JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

فهم وظيفة النظام العصبي المركزي الفقاريات يتطلب من الخلايا العصبية تسجيلات عديدة بسبب الوظيفة القشرية تنشأ على مستوى السكان من الخلايا العصبية. مخلوطة الوصول العشوائي المسح نحن هنا وصف أسلوب بصري لتسجيل النشاط العصبي للقرار suprathreshold وحيدة الخلية واحد مسمار،. هذه الطريقة السجلات الكالسيوم مضان إشارات جسدية من الخلايا العصبية تصل إلى 100 الزمنية للقرار عالية. خوارزمية الاحتمالات القصوى deconvolves النشاط العصبي الأساسي suprathreshold من الكالسيوم إشارات جسدية مضان. هذا الأسلوب يكشف موثوق المسامير مع كفاءة عالية والكشف عن انخفاض معدل من ايجابيات كاذبة، ويمكن استخدامها لدراسة السكان العصبية في المختبر و في الجسم الحي.

Abstract

وعادة ما تجرى إشارة المعلومات في النظام العصبي المركزي من الفقاريات السكان من الخلايا العصبية بدلا من الخلايا العصبية الفردية. كما نشر النشاط التشويك suprathreshold ينطوي السكان من الخلايا العصبية. الدراسات التجريبية معالجة ظيفة القشرية مباشرة تتطلب بالتالي من التسجيلات السكان من الخلايا العصبية مع ارتفاع القرار. نحن هنا وصف أسلوب البصرية وخوارزمية deconvolution لتسجيل النشاط العصبي من الخلايا العصبية تصل إلى 100 مع القرار وحيدة الخلية واحد مسمار. هذه الطريقة تعتمد على الكشف عن الزيادات العابرة في داخل الخلايا الجسدية تركيز الكالسيوم المرتبطة طفرات suprathreshold الكهربائية (إمكانات العمل) في الخلايا العصبية القشرية. ويتحقق القرار الزمنية عالية من التسجيلات البصرية بواسطة تقنية مسح سريع الوصول العشوائي باستخدام صوتية البصرية انحراف (AODs) 1. ثنائي الفوتون الإثارة من نتائج الكالسيوم الحساسة للصبغة في القرار المكانية العالية في الدماغ تيس مبهمةمقاضاة 2. ويتحقق إعمار المسامير من التسجيلات الكالسيوم مضان بطريقة الاحتمالات القصوى. في وقت واحد التسجيلات الكهربية والضوئية لدينا تشير إلى أن طريقة موثوق يكشف المسامير (> 97٪ ارتفاع الكشف الكفاءة)، لديها انخفاض معدل كاذبة إيجابية الكشف عن ارتفاع (<0.003 المسامير / ثانية)، وعالية الدقة الزمنية (حوالي 3 مللي) 3. ويمكن استخدام هذه الطريقة البصرية لكشف ارتفاع لتسجيل النشاط العصبي في المختبر وعلى الحيوانات تخدير في الجسم الحي 3،4.

Protocol

1. الإعداد البصرية (الشكل 1)

