تركيبات لتجميد التجفيف من البكتيريا وتأثيرها على بقاء الخلية

Summary

تجميد التجفيف هو في كثير من الأحيان وسيلة سهلة ومريحة للحصول على المنتجات الجافة من الخلايا البكتيرية قابلة للحياة. قضية من هذه العملية هو بقاء الخلية. ونحن من التفصيل هنا إجراء التحقيق في كيفية ويتأثر بقاء الخلية أثناء التجميد والتجفيف عن طريق خصائص الصيغة المستخدمة.

Abstract

يمكن إزالة المياه الخلوية لتعطيل عكسية الكائنات الحية الدقيقة لتسهيل التخزين. أسلوب واحد من هذا القبيل هو من إزالة التجميد والتجفيف، والتي تعتبر وسيلة لطيف الجفاف. لتسهيل بقاء الخلية أثناء التجفيف، غالبا ما تصاغ الخلايا مسبقا. يشكل صياغة مصفوفة التي يضمن الخلايا ويحميهم من الضغوط الضارة المختلفة المفروضة على الخلايا أثناء التجميد والتجفيف. نقدم هنا طريقة عامة لتقييم معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا بعد التجميد والتجفيف ونحن لتوضيح ذلك من خلال مقارنة النتائج المتحصل عليها مع أربع صيغ مختلفة: السكروز ديساكهارايد، والسكروز المستمدة البوليمر Ficoll PM400، والسكريات منها هيدروكسي إيثيل السليلوز (HEC ) وهيدروكسي بروبيل ميثيل السليلوز (HPMC)، على سلالتين من البكتيريا، P. KT2440 الكريهة وA. A6 chlorophenolicus. في هذا العمل الذي نقوم توضيح كيفية إعداد صيغ لالتجميد والتجفيف وكيفية التحقيق في ميكانالمذهبين من بقاء الخلية بعد الإماهة بواسطة تميز صياغة باستخدام من الفرق الكالوري المسح الضوئي (DSC)، وقياسات التوتر السطحي، تحليل الأشعة السينية، والمجهر الإلكتروني والمتعلقة تلك البيانات لمعدلات البقاء على قيد الحياة. تم اختيار البوليمرات للحصول على هيكل أحادى من السكاريد منها تشبه السكروز إلى درجات متفاوتة. باستخدام هذا الأسلوب الإعداد أظهرنا أن البوليمرات يمكن أن تدعم بقاء الخلية على نحو فعال مثل ثنائيات السكاريد إذا كانت بعض الخصائص الفيزيائية للصياغة يتم التحكم ^1.

Protocol

1. زراعة وحصاد P. الكريهة

1. تعد ثقافة كاتب الزائفة الكريهة، فحقن 100 مل من مرق الصويا زيتية (TSB) مع مستعمرة P. الخلايا الكريهة تربيتها على أجار تستكمل مع مرق الصويا زيتية (TSA). الحفاظ على الثقافة في 30 درجة مئوية على لوحة تهز الغروب في 130 دورة في الدقيقة.
2. بعد 7 ساعات من نقل قسامة ما يعادل ثقافة كاتب إلى 1/10 من الحجم النهائي للثقافة الرئيسي لالطازجة TSB المتوسطة. الحفاظ على الخلايا عند 30 درجة مئوية على لوحة اهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.
3. بعد 16 ساعة من النمو ويتم حصاد الخلايا عن طريق الغزل ثقافة الخلية في 1،500 x ج لمدة 20 دقيقة في RT. صب طاف وغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق بيليه الخلية هو كلوريد الصوديوم في محلول متساوي التوتر هو أن لمتوسطة النمو. في هذه الحالة تم استخدام محلول كلوريد الصوديوم 150 ملم. ثم يتم طرد الخلايا مرة أخرى، ويصب طاف قبل إعادة التعليق الخلايا في صياغة المتوسطة،انظر الخطوة 3.2.

2. استزراع الأنواع الأخرى

1. للتكيف بروتوكول الأنواع البكتيرية الأخرى يجب أن يتم تغيير الإجراءات زراعة والحصاد وفقا لمتطلبات تلك الأنواع. لتجنب صدمة التناضحي عند التعامل مع الخلايا أثناء موسم الحصاد والخطوة غسل (ق)، والأسمولية من الحلول يحتاج إلى يتطابق مع متوسط ​​النمو عند الحصاد.

