عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Summary

توضح هذه المقالة لأول مرة إجراء لعزل الخلايا البطانية الإنسان من عروق السري ثم يوضح كيفية استخدام هذه الخلايا لدراسة هجرة العدلات في ظل ظروف التدفق. باستخدام غرفة تدفق كميات قليلة مصنوعة من البوليمر مع الخصائص البصرية للزجاج، ويعيش خلية التصوير فلوري للسكان الخلية نادر ممكن أيضا.

Abstract

العدلات هي النوع الأكثر وفرة من خلايا الدم البيضاء. وهم يشكلون جزءا أساسيا من نظام المناعة الفطرية ^1. أثناء التهاب حاد، العدلات هي خلايا التهابية 1 إلى الهجرة إلى موقع الإصابة. تجنيد العدلات إلى موقع الإصابة عملية متدرجة تشمل الأولى، تمدد الأوعية الدموية لزيادة تدفق الدم، وثانيا، تغييرات هيكلية الاوعية الدموية الدقيقة والهروب من بروتينات البلازما من الدم؛، المتداول 3 التصاق، والتهجير من العدلات في جميع أنحاء البطانة، ورابعا تراكم من العدلات في موقع الإصابة ^2،3. وقد تطورت وهناك مجموعة واسعة من في والمجراة في المختبر طرق لتمكين دراسة هذه العمليات ^4. هذه الطريقة تركز على هجرة العدلات عبر الخلايا البطانية الإنسان.

أسلوب واحد شعبية لدراسة العمليات الجزيئية تشارك في التهجير العدلة يستخدم ن الإنسانeutrophils التفاعل مع الخلايا البشرية الأساسية بطانة الوريد السري (HUVEC) ^5. وقد وصفت العدلة العزلة بصريا في مكان آخر ^6؛ وبالتالي هذه المادة سوف تظهر طريقة لعزل HUVEC. عزل مرة واحدة ونمت لالتقاء، يتم تنشيط الخلايا البطانية مما أدى إلى upregulation من جزيئات الالتصاق والتنشيط. على سبيل المثال، تنشيط الخلايا البطانية مع السيتوكينات مثل TNF-α النتائج في زيادة selectin-E و IL-8 التعبير ^7. E-selectin يتوسط التقاط والمتداول من العدلات و IL-8 تفعيل يتوسط والتصاق شركة من العدلات. بعد العدلات التصاق transmigrate. يمكن أن يحدث التهجير paracellularly (من خلال تقاطعات الخلية البطانية) أو transcellularly (من خلال الخلية البطانية نفسها). في معظم الحالات، وهذه التفاعلات تحدث في ظل الظروف الموجودة في تدفق ^7،8 الأوعية الدموية.

تدفق مواز لوحة الغرفة هو نظام يستخدم على نطاق واسع أن ميلميكروفونات الضغوط العثور على القص الهيدروديناميكية في الجسم الحي، وتمكن هذه الدراسة من تجنيد العدلات تحت حالة تدفق ^9،10 في المختبر. العديد من الشركات تنتج مواز غرف تدفق لوحة ولكل منها مزاياه وعيوبه. اذا كانت هناك حاجة فلوري والتصوير، والزجاج أو البوليمر مماثلة بصريا يحتاج إلى استخدامها. الخلايا البطانية لا تنمو بصورة جيدة على الزجاج.

هنا نقدم وسيلة سهلة وسريعة لتصوير التخلص النقيض من ذلك، ومدينة دبي للإنترنت فلوري من هجرة العدلات منخفض باستخدام قناة ibidi حجم الشريحة مصنوعة من البوليمر الذي يدعم التصاق السريع ونمو الخلايا البطانية الإنسان والصفات البصرية التي يمكن مقارنتها مع الزجاج. في هذه الطريقة، ونمت الخلايا البطانية وحفزت في μslide ibidi. وأدخلت في ظل ظروف تدفق العدلات وجرى تقييم التهجير. تمكين التصوير فلوري من تقاطعات في الوقت الحقيقي وتحديد مدى paracellular مقابلالعابر للهجرة.