  1. لمدة الفوتون الإثارة يتم استخدام الأشعة تحت الحمراء نظام ليزر الفيمتو ثانية نابض مع البقول. مطلوب انتاج الليزر عالية الطاقة (في بعض الحالات> 2W في الطول الموجي نانومتر 890) لتعويض الخسائر الكبيرة التي أدخلتها المكونات البصرية للنظام.
  2. نظام prechirper تتكون من اثنين من المناشير يضفي سرعة تشتت الفريق السلبية (GVD) على نبضات الليزر قبل انحراف صوتية البصرية (AODs) للتعويض عن تشتت الزمنية التي أدخلتها AODs 1.
  3. اثنين AODs مع فتحات كبيرة (10 ملم لهدف الغمر 40X مع المياه NA 0.8) تشتيت أشعة الليزر في بعدين.
  4. يتم وضع مقضب الحيود عاكسة مع 100 بساتين / مم 13 سم وراء AODs لتعويض التشتت المكاني الذي عرضته AODs عند استخدام نبضات ليزر قصيرة.
  5. يتم توجيه شعاع الليزر مع اثنين من التلسكوبات تتابع في منفذ الكاميرا لتستقيم microscoبي.
  6. توضع القزحيات على فترات منتظمة لمحاذاة المكونات البصرية.
  7. A مزدوج اللون beamsplitter أمام الهدف ينقل ضوء الأشعة تحت الحمراء لإثارة العينة ويعكس ضوء مضان من العينة على كاشف.
  8. كشف عن برنامج التحصين الموسع وtransfluorescence (photomultipliers، فرق إدارة المشاريع PMT) جمع إشارة مضان من خلال موضوعية و- إن وجدت - من خلال المكثف.
  9. يتم وضع الفلاتر الزجاج الملون (BG-39، 3-5 مم) أمام أجهزة الكشف لمنع الوصول إلى الإثارة ضوء كاشفات.
  10. يتم التحكم في زوايا انحراف AOD بواسطة جهاز كمبيوتر مجهزة لوحة الرقمية التناظرية تحويل (156.25 معدل مدار الساعة كيلو هرتز)، وهذا بدوره يقود الجهد مؤشرات التذبذب التي تسيطر عليها.
  11. يتم ترحيل الإشارة من photomultipliers من خلال مرشح تمرير منخفض بتروورث (قطع تواتر 100 كيلو هرتز) ورقمية بواسطة محول تناظري رقمي (156.25 معدل مدار الساعة كيلو هرتز) قبل أن يتم تخزينها فيكمبيوتر لتحليلها.
  12. ويتم اختبار المحاذاة والضوضاء الكهربائية عن طريق تسجيل توزيع إشارات مضان مع وبدون ضوء الليزر، في كسب المنخفضة والعالية من photomultipliers، وكذلك مع وبدون المؤشر. الماسح الضوئي والإعداد بشكل صحيح ومحمية عند عرض توزيع الإشارات في تحقيق مكاسب عالية مضان ومع مؤشر أكبر بكثير من الاعراض من التوزيعات الأخرى من الإشارات مضان (الشكل 2).

2. إجراءات تجريبية

  1. مخلوطة الوصول العشوائي المسح تعتمد على الكشف عن الزيادات في داخل الخلايا الكالسيوم. يمكن ملطخة عدد كبير من الخلايا العصبية باستخدام حقن بلعة من النموذج استر لمؤشر الكالسيوم (على سبيل المثال ولاية أوريغون الخضراء Bapta 488-1 AM) في الأنسجة العصبية 5.
  2. يتم تسجيل عدة مواقع من كل عصبون سوما، كل لفترة قصيرة ("التردد"، 4 مواقع، 6.4 ميكرو ثانية لكل موقع = 25،6 ميكرو ثانية وقت التسجيل لهمنظمة العمل ضد الجوع الخلايا العصبية في كل دورة، الشكل. 3C). لتحديد الخلايا العصبية ذات الاهتمام وحصلت على الإطار الكامل تتكون من 256x256 بكسل (الشكل 3A). تم تحديد مركز كل عصبون سوما ليتم تسجيلها يدويا داخل هذه الصورة. برنامج التحكم تلقائيا بإضافة ثلاث نقاط على مسافة حوالي 2 ميكرومتر هذا المركز.
  3. في كل دورة، يتم تسجيل إشارة مضان من كل من الخلايا العصبية 40 (الشكل 3B). يتم تكرار هذه العملية لكامل مدة التسجيل واحد (5 الثاني = 3255 تسجيل دورات، 1 = 1،536 دورة مللي ثانية).

3. أدوات البرمجيات عبر الإنترنت لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الكشف ارتفاع

  1. ارتفاع الكشف عن إشارات جسدية مضان الكالسيوم يعتمد على نسبة عالية (S / N) إشارة إلى الضوضاء من الكالسيوم إشارات جسدية مضان. ويمكن تحقيق ارتفاع S / N عن طريق زيادة كثافة الإثارة. شدة الإثارة، ومع ذلك، لا يمكن إلا أن تزيد إلى حد معين لأن لل photodamage. ارتفاع الكشف مرتفعة خلال يندو صغيرة جداث من شدة الإثارة حيث لا يوجد سوى إشارات مضان لديها عالية S / N ولكن لوحظ photodamage فقط القليل جدا 3. من أجل ضمان أن الإشارات المسجلة هي ضمن إطار الكشف ارتفاع عال خلال التسجيلات نحن نراقب معدل الفوتون (انظر المعادلة 3.2) وتراجع خط الأساس مضان باستخدام التحليل عبر الإنترنت.
  2. يتم احتساب معدل تقريبي الفوتون في الخلايا العصبية من نافذة زمنية قصيرة (100-200 مللي ثانية) من الضوضاء خط الأساس. عدد الفوتونات (N λ) ومعدل الفوتون (λ λ N = / Δt) ويتم احتساب القيم من مضان من المناسب توزيع (σ) التغيرات النسبية مضان مع المعادلة التالية:

figure-protocol-4963
هذه المعادلة تمثل توزيع بواسون لقطة من الضوضاء الفوتون مع تغيير متغير مع تغير نسبي مضان: ΔF / F = (G * N λ (ر)-G * N & لامبنك دلتا آسيا، 0،) / G * N λ، 0 حيث G يدل على زيادة تراكمية من مضخم وجميع المكونات الأخرى الإلكترونية. علما أن هذه المعادلة لا تحدد بشكل صحيح الكشف عن عدد من الفوتونات لفي الجسم الحي التسجيلات لأن هناك مصادر أخرى من الضوضاء (التحف الحركة)، بالإضافة إلى الضوضاء النار الفوتون. مع ذلك هذه المعادلة هو مفيد لفي التسجيلات الحية لتقدير الضوضاء.

  1. يتم احتساب خط الأساس مضان من نافذة الوقت نفسه وتآمر بوصفها وظيفة من الزمن أو المحاكمات. يتم الاحتفاظ انخفاض متوسط ​​خط أساس أدناه ق / 0،0002 عن طريق تعديل قوة الليزر لاكتشاف ارتفاع ينحدر بسرعة عند تجاوز هذا الحد.
  2. يتم التحقق من كل دقيقة 10-20 مواقف somata الخلايا العصبية مرة أخرى من خلال الحصول على صورة الإطار الكامل. إذا لزم الأمر، يتم تعديل مواقع التسجيل. ويمكن تعديل مواقع لجميع الخلايا العصبية في وقت واحد، أو الخلايا العصبية للفرد.

4. Reconstructioن من توقيت إشارات من ارتفاع مضان (deconvolution)

  1. الإشارات مضان الناجمة عن النشاط العصبي في كثير من الأحيان في وقت summate لأن تسوس من العابرين الكالسيوم طويلة (عدة مئات من ميلي ثانية). وهناك طريقة deconvolution يعيد ارتفاع وارتفاع توقيت إشارات من مضان.
  2. لتحديد ارتفاع القطار على الأرجح وراء إشارة مضان مسجل، تتم مقارنة نماذج مختلفة. تستخدم هنا لدينا الخوارزمية الجينية لتحديد نموذج - وبالتالي ارتفاع القطار وأوقات ارتفاع - مع احتمال الحد الأقصى.
  3. في السكان غير متجانسة من الخلايا العصبية، يمكن أن ارتفاع الكالسيوم، أثار إشارة تختلف بين الخلايا العصبية. للتحليل غير خاضعة للرقابة من مجموعات البيانات قمنا بتصميم خوارزمية تأخذ بعين الاعتبار الاختلاف في إشارة الكالسيوم ارتفاع-أثار من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية.
  4. لتجنب عدد كبير من اكتشافات إيجابية كاذبة من المفيد أن تقليص السعة المسموح بها والوقت تسوس المستمر للمodel للإشارة الكالسيوم ارتفاع-أثار. يتم تسجيل توزيع مشترك من الوقت والسعة تسوس المستمر للارتفاع واحد العابرين الكالسيوم أثار في مجموعة منفصلة من التجارب من نفس النوع من الخلايا العصبية في ظل الظروف التجريبية في وقت واحد باستخدام نفس التسجيلات الكهربية والضوئية.
  5. لمراعاة التغييرات بطيئة وخط الأساس لخفض التكاليف الحسابية من deconvolving، وتنقسم إلى عدة تسجيلات أطول أقصر آثار من 1-5 ثواني.
  6. لكل الخلايا العصبية وتسجيل كل، قد خوارزمية deconvolution اختبار عدد كبير من النماذج (ما يصل إلى 1،000،000 نماذج مختلفة أو أكثر). لتسريع deconvolution، وتجربة واحدة على deconvolved تصل إلى 10 أجهزة كمبيوتر مختلفة في نفس الوقت.
  7. بعد deconvolution، ويتم تحليل البيانات ارتفاع وتفتيشها. وتحسب رسم بياني الوقت شبه التحفيز، احتمال ارتفاع، ومعدل إطلاق النار (ارتفاع متوسط ​​نصيب الخلايا العصبية) بطريقة آلية.