3. صياغة الخلايا

1. إعداد الحلول صياغة وزنها عن طريق مكونات المصفوفة منها وتذوب في الماء. لتحقيق ظروف متساوي التوتر، إما ضبط كمية من سواغ أو إضافة كلوريد الصوديوم أو بعض المذاب خلية أخرى متوافقة للوصول إلى الأسمولية المطلوب. وبالنسبة للمواد ذات الوزن الجزيئي المنخفض مثل ثنائيات السكاريد يمكن بسهولة تعديل المبالغ للوصول إلى ظروف متساوي التوتر. بالنسبة لمواد مثل البوليمرات التي هي من الوزن الجزيئي عالية، وتحظرب لابد من تعديلها مع خلية متوافق ذلكالعود، على سبيل المثال كلوريد الصوديوم أو ثنائيات السكاريد. لاحظ أن أي إضافة مادة سوف يؤثر على الخصائص الفيزيائية للصياغة، والتي بدورها قد تؤثر على تجميد التجفيف السلوك وبقاء الخلية.
2. صب الحل غسل (في هذه الحالة كلوريد الصوديوم) واعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام صياغة كل منها.
3. تأكد من أن الخلايا تنتشر متجانس. وvortexed تركيبات من اللزوجة المنخفضة في حين يتم خلط تركيبات من اللزوجة أعلى باستخدام بإضافة، على سبيل المثال.، بقضيب وتهز الحاوية حتى يتم تحقيق متجانسة الخلط.
4. تقسيم الصياغات في قارورة مجفف التجميد. يجب أن يكون وزنه قارورة فارغة، مع عينة قبل وبعد التجفيف بالتجميد لحساب كمية المياه المأخوذة أثناء التجميد والتجفيف.
5. إضافة سدادات المطاط إلى قارورة إذا كانت قارورة هي إلى أن تكون مختومة داخل مجفف تجميد، راجع الخطوة 4.3.
6. تعداد الخلايا في كل صياغة قبل التجميد والتجفيف، راجع الخطوة 6.

4. التجميد والتجفيف

1. شروط التجميد والتجفيف لا بد من تعديلها إلى الخصائص الفيزيائية للصياغة. المعلمة الأكثر أهمية هو في هذه الحالة درجة حرارة التحول الزجاجي، تيراغرام، من صياغة وتدل تيراغرام 'لعينة تجميد المركزة للإشارة إلى أن الماء ما زال موجودا. و'تيراغرام من صياغة تجميد المركزة يقاس بسهولة باستخدام الفرق الكالوري المسح الضوئي (DSC)، راجع الخطوة 7.
2. ضبط المعلمات من عملية التجفيف بالتجميد بحيث درجة حرارة العينة هو دائما تحت تيراغرام من العينة وأن الضغط غرفة يسمح لالتسامي سريع من الجليد، أي تجفيف الأولية، والمياه المتبقية في صياغة، أي الثانوية التجفيف. إذا كانت درجة الحرارة أعلى من عينة تيراغرام 'أثناء عملية التجفيف هناك خطر كبير من انهيار الهيكلية من العينة التي قد تقلل بشكل كبير من البقاء على قيد الحياة الخلوية.
3. لحماية المنتجات الجافة بعد جمعةreeze التجفيف الغلاف الجوي عينة لابد من السيطرة عليها. إذا كان ذلك ممكنا، وختم العينات في مجفف تجميد قبل أن يتم الإفراج عن فراغ في نهاية دورة التجميد والتجفيف. وبدلا من ذلك يمكن ملء قارورة مع جو المفضل. من المهم تجنب تعريض العينات لظروف المحيطة مثل أي رطوبة أو الحاضر الأكسجين في الغلاف الجوي تخزين سوف تؤثر على بقاء الخلايا.
4. زن قارورة.

5. الإماهة

1. ترطيب العينات مع الماء منزوع الأيونات ومعقمة. ينبغي أن كمية المياه التي يمكن ان تضاف يكون نفس المبلغ خلال إزالة التجميد والتجفيف ويتم حسابها من وزن القارورة الفارغة، ونفس القارورة مع عينة قبل وبعد التجميد والتجفيف. دوامة العينات والآن مرة أخرى ثم حتى تظهر حلول متجانسة.

6. تعداد

1. رسم 100 ميكرولتر من كل عينة وجعل التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف. من التخفيفات من الأسواق العالمية ضغطهاومطلي بقية 100 ميكرولتر على TSA لوحات. يتم تحضين لوحات في درجة الحرارة والوقت المطلوب.