Protocol

1. العزلة وصيانة خلايا الإنسان بطانة الأوعية الدموية

1. يجب أن تستخدم المستوى 2 إجراءات السلامة البيولوجية عند العمل مع الدم والأنسجة البشرية. قطع مقص باستخدام حبل من المشيمة ومن ثم النظر عن كثب في الحبل السري لتجلط الدم والأضرار الناجمة عن لقط الحبل أثناء الولادة. قطع وتجاهل هذه الأجزاء من الحبل السري.
2. إعداد الطازجة حل كولاجيناز في 1 ملغ / مل بصب 50 مل من عازلة الحبل الدافئ في أنبوب يحتوي على 50 ملغ كولاجيناز.
3. تغيير في قفازات معقمة وفتح علبة تحتوي على صك مشبع cannulas حادة معقمة، والمشابك الحبل، ومقص، وثلاثة في اتجاه ووقف الديوك والشاش في رقائقي تدفق غطاء محرك السيارة.
4. التعرف على الشرايين اثنين والحاضر وريد واحد في السلك. الشرايين هي أصغر حجما وتميل الى ان تكون مقيدة بإحكام، في حين أن وريد كبير وسهل على يقني؛ يدخل القنية. تدفق الدم من الوريد، تضاف بلطف قنية مع محبس اتجاهين مرفقة به أناn لنهاية واحدة من الوريد ومكان المشبك حول قنية لأنه عقد بحزم في موقف. يروي العازلة سلك عن طريق الوريد. كرر حتى من خلال تدفق غير واضح ومن ثم المشبك في نهاية الحبل.
5. كولاجيناز يروي في الوريد، إغلاق محبس، ووضع الحبل في كوب دافئ العازلة التي تحتوي على النخاع واحتضانها لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقيقة، وإزالة الحبل السري وتدليك بلطف الحبل على تخفيف الخلايا البطانية من التجويف من الوريد. استنزاف المحلول في أنبوب يحتوي على وسائل الاعلام الخلية البطانية (ECM). مطاردة مع عازلة الحبل مرتين لإزالة الخلايا المتبقية. استنزاف الحل في الأنبوب نفسه.
6. منبذة الخلايا في 350 XG لمدة 10 دقيقة لتكوير الخلايا البطانية.
7. إزالة طاف وإضافة 10 مل من ECM لبيليه. resuspend بلطف الخلايا في ECM، ثم نقل الخلايا إلى قارورة T75 قبل المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين. وقد تم ذلك قبل طلاء الجيلاتين مع ما لا يقل عن 1 ساعة على 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا على 37 درجة مئوية و 5ثاني أكسيد الكربون بنسبة _2٪.
8. في اليوم التالي، هز بلطف القارورة لطرد أي خلايا الدم الحمراء إزالة ثم طاف وتغسل بمحلول هانك دافئ وملح متوازن (HBSS). إزالة HBSS وتغذية الخلايا مع 10 مل من ECM دافئ. فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن تمت إزالة خلايا الدم الحمراء. تقييم درجة التقاء والصرف من الخلايا البطانية. وينبغي أن ممدود الخلايا البطانية في هذه المرحلة مع أي علامة على فجوات.
9. الاستمرار في تغيير وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام حتى تصل إلى خلايا confluency، ثم انقسام الخلايا باستخدام محلول 0.08٪ من التربسين التي تحتوي على 1MM EDTA. لوحة الخلايا البطانية في أطباق المطلوب مسبقا المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين. وينبغي أن تصل إلى نقطة التقاء الخلايا في 3-6 أيام.
10. عند استخدام ibidi الغرف، قبل معطف كل غرفة مع 0.2٪ الجيلاتين. إزالة الزائدة الجيلاتين وفبرونيكتين ثم إضافة 1.5 X 10 ⁶ / مل من الخلايا البطانية علقت في ECM الى غرفة. تغيير وسائل الاعلام كل يوم آخر حتى جonfluent. وينبغي أن تكون خلايا متكدسة في 2-3 أيام اعتمادا على الحبل.

2. إعداد العدلات

1. تم عزل العدلات من الدم المحيطي من متطوعين من البشر الأصحاء باستخدام الطرد المركزي كثافة. ويمكن الاطلاع على بروتوكول مفصل مع مظاهرة البصرية للعزلة العدلة في هذه القضية في وقت سابق من هذه المجلة ^6. المعزولة مرة واحدة، العدلات resuspend بتركيز 1x10 مل / ⁶ في HBSS تحتوي على الزلال البشري بنسبة 0.5٪.

3. إنشاء غرفة Ibidi

1. زراعة خلايا بطانية في غرفة ibidi الجيلاتين المغلفة. فحص لهم كل يوم باستخدام المجهر النقيض من المرحلة حتى تصبح متجمعة بشكل محكم.
2. تحفيز الخلايا البطانية لزيادة التعبير عن جزيئات الالتصاق والتنشيط. لأغراض هذا البروتوكول، وحفز الخلايا البطانية مع 10 نانوغرام / مل من المؤتلف TNF-α لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ _{2 قبل إعداد غرفة ibidi للتصوير في ظروف تدفق.}
3. تحضير المجهر، ومضخة محقنة كما هو موضح من قبل بصريا فيسه وزملاؤه ¹¹ باستخدام غرفة ibidi فارغ.
4. الخلافات الرئيسية بين هذا البروتوكول وإجراء فيسه وتشمل ما قبل ملء أنبوب لمنع التعرض للخلايا بطانية للهواء، والحفاظ على المنطقة العازلة عند 37 درجة مئوية باستخدام حمام ماء، وذلك باستخدام أنبوب PharMed للحفاظ على المنطقة العازلة من فقدان الحرارة، واستخدام مختلف أهداف على المجهر اعتمادا على ما إذا التصوير مع النقيض من مرحلة أو مضان.
5. مرة واحدة تم تعيين مجهر صعودا ويتم ملء الأنبوب مع HBSS، على مقربة من جميع الصمامات وإزالة غرفة ibidi فارغ.
6. ربط الغرفة التي تحتوي على ibidi TNF-α حفز الخلايا البطانية للأنابيب.

4. العدلة التوظيف والتهجير

1. تصور أحادي الطبقة الخلية البطانية في microscمكتب مستشار رئيس الوزراء باستخدام النقيض من مرحلة 10X الهدف.
2. تعيين مضخة محقنة لسحب ويبدأ تدفق HBSS في إجهاد القص المطلوب (عادة ما بين 0.5 إلى 2 سم / DYN ^2).
3. على الجانب مدخل، والتحول من HBSS إلى العدلات المعزولة (1x10 ⁶ / مل) من خلال تحويل الطريق لمدة ثلاثة وقف الديك.
4. بدء التسجيل باستخدام كاميرا CCD متصلة إما إلى مسجل DVD أو متصلة مباشرة إلى الكمبيوتر. بدء موقت عندما العدلات أدخل غرفة. يروي العدلات لمدة اربع دقائق. ما مجموعه 3 مل من تعليق العدلة كافية لتجربة واحدة.
5. بعد أربع دقائق، يعود مرة أخرى الى HBSS لمنع الحجز على العدلات جديد. إذا ما المطلوب بيانات عن التفاعلات الكلية، المتداول والتصاق شركة، صورة 6 حقول عشوائية لمدة 10 ثانية كل باستخدام النقيض مرحلة 10X الهدف بين 4 و 5 دقائق.
6. التحول إلى هدف وتسجيل 40X حقل واحد من عرض ما بين 5 و 10 دقائق. في 10 دقيقة، وجمعبين 5 و 10 حقول عشوائية من الرأي.
7. وقف تدفق والانتقال إلى الغرفة التالية.

5. فلوري التصوير تحت ظروف تدفق باستخدام غرفة Ibidi

1. الخلايا البطانية التسمية أو العدلات مع التحقيق الذي تجريه فلوري من الفائدة. على سبيل المثال، يمكن استخدام الأجسام المضادة لمكافحة VE-كادهيرين مترافق إلى ترتيب، [547] لتصور تقاطعات الخلية البطانية.
2. التجمع ibidi غرفة في المجهر مع تباين تدخل الفرق (DIC) وقدرات فلوري. نستخدم 1000 FluoView مبائر (أوليمبوس) مع غرفة البيئية. تركز باستخدام هدفا مصممة للعمل في مدينة دبي للإنترنت وفلوري.
3. الحصول على الصور في وقت واحد، ومدينة دبي للإنترنت فلوري باستخدام البرمجيات التي توفرها بائع بينما بعد الدورة مرة وصفها في الفقرة 4.

6. تحليل التوظيف العدلات

1. وصفت تحليل المتداول والتفاعل من قبل خلايا فيسه وآخرون ^11.
2. لقياس نسبة العدلات المتداول على أحادي الطبقة البطانية تحصي أعداد العدلات التي انتقلت أكثر من قطر خلية في الفترة من 5 ثوان. تقسيم هذا العدد من اجمالي عدد الكريات البيض في هذا المجال لتحديد نسبة الخلايا المتداول. وبالتالي، تعتبر الخلايا المتبقية تمسكا راسخا.
3. قياس سرعة المتداول من العدلة عن طريق حساب المسافة العدلة سافر في فترة زمنية معينة ومن ثم تقسيمه في ذلك الوقت في ثوان.
4. يتم تحديد التهجير من قبل حساب عدد العدلات التي غيرت شكل وهاجروا تحت أحادي الطبقة ^10. ويتم تحديد هذه العدلات من حقيقة ان يغيروا من كونها مرحلة مشرقة عندما على رأس أحادي الطبقة إلى مرحلة مظلما عندما تحت أحادي الطبقة ^10. ويمكن التعبير عن عدد الخلايا transmigrated كنسبة مئوية من مجموع الخلايا في مجال الرؤية أو على شكل خدر الخامإيه من الخلايا transmigrated في وحدة المساحة. في هذا النظام النموذجي، وعادة 50٪ من العدلات transmigrate بعد 10 دقائق.

7. ممثل النتائج

الخلايا البطانية Unstimulated لا تدعم تجنيد العدلات. في المقابل، وتنشيط الخلايا البطانية مع TNF-α النتائج في المتداول العدلة، التصاق وطيد والتهجير. ويرد مثال على هذه البيانات في الشكلين 1 و 2. الشكل 1A يظهر العدلات التفاعل مع TNF-α-حفز الخلايا البطانية. يمكن قياس هذه التفاعلات، وكشف عن عدد من العدلات التفاعل مع الخلايا البطانية، فضلا عن عدد من العدلات المتداول، وتمسكا راسخا أو transmigrated (الشكل 2). يمكن للهجرة العدلات تحدث في التقاطعات الخلية أو عن طريق الخلايا البطانية أنفسهم. للتمييز بين هذين الشرطين، وصفت الخلايا البطانية مع مضاد-C-VE وسجل adherin الأجسام المضادة والتهجير كما يحدث paracellularly أو transcellularly (الشكل 1B و C). في هذا النموذج، وتقريبا جميع التهجير هو paracellular ^7.

الشكل 1. مدينة دبي للإنترنت في وقت واحد والتصوير مضان تحت ظروف تدفق باستخدام غرفة ibidi. (أ) صورة مدينة دبي للإنترنت معزولة حديثا العدلات البشرية المهاجرة عبر خلايا بطانة الوريد السري. رأس السهم الأصفر يظهر تمسكا العدلة، ورأس السهم الأبيض يظهر العدلة transmigrating. (ب) وملطخة تقاطعات الخلايا البطانية مع الأجسام المضادة لمكافحة VE-كادهيرين مترافق إلى ترتيب، [547] والمصورة. (ج) يظهر تراكب من قناة A و B كشف أن جميع transmigrating في هذا النموذج هو paracellular. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

_content ">
الشكل 2. تركت unstimulated الخلايا البطانية أو وحفز مع 10 نانوغرام / مل من TNF-α. بعد 4 ساعات، وتدفق لوحة موازية غرفة تجميعها وكانت perfused العدلات عبر DYN في 1 / سم ^2. (أ) تم فحص التفاعلات العدلات وتقاس باستخدام يماغيج البرنامج من المعاهد الوطنية للصحة. وتميزت هذه الخلايا المتفاعلة مجموعها (B) المتداول، تمسكا راسخا أو transmigrating (C). البيانات تمثل الوسط ووزارة شؤون المرأة + من بين 3 و 5 من التجارب. وكان الفرق بين الرقابة وTNF في لوحات وجيم معنوية (P <0.001).

Discussion

وقد استخدم الباحثون بصورة روتينية الخلايا البطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة لدراسة تجنيد العدلات والتهجير. ومن الأمثلة على ذلك، ولكنها لا تقتصر على، وخلايا الجلد بطانة الاوعية الدموية الدقيقة ^12، الكبد الخلايا البطانية الجيبية ¹³ و الخلايا ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
كاشف والمعدات	شركة	فهرس العدد	تعليقات
كولاجيناز نوع 1	ورثينجتون	4197
حبل العازلة			التركيب: 140 مم كلوريد الصوديوم 4 مم بوكل 10 ملي مد الجلوكوز في ناه 2 PO 4 / نا 2 1MM العازلة 4 هبو في درجة الحموضة 7.4
وسائل الإعلام الخلية البطانية (ECM)			M199 مع أملاح نسر تستكمل مع مصل الدم البشري 16٪ تحتوي على 100 وحدة من البنسلين 100 ميكروغرام من الستربتومايسين و 0.3 ملغ من L-glutamine/ml
M199	GIBCO	31100-035
البنسلين جلتاميت الستربتوميسين (100X)	إينفيتروجن	10378-016
Ibidi الغرف	Ibidi	80606
TNF-α	Prepro التقنية	300-01A
الإنسان الزلال حل 20٪	المنتجات الاحيائية الجوزاء	800120050
HBSS دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم	سيغما	H2487-10X
HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +	سيغما	H1387-10X