والاستفادة المثلى من أفضل مزيج من الاجسام المضادة الابتدائية والثانوية، وتركيزاتها، يستغرق وقتا طويلا لتحسين (أنظر الجدول رقم 1 و 2). يمكن أن الأجسام المضادة التي من hybridomas أو التي تنتجها الشركات الكبرى لديها تركيزات التي تختلف في أي مكان من 01:02 إلى 1:2000، ولكن يجب التأكد من اتباع الإرشادات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للحصول على أفضل النتائج. ويجب أيضا المضيف الذي يتم انتاجه في الجسم المضاد يؤخذ قيد النظر. وينبغي أيضا الأغنام الاختلاط مع الأجسام المضادة الماعز يمكن تجنبها في الأجسام المضادة الأولية والثانوية مثل هذه النتائج في مجموعة خلفية عالية نظرا لعبور الأنواع اعتراف (لا تظهر البيانات). لاليكسا، فلور secondaالأجسام المضادة راي، يمكن استخدام تركيز على الأجسام المضادة لل1:500 أي تقريبا في المجموعة. والعيب الآخر لصيد السمك / إذا شارك في التحليلات على النحو المبين في هذا التقرير هو أنه يلتقط الجيش الملكي النيبالي في موقعه في الدولة، ثابت، بعد أن يتم إصلاح الخلايا وpermeabilized باستخدام امتصاص العرق والمنظفات (الشكل 1).

ومع ذلك، فقد تم تحقيق RNA التصوير في الخلايا الحية من خلال مجموعة متنوعة من الوسائل ^20-22، معظمها باستخدام أشكال مختلفة من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي الذي يتم تمييزها من البروتينات الفلورية مثل GFP. ومع ذلك، وسائل إضافية لتحديد الحمض النووي الريبي التوطين في الخلايا الحية لا تزال تطفو على السطح. هذه الطرق الجديدة تنطوي على الحمض النووي الريبي عن طريق وضع علامات السبانخ ^23، SNAP ^24، أو MTRIP ^2. هذه التقنيات أيضا يعانون من عدد قليل من العيوب بما في ذلك شرط لpermeabilize الخلايا قبل ان يضيف ركائز أو على وجوب هندسيا شاردة لوضع علامة على مرنا من أجل الكشف عن مرنا بواسطة المجهر. في الواقع، وأدفا الرئيسيةntage التحليلات الأسماك الواردة في هذا التقرير تكمن في حقيقة أن الحمض النووي الريبي الأم هي دون تغيير مما يؤدي إلى نتائج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
18mm coverslips	VWR	48380 046
16٪ لامتصاص العرق	JT بيكر	S898-07	لجعل 4٪: ذوب 20G في 1XDPBS 500mL على 60 درجة مئوية مع هيدروكسيد الصوديوم قطرات 5. درجة الحموضة إلى 7.2 قبالة الحرارة وتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. لا تتجاوز 70 درجة مئوية!
تريتون-X	OmniPur	9400
الدقيقة استخراج جل أزل كيت	روش	D6294-02
DIG RNA وسمها ميكس	روش	11277073910
البوليميراز النسخ T7 RNA	إينفيتروجن	18033-019
أعمدة الدوران السريع	روش	11814427001
أنا الدناز	إينفيتروجن	18047-019
DPBS 1X	Gibco	14190-250
Formamide	EMD	FX0420-8
الحمض الريبي النووي النقال	إينفيتروجن	15401-021
ريبونوكلياز OUT	إينفيتروجن	10777-019
تعيين فلوري محسن الجسم المضاد للكشف DIG # 4 (حل الحجب)	روش	1768506
اليكسا فلور الأجسام المضادة الثانوية	إينفيتروجن	انظر الجدول رقم 2
تهجين فرن	Boekel الخيال العلميentific	نموذج 24100
Microslides	VWR	48300-047
Immunomount	Thermoscientific	9990402

الأنواع المضادة للأجسام المضادة DIG (تخفيف؛ عدد كتالوج الشركة،)	الألوان	اليكسا فلور استخداما (1:500)
الماوس (1:500، سيغما، B7405)	أخضر	اليكسا فلور 488 حمار لمكافحة فأر (إينفيتروجن، A21202)
	أحمر	اليكسا فلور 594 حمار لمكافحة فأر (إينفيتروجن، A21203)
	أزرق	اليكسا فلور 647 حمار لمكافحة فأر (إينفيتروجن، A31571)
خروف (1:200، روش، 11376623)	أخضر	اليكسا فلور 488 حمار المضادة للغنم (إينفيتروجن، A11015)
	أحمر	اليكسا فلور 594 حمار المضادة للغنم (إينفيتروجن، A11016)
	أزرق	اليكسا فلور 647 حمار المضادة للغنم (إينفيتروجن، A21448)