7. توصيف صياغة سلوك التجميد

1. تأخذ كمية صغيرة، 5 - 10 ملغ من العينة وضعه في مقلاة DSC-الألمنيوم مع غطاء. إعداد عموم فارغة كمرجع.
2. وضع برنامج مسح درجة الحرارة DSC. يتم تعيين برنامج التبريد لتقليد خطوة التجميد في برنامج التجميد والتجفيف. ويتم ذلك كما حركية التبريد يمكن أن تؤثر على 'تيراغرام من الصياغات رطب. قبل أن يبدأ المسح التدفئة اسقاط درجة الحرارة إلى أقل بكثير من المتوقع تيراغرام 'من الصياغات التحقيق، وعادة -100 درجة مئوية.
3. اختيار السعر المناسب التدفئة، عادة معدل التسخين من 5 - 40 درجة مئوية يستخدم / دقيقة. يتم التعبير عن حرارة سجلت في إشارة تدفق واط وسوف يتأثر معدل التسخين. وهناك معدل التسخين العالي إعطاء إشارة أكبر من تيراغرام '.
4. تعيين نطاق درجة الحرارة لدرجة أننير يغطي كلا تيراغرام 'وذوبان صياغة.

8. سطح قياسات التوتر من الصياغات المطفأ

1. الإعداد التجريبية المستخدمة في هذه التجربة هو وفقا لطريقة دونوي لقياس السطح.
2. تنظيف خاتم البلاتين وسفينة قياس بعناية. يتم شطف السفينة مع الأسيتون، مسحت بمنديل خالية من الوبر، ثم أحرق في الداخل مع لهب عديم اللون. الحلبة باللون الأحمر في لهب عديم اللون.
3. ملء وعاء مع الحل والسماح للسطح تسوية قبل القياس. لإيجاد حلول حيث يتم الوصول إلى حالة التوازن إلا بعد فترة طويلة، على سبيل المثال البوليمرات، فإن الإعداد بسيطة تستخدم هنا توفير البيانات النوعية.
4. لتركيبات مع اللزوجة العالية، على سبيل المثال حلول من 2٪ (W / W) HEC أو HPMC، التوتر السطحي يجب ان يقاس على الحلول من تركيزات أقل ومن ثم استقراء. ويمكن أن يتم هذا من خلال الاستفادة من حقيقة أنانخفاض في مستويات التوتر السطحي قبالة بتركيزات أقل من 0.5٪ (W / W).

9. تحليل الأشعة السينية من الصياغات جاف

1. تأخذ كمية صغيرة من مصفوفة / البكتيريا وتحميل فإنه على صاحب العينة.
2. تحميل صاحب العينة إلى X-راي حيود الأشعة السينية.
3. لتحليل أي مرحلة البلورية موجودة في عينة حزمة برنامج EVA من بروكر يمكن استخدامها.

10. المجهر الإلكتروني

1. تأخذ كمية صغيرة من مصفوفة / البكتيريا من قوارير وإصلاحه على كعب SEM.
2. تحميل حامل SEM في المغطي تفل (الحرارية البولارون VGScientific SC7640 المستخدمة في العمل الحالي) ومعطف عينة مع نانومتر قليل من الاتحاد الافريقي / المشتريات أو حزب العمال. في هذه التجارب كانت المعلمات الاخرق: 1،900 V، 20 أمبير، و 20 ثانية، ل~ 5-10 نانومتر الاتحاد الافريقي / المشتريات الطلاء. طلاء يقلل الشحن الكهربائي خلال الحصول على الصور. فمن المستحسن أن تبدأ مع الطلاء رقيقة، وإذا استمرت الشحن ويسبب صورةالتحف، وينبغي أن تطلى العينة مرة أخرى.
3. تحميل حامل SEM في غرفة SEM. حدد المعلمات التصوير المناسبة. لالأداة المستخدمة في الشكل 2 (FEI ستراتا DB235) استخدمنا 5 كيلو فولت تسريع الجهد، spotsize 3، على مسافة العمل من 5 ملم وكشف الإلكترون الثانوية.
4. اختياريا، فمن الممكن استخدام شعاع ايون مركزة لقطع المقاطع العرضية من البكتيريا جزءا لا يتجزأ من البوليمر لتكشف عن مزيد من التفاصيل.

النتائج

يعرض الجدول 1 بيانات عن تكوين صياغة والأحداث الحرارية التي كتبها DSC سجلت أثناء التسخين من الصيغ المجمدة وبناء من العينات الجافة والتوتر السطحي من الحلول صياغة. وقد تم تحديد T _G ​​'من السكروز إلى -40 ° C ² و ³ و يمكن أن يكون من الصعب كشف عن ?...

Discussion

وكان الدافع وراء هذه الدراسة إلى التحقيق في بعض خصائص الصياغة التي قد تكون ذات أهمية لبقاء الخلية أثناء التجميد والتجفيف. على الرغم من أن التسامح تجفيف الجوهرية يختلف بين الأنواع المختلفة، كما هو موضح في الشكل 1A، فإن الاتجاه على مدى الصياغات المختلفة دعم بق...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.