5.ممثل النتائج

يتوقف نجاح الكشف ارتفاع على نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية للإشارات المسجلة مضان الكالسيوم جسدية. ببساطة يمكن استخدام معدلات عالية الإثارة (عالية الطاقة ليزر) يؤدي إلى تأثير سلبي على photoeffects من المواد البيولوجية (photodamage). في مخلوطة photodamage المسح الوصول العشوائي كما يظهر انخفاض في مضان خط الأساس ويقلل من ارتفاع إشارات الكالسيوم، أثار مضان. يمكن للانخفاض في إشارة ارتفاع-أثار سرعان ما يؤدي إلى عدم الكشف عن المسامير. لا يوجد سوى نافذة صغيرة جدا من شدة الإثارة حيث الارتفاع الكشف عن إشارات مضان عالية. وفي الطرف الأعلى يقتصر هذا الإطار من photodamage، على الطرف الأدنى الإشارات مضان لديهم نقص فى إشارة إلى نسبة الضوضاء. لالخلايا العصبية القشرية في شرائح الحادة نستخدم قوة الليزر مما يؤدي إلى معدلات الفوتون من حوالي 400،000-1،500،000 الفوتون / ثانية عند التسجيل في حوالي 100 ميكرون تحت سطح شريحة. عند استخدام عاليةمؤشر تقارب - هنا أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 - هذه الإشارة كافية للكشف عن طفرات فردية. التين. 3E مثالا على إشارة مضان سجلت في معدل الإثارة منخفضة جدا، مثال واحد لتسجيل ضمن إطار الكشف، واحد في معدل الإثارة عالية جدا.

مخلوطة مقارنة مع التقنيات الأخرى لتسجيل النشاط العصبي للقرار وحيدة الخلية واحد مسمار، الوصول العشوائي المسح يمكن أن تسجل عددا أكبر من الخلايا العصبية من السكان، نفس المحلية، وأقل الغازية على سبيل المثال مقارنة tetrode / multielectrode التسجيلات . ويمكن استخدام مخلوطة بالتالي الوصول العشوائي المسح لتسجيل النشاط العصبي من خلايا عصبية كثيرة لقياس المعلومات المتبادلة أشار حسب النشاط suprathreshold 6 (الشكل 4A)، والتغيرات في النشاط العصبي في الخلايا العصبية يبلغ عدد سكانها (اللدونة القشرية)، ونشر النشاط suprathreshold من خلال السكان من الخلايا العصبية 14 (الشكل 4B)

figure-protocol-10168 ALT = "الشكل 1" SRC = "/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg" />
الشكل 1. التصميم البصري للمسح إعداد الوصول العشوائي مخلوطة.

figure-protocol-10395
الشكل 2 محاذاة والاختبار: توزيع إشارات مضان سجلت تحت ظروف مختلفة. A) لا ضوء الليزر وانخفاض مكاسب مضخم، B) في تحقيق مكاسب أعلى PMT، ولكن لا ضوء الليزر، وتوزيع أوسع بسبب الظلام الحالي مضخم. C) مع ليزر على وسجلت زيادة في PMT عالية. ومن شأن الفرق بين التوزيعات في هو موضح في B وتوزيع هذه تشير إلى أن الضوء الإثارة تصل إلى أجهزة الكشف عن PMT. D) وتوزيع اشارات مضان سجلت زيادة في ارتفاع الخلايا العصبية من somata. إذا لا يوجد مصدر الضوضاء الأخرى يسهم هذا التوزيع ينشأ من الفوتون النار الضوضاء فقط.

