وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

Summary

الطفرات بيسلفيت هو معيار الذهب لتحليل الحامض النووي. لدينا بروتوكول تعديل يسمح لتحليل الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية والتي صممت خصيصا لالبويضات الفردية. ويمكن أيضا استخدامه لانشقاق في مرحلة الأجنة.

Abstract

علم التخلق يتفرد بها كل الموروثة وتعديلات عكسها على لونين من شأنها أن تغير الجينات إمكانية الوصول، وبالتالي هي الآليات الأساسية لتنظيم النسخ الجيني ^1. الحامض النووي هو تعديل اللاجينية التي تعمل في الغالب على أنه علامة القمعية. من خلال إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل على cytosines في dinucleotides الدليل السياسي الشامل، فإنه يمكن توظيف البروتينات القمعية إضافية وتعديلات بسيطة لبدء العمليات التي ينطوي عليها التكثيف لونين وإسكات الجينات ^2. الحامض النووي أمر ضروري للتطور الطبيعي لأنه يلعب دورا حاسما في البرمجة التنموية، تمايز الخلايا، وقمع العناصر فيروسات، تعطيل كروموسوم X-والبصمة الجينية.

واحدة من أكثر الوسائل قوية لتحليل الحامض النووي هو الطفرات بيسلفيت. بيسلفيت الصوديوم هو المغير الحمض النووي التي deaminates cytosines إلى uracils. بعد التضخيم PCR وseque ncing، تم الكشف عن هذه الأحداث تحويل كما thymines. محمية cytosines ميثليته من نزع الأمين وهكذا تظل كما cytosines، مما يتيح تحديد الحامض النووي على مستوى فردي النوكليوتيدات ^3. وقد تقدمت تطوير بيسلفيت فحص الطفرات من تلك التي ذكرت في الأصل ^4-6 نحو تلك التي هي أكثر حساسية وقابلية للتكرار ^7. وكان واحد تقدم مفتاح تضمين كميات صغيرة من الحمض النووي في حبة الاغاروز، ومن ثم حماية الحمض النووي من معاملة قاسية بيسلفيت ^8. إلى أن يتم تنفيذ هذا التحليل مثيلة تمكين على برك من البويضات والأجنة في مرحلة الكيسة ^9. والطفرات بيسلفيت الأكثر تطورا حتى الآن هو بروتوكول للأجنة في مرحلة الكيسة فرد ^10. ومع ذلك، منذ blastocysts يكون على الخلايا متوسط ​​64 (التي تحتوي على 120-720 خريج من الحمض النووي الجيني)، وهذا الأسلوب غير فعال للدراسات مثيلة في البويضات أو الأجنة الفردية الانقسام المرحلة. خيمة "> أخذ القرائن من تضمين الاغاروز كميات الحمض النووي بما في ذلك البويضات الدقيقة ^11، هنا نقدم وسيلة يتم من خلالها مباشرة جزءا لا يتجزأ من البويضات في الاغاروز وتحلل حبة حل استرجاع التالية فورا وإزالة الشفافة زونا من البويضة، وهذا يتيح لنا تجاوز التحديات الرئيسيان من بويضة واحدة الطفرات بيسلفيت: حماية كمية ضئيلة من الحمض النووي من تدهور، وفقدان لاحق خلال خطوات عديدة بروتوكول الأهم من ذلك، كما يتم الحصول على البيانات من البويضات واحد، هو القضاء مسألة التحيز PCR داخل حمامات وعلاوة على ذلك. ، غير مقصود تلوث الخلية الركامية قابلا للاكتشاف من قبل هذه الطريقة منذ يجوز استبعاد أي عينة مع نمط مثلأيشن واحد أو أكثر من تحليل ^12. هذا البروتوكول يوفر طريقة أفضل للتحليل ناجحة وقابلة للتكرار من الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية، ويعتبر مثاليا لالبويضات الفردية، وكذلك الأجنة في مرحلة الانقسام.

Protocol

يوم 1

إعداد الحلول التالية العذبة في اليوم من جمع البويضة مع الماء، وعقيمة مثل الماء المقطر GIBCO. لتقليل فرصة التلوث الحمض النووي، وتغيير في كثير من الأحيان واستخدام قفازات نصائح مرشح. إبقاء الأنابيب الزاوية بعيدا عندما فتحها، وخلاصة كل أنابيب عندما لا تكون قيد الاستعمال. من المستحسن أن تتم الحلول كما ن +1.

3٪ LMP الاغاروز

30 ملغ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز
يصل إلى 1 مل GIBCO O ₂ H
حل @ 70 درجة مئوية

تحلل الحل

8 عازلة تحلل ميكرولتر
1 ميكروليتر بروتيناز K
1 ميكروليتر IGEPAL 10٪
مكان على الجليد حتى جاهزة للاستخدام

02:01 الاغاروز: تحلل الحل (10 ميكرولتر لكل بويضة الفردية، والمبلغ هو لمدة 3 البويضات)

20 ميكرولتر 3٪ LMP الاغاروز
10 الحل تحلل ميكرولتر
مزيج @ 70 درجة مئوية

SDS لايالهيئة العامة للاستعلامات العازلة (501 ميكرو لتر لكل بويضة الفردية)

1X الشركة المصرية للاتصالات 7.5 درجة الحموضة	450 ميكرولتر
10٪ SDS	50 ميكرولتر
بروتين K	1 ميكروليتر
	501 ميكرولتر

1. مجموعة سيت

1. ضع الماوس oviducts تشريح في وسائل الاعلام M2، وتمزيق الأمبولات لاستخراج مجمع الخلية الركامية.
2. فصل البويضات من الركام مجمع الخلية باستخدام 0.3 ملغم / لتر في حل هيالورونيداز قطرة ميكرولتر 30 من وسائل الاعلام M2. إبقاء البويضات في الحل الوحيد طالما أنه يأخذ لإزالة الخلايا الركامية، والتعرض طويل قد يضر بهم. غسل البويضات 3X في 30 قطرة ميكرولتر من وسائل الاعلام M2، وإزالة الركام الخلايا دوريا.
3. إزالة الشفافة زونا باستخدام محلول حمضي tyrode ل. وضع البويضات في الانخفاض 30 1 ميكرولتر من الحل الأول، ومن ثم نقل إلى 30 آخرينانخفاض ميكرولتر، كما أن أي وسائل الاعلام قامت على طول تمييع حامض والحد من فعاليتها. إبقاء البويضات في الحل الوحيد طالما أنه يأخذ لإزالة زونا، كما تعرض طويلة قد تضر بهم. ملاحظة: يمكن استخدام زيادة تركيز المحاليل الحمضية tyrode أو pronase للعينات البشرية، حيث أن الإنسان المنطقة الشفافة هي أكثر مقاومة للعلاج مع المحاليل الحمضية tyrode لمن الماوس.
4. غسل البويضات مرة أخرى في قطرة وميكرولتر 30 من وسائل الاعلام M2.

2. الاغاروز التضمين وتحلل

1. لأداء الاغاروز التضمين، ووضع حل تحلل على heatblock 70 درجة مئوية. إضافة مسخن LMP الاغاروز إلى حل تحلل، مما ينتج عنه الاغاروز 02:01: حل تحلل.
2. وضع بويضة واحدة على شريحة زجاجية نظيفة في وسائل الاعلام M2 الحد الأدنى. يستغرق 10 ميكرولتر من الاغاروز: حل تحلل في قمة ماصة، و (تحت المجهر) طرد بلطف كمية صغيرة (~ 1 ميكروليتر أو أقل) على شريحة زجاجية، والسماح لها بالاختلاط قطرةآل وسائل الاعلام. اختيار برفق البويضة في قمة ماصة ووضع كل ميكرولتر 10 في أنبوب إيبندورف مع 300 ميكرولتر الزيوت المعدنية لذلك حبة يشكل المجال.
   ملاحظة: يجب أن تتم هذه العملية بسرعة كبيرة كما الاغاروز سوف تتصلب إذا تنخفض درجة الحرارة اقل من 5 درجات مئوية أقل من 70 درجة مئوية.
3. احتضان أنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. لأداء تحلل، وإزالة الزيوت المعدنية 300 ميكروليتر وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحلل SDS. احتضان بين عشية وضحاها في حمام ماء C ° 50.
   ملاحظة: يمكن أيضا حل تحلل (الجدول 1) يمكن استخدامها لهذا الغرض.

يوم 2

إعداد الحلول التالية العذبة في اليوم من الطفرات بيسلفيت. للحد من فرص انتشار التلوث الحمض النووي، وتغيير في كثير من الأحيان واستخدام قفازات نصائح مرشح. إبقاء الأنابيب الزاوية بعيدا عندما فتحها، وخلاصة كل أنابيب عندما لا تكون قيد الاستعمال. من المستحسن أن تتم الحلول كما ن +1.

3 M هيدروكسيد الصوديوم	2،4 غرام هيدروكسيد الصوديوم في 20 مل مشبع O 2 DDH
0.1 M هيدروكسيد الصوديوم	0.5 مل من 3M في 14.5 مل مشبع O 2 DDH
0.3 متر هيدروكسيد الصوديوم	1.5 مل من 3M في 13.5 مل مشبع O 2 DDH

2.5 الحل M بيسلفيت

1. ز 3،8 بيسلفيت الصوديوم
   5.5 مل GIBCO المقطر H ₂ O
   1 مل 3 M هيدروكسيد الصوديوم
   حل @ درجة حرارة الغرفة
2. 110 ملغ هيدروكينون
   1 مل GIBCO المقطر H ₂ O
   حل @ 90 درجة مئوية (من أجل فقط طالما أنه يأخذ إلى حل، خلط بانتظام)

عندما يذوب تماما، خلط محلول (أ) و (ب)
* يحفظ بعيدا عن ضوء *

3. بيسلفيت التطفير

1. إزالة بالكامل 500 تحلل SDS ميكرولتر عازلة وإضافة الزيوت المعدنية 300 ميكروليتر (~ 20 ساعة). فإن أي العازلة تحلل ما تبقى تمييع عشره الاغاروز عندما يتم تسخينها وحبة سوف تكون أكثر عرضة للتذويب في الخطوات اللاحقة. المضي قدما في الطفرات بيسلفيت فورا، أو متجر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام.
2. إن وجدت، وإزالة البويضات من الثلاجة، والسماح ذوبان (فقط حتى الاغاروز حبة غير شفافة نسبيا). احتضان لمدة 2.5 دقيقة على كتلة حرارة 90 درجة مئوية، وبعد ذلك احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: لا تخلط أو إثارة، وتمديد فترة أطول من 2.5 دقيقة، أو تقلب درجات الحرارة.
3. لأداء تمسخ، وإزالة الزيوت المعدنية وإضافة 1 مل 0.1M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل نفض الغبار، وأنبوب عكس 5-6 مرات.
4. احتضان لمدة 15 دقيقة في بالحمام المائي 37 درجة مئوية، قلب كل 3-4 دقائق. يجب أن حبة تعوم في هيدروكسيد الصوديوم.
5. لإجراء معاملة بيسلفيت، وتدور في أنبوب بلطف، ثم إزالة هيدروكسيد الصوديوم وإضافة الزيوت المعدنية 300 و 500 ميكروليتر حل بيسلفيت ميكرولتر. احتضان الأنبوب لمدة 3.5 ساعة في بالحمام المائي 50 درجة مئوية. * يحفظ بعيدا عن ضوء *
   ملاحظة: مدة حضانة المرض قد تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لجينة من الفائدة.
6. لأداء desulfonation، احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق، ثم إزالة الزيوت المعدنية والحل بيسلفيت، وتدور بلطف، وإضافة 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم 0.3 متر. نفض الغبار وعكس 5-6 مرات.
7. احتضان لمدة 15 دقيقة في بالحمام المائي 37 درجة مئوية، قلب كل 3-4 دقائق. يجب أن حبة تعوم في هيدروكسيد الصوديوم.
8. غسل العينات، من قبل الغزل 1 بلطف، ثم إزالة هيدروكسيد الصوديوم وإضافة 1 مل 1X الشركة المصرية للاتصالات 7.5 درجة الحموضة. هزة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (على شاكر). تدور بلطف مرة أخرى، ثم إزالة TE 1X. كرر هذه العملية مرتين غسيل.
9. إضافة 1 مل مشبع DDH ₂ O. هزة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (على شاكر). تدور بلطف، ثم إزالة ₂ H O. كرر DDH غسيل O ₂ مرتين.
10. التحقق من الرقم الهيدروجيني للطاف، وإنما يجب أن تكون 5.0 درجة الحموضة. إذا كانت لا تزال أساسية جدا، وغسل مرة أخرى مع H ₂ O. إزالة جميع طاف، ولم يتبق سوى أن تكون الاغاروزإعلان.

4. 1 ^ش و 2 ^{الثانية} تضخيم PCR جولة

1. إعداد 1 ^ش جولة PCR ** المزيج في حين غسل **

10 ميكرومتر الخارجي التمهيدي إلى الأمام	0،5 ميكروليتر
10 عكس التمهيدي ميكرومتر الخارجي	0،5 ميكروليتر
240 نانوغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال	1 ميكروليتر
H 2 O	13 ميكرولتر

إضافة إلى الجاهزة للحار الذهاب الخرز Illustra PCR البداية
الشريحة بعناية في صلب الاغاروز خرزة داخل الأنبوب PCR (~ 10 ميكرولتر)
الحرارة إلى 70 درجة مئوية ومزيج
إضافة 25 الزيوت المعدنية ميكرولتر
المجموع: 50 ميكرولتر

2. تضخيم
   ملاحظة: مثال من ظروف ركوب الدراجات لSnrpn الماوس تمسخ لمدة 2 دقيقة على 94 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 1 دقيقة في 50 درجة مئوية، و 1دقيقة عند 68 درجة مئوية، ونهائي 10 خطوة استطالة دقيقة عند 68 درجة مئوية. الصلب درجة الحرارة لمدة 1 PCR الجولة ^{الحادية وللماوس} H19 و Peg3 هو 50 درجة مئوية.
3. 2 تحضير الجولة ^{الثانية} PCR مزيج

10 ميكرومتر التمهيدي الداخلية إلى الأمام	0،5 ميكروليتر
10 عكس التمهيدي ميكرومتر الداخلية	0،5 ميكروليتر
H 2 O	19 ميكرولتر

إضافة إلى الجاهزة للحار الذهاب الخرز Illustra PCR البداية
إضافة 5 ميكرولتر جولة ^ST 1 المنتج كقالب. تسخين المنتج 1 ^ش جولة إلى 70 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لتليين الاغاروز. تأكد من ماصة تحت طبقة من الزيوت المعدنية.
إضافة 25 الزيوت المعدنية ميكرولتر
المجموع: 50 ميكرولتر

ملاحظة: يمكن العثور على تسلسل التمهيدي متداخل لSnrpn، H19، وPeg3 Velker في السوق وآخرون ^10،12.

4. تضخيم
   ملاحظة: شروط ركوب الدراجات لSnrpn الماوس تمسخ لمدة 2 دقيقة على 94 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 1 دقيقة في 50 درجة مئوية، و 1 في الدقيقة 68 درجة مئوية، واستطالة النهائي 10 دقائق خطوة عند 68 درجة مئوية ^10. فأر H19 و Peg3 تتطلب 50 درجة مئوية درجة الحرارة الصلب لمدة 2 PCR الجولة ^{الثانية.}
5. كاختبار تشخيصي، ويمكن قطع عينات من الدور الثاني مع انزيم تقييد هذا هو مثيلة أو سلالة معينة.

2 المنتج الثاني جولة	4 ميكرولتر
تقييد الإنزيم	1 ميكروليتر
العازلة	1 ميكروليتر
H 2 O	4 ميكرولتر

6. Electrophorese المنتجات الهضم على هلام الأكريلاميد 8٪. أي فرق غير متجانسة تمثل أكثر من واحد sequeالامتحانات التنافسية الوطنية.

5. TA الاستنساخ وPCR مستعمرة

1. لاستنساخ 2 المنتج ^الثاني جولة، أول حرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لتليين الاغاروز، ligate ثم إلى ناقلات باستخدام pGEM-T Promega ناقل النظام (فيشر العلمية كات # A1360).

2 الثانية جولة PCR	1 ميكروليتر
pGEMT-EASY ناقلات	1 ميكروليتر
يغاز	1 ميكروليتر
H 2 O	2 ميكروليتر
2X الربط الاحتياطي	5 ميكرولتر

احتضان بين عشية وضحاها @ 4 آلة PCR درجة مئوية في.

2. ذوبان الجليد المختصة الخلايا القولونية على الجليد لمدة 15 دقيقة (الإنزيم القطة شركة أبحاث # T3009). إضافة 3 رد فعل ربط ميكروليتر إلى 8 القولونية ميكرولتر واحتضان ربط على الجليد لمدة 15 دقيقة.
3. الصدمة الحرارية لمدة 40 ثانية في بالحمام المائي 42 درجة مئوية،واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 60 شركة نفط الجنوب ميكرولتر المتوسطة واحتضان على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (في شاكر).
4. وضع كل من مزيج رد فعل على صفيحة رطل / آجار / IPTG / Xgal / أمبير واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية خلال الليل.
5. تعد مستعمرة PCR مزيج

20 ميكرومتر التمهيدي أمام M13	0،7 ميكروليتر
20 ميكرومتر التمهيدي عكس M13	0،7 ميكروليتر
5X الأخضر الذهاب طق الواق	7،0 ميكروليتر
10 ملي dNTP	0،7 ميكروليتر
طق الحمض النووي بوليميريز	0.28 ميكروليتر
H 2 O	25.62 ميكرولتر
	35 المجموع ميكرولتر

إضافة 35 ميكرولتر مزيج مستعمرة سيد PCR في أنبوب PCR. اختيار مستعمرة البكتيرية أبيض من لوحة مع طرف ماصة، ودوامة عليه في رد فعل PCR.

6. تضخيم مع تمسخ لمدة 10 دقائق على 94 درجة مئوية، تليها 30 دورات من 45 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 ثانية عند 57 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 72 درجة مئوية، والخطوة النهائية استطالة 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. Electrophorese 4 ميكرولتر على هلام الاغاروز٪ 1.5. إرسال ~ 30 ميكرولتر من منتج PCR في التسلسل.
   ملاحظة: للحصول على البويضات، والتسلسل 5 مستعمرة منتجات PCR.
7. مرة واحدة يتم الحصول على نتائج التسلسل، يمكن قراءة أنماط مثيلة. وكان ميثليته أي CG الأصلية التي لا تزال بمثابة الفريق الاستشاري، وكان unmethylated أي CG الأصلي الذي هو الآن TG.

6. ممثل النتائج

في عملنا، مطبوع نحن فحص مثيلة في البويضات والأجنة الفردية (الشكل 1). بعد التضخيم PCR متداخلة باستخدام بادئات بيسلفيت تحويلها، فمن الممكن لتأكيد تحويل ناجح من خلال وضع تصور حجم قطعة الصحيح على جل الاغاروز (الشكل 2). بويضة الفرديةتمثل واحدة أليل الأبوية، ونظريا، لديها واحد نمط مثلأيشن مطبوع. على هذا النحو، يمكن اختبار الدور الثاني لتلوث المنتجات PCR غير مقصود. ويمكن استخدام انزيم تقييد الحساسة إلى الحامض النووي (مثل HinfI أو DpnII) إكمال عملية هضم الطعام والثاني منتج PCR جولة لتقييم ما إذا كان يحتوي على أليل ميثليته أو unmethylated (الشكل 3). والمشقوق مكيف ميثليته ضمن تسلسل اعتراف الانزيم في حين لم يعد يعترف 1 C unmethylated أن يتم تحويلها إلى T بواسطة انزيم وغير المصقول. يجب التخلص من أي عينة MII بويضة تحتوي على كل من ميثليته والأليلات unmethylated، لأنه يدل على تلوث الخلية الركامية (الشكل 3). بعد ربط والتحول، لا يمكن نجاح التضخيم PCR مستعمرة تصور على هلام الاغاروز لضمان ارسال عينات مع حجم المنتج الصحيح لتسلسل (الشكل 4). وأخيرا، فإن تسلسل من خمسة CL الفرديةوينبغي أن منها من بويضة MII إنتاج خمسة أنماط مثيلة متطابقة ومتماثلة أسعار التحويل nonCpG (الشكل 5A). يجب التخلص من أي عينات التي تحتوي على أكثر من نمط واحد (الشكل 5B). منذ ovulated البويضات صناعة المعلومات لديها نسخ كروموسوم اثنين أو هيئة المرفقة القطبية، وهناك إمكانية للحصول على نمطين تسلسل مماثل (الشكل 5C). نوصي تجاهل البيانات من البويضات التي لديها أنماط مثيلة متباينة للغاية حيث لا قزع تلوث الخلية يمكن استبعاده.

الشكل 1. تخطيطي لفحص سيت واحدة الطفرات بيسلفيت.

النتائج الممثل الشكل 2. من التضخيم ^{الثانية} 2 الدور لSnrpn من الغناءلو MII البويضة على هلام الاغاروز 1.5٪. الممرات 1-4 أربعة واحد البويضات صناعة المعلومات وممر 5 هو سيطرة سلبية (أي بويضة). يتوقع حجم amplicon لSnrpn هو 420 شركة بريتيش بتروليوم. L، سلم.

النتائج الممثل الشكل 3. في الفترة من 2 جولة ^{الثانية} الهضم تقييد مثلأيشن محددة لSnrpn من بويضة واحدة MII على هلام الأكريلاميد 8٪. HinfI الهضم تقييد التشخيصية أن الحمض النووي الذي يؤوي unmethylated تي أن يلغي موقع تقييد (420bp، لين 1) أو الحمض النووي ميثليته التي تحتوي على C في موقع الاعتراف (قطع، 262، 103، وبريتش بتروليوم 54، لين 2). الهضم تظهر على حد سواء ميثليته وunmethylated مواقع الانزيم تقييد (عصابات قطع وتقطيعه، حارة 3) تدل على تلوث الخلية الركامية. L، سلم.

الشكل 4. نتائج الممثل لتضخيم PCR مستعمرة لSnrpn من بويضة واحدة على صناعة المعلومات هلام الاغاروز 1.5٪. يتوقع حجم amplicon بعد الربط من Snrpn في ناقلات pGEM-T سهل واستخدام M13 إلى الأمام، والاشعال العكس هو 656 شركة بريتيش بتروليوم. لين 1-8، amplicons من الحيوانات المستنسخة 1-8. استنساخ 5 لديه حجم amplicon غير صحيح، وينبغي ألا يتم إرسالها في التسلسل.

الشكل 5. الممثل تسلسل النتائج لSnrpn من بويضة واحدة صناعة المعلومات. Snrpn وميثليته في البويضات. الدوائر السوداء تشير CpGs ميثليته. دوائر بيضاء تشير CpGs unmethylated. عدد الدليل السياسي الشامل والتنسيب هو ممثل للماوس الأنثى B6 السلالة. أ) المتوقعة تسلسل النتائج لSnrpn من بويضة واحدة صناعة المعلومات. يجب فقط ضفيرة واحدة من الحمض النووي في تضخيم كل الحيوانات المستنسخة الخامسة. البويضات مع نمط مثيلة واحدة ومتطابقة طقطق تحويل غير الدليل السياسي الشاملوينبغي أن تدرج في التحليلات ن (التحويل في المئة من CpGs عدم وأشارت إلى الحق ومحسوبة على أساس عدد من المنظمات غير الدليل السياسي الشامل cytosines تحويلها إلى الثايمين كنسبة مئوية من cytosines عدم الدليل السياسي الشامل الكل). ب) نتائج التسلسل الجيني لSnrpn من بويضة واحدة مع صناعة المعلومات تلوث الخلية الركامية. لاحظ الاختلاف بين الولايات مثلأيشن وأنماط متعددة تشير إلى تحويل التضخيم حبلا. ج) تسلسل النتائج لSnrpn من بويضة واحدة مع صناعة المعلومات على حد سواء نسخ كروموسوم أو القطبية إدراج الجسم.

Discussion

هذا الفحص بويضة واحدة تحتوي على العديد من الخطوات مع عدد التي تعتبر بالغة الأهمية وتتطلب رعاية خاصة. الأول هو غسل البويضة. من المهم بشكل خاص لغسل كل بويضة عدة مرات في المتوسط ​​الطازجة يسقط بعد العلاج هيالورونيداز لإزالة الركام وخلايا أكبر عدد ممكن. وعلاوة على ذلك، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
مجموعة سيت
هيالورونيداز	سيغما	H4272
الحمضية Tyrode	سيغما	T1788
بروتين K	سيغما	P5568
10٪ IGEPAL	Bioshop	NON999.500
تحلل الحل
تريس 7.5 درجة الحموضة	Bioshop	TRS001.5
LiCl	سيغما	L9650	& Nباهوجان ساماج؛
EDTA 8.0 درجة الحموضة	سيغما	E5134
اغطية	Bioshop	LDS701.10
DTT	إينفيتروجن	P2325
SDS تحلل الواق
الشركة المصرية للاتصالات 7.5 درجة الحموضة	Bioshop (تريس) سيغما (EDTA)	TRS001.5 E5134
10٪ SDS	Bioshop	SDS001.500
بيسلفيت التحويل
هيدروكسيد الصوديوم	سيغما	S8045
Hydrogensulfite الصوديوم (بيسلفيت الصوديوم)	سيغما	243973	؛
هيدروكينون	سيغما	H9003
منخفض الانصهار نقطة (LMP) الاغاروز	سيغما	A9414
الزيوت المعدنية	سيغما	M8410
M2 متوسط	سيغما	M7167
GIBCO ماء مقطر	إينفيتروجن	15230-196
المعقمة مزدوج المقطر (د د) المياه
PCR
Illustra ميكس بداية ساخنة RTG	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	28-9006-54
240 نانوغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال خميرة	إينفيتروجن	15401-011
5X رد الفعل GoTaq الأخضر الواق	المؤيدميجا	M7911
متداخلة الاشعال الداخلي والخارجي	سيغما
رباط
Promega pGEM-T المتجهات سهل	فيشر العلمية	A1360
TA الاستنساخ
الخلايا المختصة القولونية	الإنزيم بحوث كورب	T3009
معدات
تشريح مجهر
70 درجة مئوية و 90 درجة مئوية الحرارة كتل
37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية Waterbaths (42 درجة مئوية لمدة التحولات)
المهزة
PCR آلة