. JPG "/>
الشكل 3 A) صورة كاملة الإطار مضان للكشف وتحديد مواقع الخلايا العصبية somata، B) مسح مسار دورة واحدة، C) توضيحات لمبدأ التدرج؛ تسجل في كل المواقع (دائرة) سوما عدة قبل أن ينتقل شعاع لآخر سوما، D) شكل توضيحي لإخراج D اثنين / A القنوات. لكل سوما الخلايا العصبية، يتم تسجيل إشارة مضان من 4 مناطق مختلفة في كل سوما (S1-S4). وبالنظر إلى موقع كل بقعة من X وموقف ذ. يتم إرسال X Y والمواقف لجميع البقع والخلايا العصبية لتحويل جميع الرقمية إلى تناظرية بطريقة متسلسلة. بينما يتم نقل الشعاع بين الخلايا العصبية somata اثنين، ويكتسب أي إشارة (فارغة). E) أمثلة على إشارات مضان. لاحظ أن كل مثال يوضح ردا على أحد ارتفاع (مقاسا مع تسجيل الخلية الكهربية المرفقة).

figure-protocol-11823
الشكل 4. دراسة كورتيكال الدالة باستخدام مخلوطة الوصول العشوائي المسح. A) قياس المعلومات المتبادلة من قبل السكان أشار الخلايا العصبية. صورة تظهر صورة مجهرية من أعلى شريحة الدماغ الحادة وماصات التحفيز 2 وضعت في نفس العمود القشرية في طبقة 4 (L4). الرسوم البيانية تظهر الاستجابات العصبية مركز لكل تكرار حافزا. يبين الرسم البياني السفلي المعلومات المتبادلة أشار شانون من عدد السكان المسجلين من الخلايا العصبية. B) نشر قياس النشاط suprathreshold ارتفاعه (نشر الإشارة) بين السكان من الخلايا العصبية القشرية. الرسم البياني يوضح التصميم التجريبي العليا، مركز الصورة تظهر صورة مضان، تشير الخطوط المتقطعة الحدود برميل، وانخفاض يبين الرسم البياني المسامير الكشف ردا على التحفيز الكهربائي للألياف المهادي (مثلثات).

Discussion

مخلوطة الوصول العشوائي المسح يكشف بشكل غير مباشر نشاط suprathreshold ارتفاعه من الزيادات في الكالسيوم داخل الخلايا الجسدية المرتبطة بكل ارتفاع في somata الخلايا العصبية. تم الكشف عن الزيادات في الكالسيوم داخل الخلايا بواسطة الأصباغ الفلورية الكالسيوم. القيود المفروضة على ا?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور راندي تشيتوود لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة وايت هول P. ألفريد سلون منح المؤسسة لHJK.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
يتم سرد المكونات البصرية في النظام، بدءا من ليزر
تيتان: ياقوت ليزر شركة متماسكة الحرباء الترا 2 عالية الطاقة الموصى بها الإخراج (> 900 نانومتر في 2W)
الوني عدسة و = 30 مم ثور مختبرات AC254-030-B المضادة للانعكاس (AR) 650-1050 نانومتر طلاء لل
الوني عدسة و = 100 مم ثور مختبرات AC254-100-B AR 650-1050 نانومتر
عدسة و = 75 مم ثور مختبرات LA1608-B AR 650-1050 نانومتر
عدسة و = 175 مم ثور مختبرات LA1229-B AR 650-1050 نانومتر
الوني عدسة و = 300 مم ثور مختبرات AC254-300-B AR 650-1050 نانومتر
الوني عدسة و = 100 مم ثور مختبرات AC254-100-B AR 650-1050 نانومتر
الوني عدسة و = 100 مم ثور مختبرات AC254-100-B AR 650-1050 نانومتر
انحراف صوتية البصرية Intraaction كورب ATD 6510CD2
تعكس الحيود مقضب نيوبورت 53-011R 100 الأخاديد / مم للعرض النطاق الترددي ميغاهرتز مع AODs 65 و زاوية المسح الضوئي من 45 مراد
21،6 مم بروستر رشة عمل امدا بحوث البصريات شركة IBP21.6SF10
الزجاج الملون شوت BG-39
مزدوج اللون مرآة صفاء التكنولوجيا كورب Z532RDC
مضخم وحدات هاماماتسو H9305-03
DAC-ADC المجلس الصكوك الوطنية PCI-6115
ولاية أوريغون الخضراء 488-Bapta 01:00 إينفيتروجن O-6807

References

  1. Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73 (1990).
  3. Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision. J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).
  4. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).
  5. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  6. Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex. J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).
  7. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  8. Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb. J. Physiol. 582, 163-175 (2007).
  9. Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism. Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).
  10. Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope. J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).
  11. Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods. Biophys. J. 97, 636-655 (2009).
  12. Yaksi, E., Friedrich, R. W. Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).
  13. Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).
  14. Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex. Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

67

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved