على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

Summary

يوصف بروتوكول لإعداد قوي وعصائر هيلا الصغيرة النووية. هذا البروتوكول هو قيمة للفحوصات التي تتطلب استخدام المجموعات الصغيرة من الخلايا، مثل الخلايا المعالجة بالأدوية أو رني. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على طريقة طائفة واسعة من فحوصات الجينات وغيرها من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا المريض.

Abstract

وقد أحرز قدر كبير من التقدم في التعبير الجيني في فهم استخدام نظم المختبر. بالنسبة لمعظم الدراسات، وتجرى فحوصات وظيفية خارج باستخدام مقتطفات التي يتم إعدادها في معظم 10-50 أو أكثر لترا من الخلايا التي تزرع في التعليق. ومع ذلك، هذه الاستعدادات واسعة النطاق ليست قابلة للاختبار سريع في المختبر الآثار التي تنجم عن مجموعة متنوعة من العلاجات الخلوية في الجسم الحي أو شروط. هذه المقالة الفيديو مجلة تظهر طريقة لإعداد وظيفي على نطاق صغير مقتطفات النووية، وذلك باستخدام خلايا هيلا كمثال على ذلك. ويتم هذا الأسلوب من استخدام عدد قليل من 3 150 ملم لوحات من الخلايا كما نمت monolayers ملتصقة. لتوضيح كفاءة مقتطفات صغيرة الحجم، وتبين لنا أن تكون نشطة قدر مقتطفات النووي بكميات كبيرة لردود الفعل الديناميكي بوليميريز الحمض النووي الريبي نسخ / الربط الثاني. للتدليل على فائدة من بروتوكول المقتطف، وتبين لنا أن يتم إلغاء الربط في مقتطفات أعدت من خلية هيلاعلاجه مع المخدرات E7107 الربط المانع. وينبغي أن البروتوكول على نطاق صغير تكون قابلة للتطبيق بشكل عام على أي عملية أو نوع من الخلايا التي يمكن أن يتم التحقيق في المختبر باستخدام خلاصات الخلوية. وتشمل هذه الخلايا المريضة التي لا تتوفر إلا بكميات محدودة أو الخلايا المعرضة للعوامل عديدة مثل الأدوية، وكلاء الحمض النووي الضارة، ورني، أو ترنسفكأيشن، والتي تتطلب استخدام السكان زنزانة صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، كميات صغيرة من الخلايا المزروعة حديثا هي مريحة و / أو المطلوبة لبعض التطبيقات.

Protocol

1. خلايا هيلا المتزايد على استخراج النووية

1. تستكمل لوحة خلايا هيلا على ثلاث لوحات 150 مم مع وسائل الاعلام DMEM مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عقار. تنمو في الحاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ₂ حتى الخلايا هي متكدسة 90٪.

بلاغ تقسيم الخلايا 1:10 من لوحة متكدسة وحصاد 3 أيام بعد انفصالها.

يمكن زراعتها بلاغ لوحة اضافية في حال عدم وجود ما يكفي من الخلايا مع ثلاث لوحات (على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا أقل من 90٪ متموجة).

2. إعداد والبرد حلول استخراج النووية

1. إعداد حلول جديدة على النحو المبين في الجدول رقم 2.
2. قسامة 10 مل من الاحتياطي منخفض التوتر في أنبوب 15 مل الصقر. قسامة 1 مل من مخزن الملح و 1 مل من الاحتياطي ملح قليلة إلى 1.5 أنابيب إيبندورف مل. البرد المخازن المؤقتة على الجليد. إضافة كميات مناسبة من PMSF وDTT إلى كل العازلة مباشرة قبل استخدامها (انظر الجدول 1).

3. حصاد خلايا هيلا لاستخراج النووية

1. نضح وسائل الاعلام من الخلايا، ويغسل خلايا مرة واحدة مع 13 مل من درجة حرارة الغرفة 1X PBS لكل لوحة.
2. نضح غسل برنامج تلفزيوني.

بلاغ نضح قدر من برنامج تلفزيوني ممكن عن طريق الشفط الأولى، ثم يقف لوحة على جانبها، والانتظار بضع ثوان، والشفط بقية.

3. باستخدام رافع الخلية، كشط الخلايا إلى الحافة السفلى من لوحات، ومن ثم نقل الخلايا إلى أنبوب إيبندورف. تجنب الوقوع في فقاعات. وينبغي لوحات 3 من خلايا كشط تنسجم مع واحدة 1،5 أنبوب إيبندورف مل.

بلاغ من السهل تقدير حجم الخلايا إذا تم استخدام أنبوب إيبندورف. ليصل الحجم، واستخدام أنابيب الصقر.

4. الطرد المركزي في درجة مئوية 4 في microfuge لمدة 5 دقائق عند 100 XG إلى خلايا بيليه.

4. تتورم خلايا هيلا في الواق منخفض التوتر

1. نضح بعناية في برنامج تلفزيوني من بيليه الخلية وتقدير حجم الخلية جاهزة (PCV) من خلال النظر في تدرج على أنبوب. ثلاث لوحات متكدسة من خلايا هيلا تسفر عن حوالي 500 ميكرولتر من PCV.
2. إضافة بمقدار 2X في PCV من الاحتياطي منخفض التوتر على بيليه الخلية. هز بلطف إلى resuspend الخلايا. استخدام Pipetman P1000 إلى resuspend بلطف الخلايا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا إذا لزم الأمر.
3. الطرد المركزي في درجة مئوية 4 في microfuge لمدة 5 دقائق عند 100 XG إلى خلايا بيليه. * وبدأت الخلايا إلى تضخم من قبل هذا الوقت، وحجم الخلية يجب أن تكون الآن عن ميكرولتر ميكرولتر-1000 750.
4. نضح بعناية الواق الواق منخفض التوتر وإضافة جديدة إلى منخفض التوتر الحجم النهائي من 1.5 مل. Resuspend الخلايا.
5. احتضان خلايا معلق منتفخة على الجليد لمدة 10 دقيقة.

5. ليز خلايا باستخدام الخالط Dounce

1. استخدام الاحتياطي منخفض التوتر لشطف dounce ومن ثم فتور على الجليد. مسح جاف مدقة مع WIP مهمة حساسةإيه (على سبيل المثال Kimwipe). إزالة المنطقة العازلة المتبقي من dounce باستخدام 1000 ميكرولتر طرف micropipette الموسعة.
2. نقل الخلايا تورم في dounce. تحرك ببطء مدقة ضيق من dounce صعودا وهبوطا إلى 5 مرات ليز الخلايا، والحرص على تجنب الفقاعات.
3. فحص للتحلل الخلية باستخدام قسامة 5 ميكرولتر من الخلايا من dounce. وضع قسامة في أنبوب إيبندورف وإضافة حجم مساو من أزرق التريبان. ضعي المزيج على شريحة ودراسة الخلايا باستخدام مجهر الضوء. ونوى الخلايا هي lysed تظهر باللون الأزرق. حوالي 90٪ تحلل مثالية.

معلومات سرية وعدد المرات التي ينبغي dounced الخلايا سوف تختلف تبعا لضيق من dounce. عند تنفيذ هذا البروتوكول للمرة الأولى، وتحديد عدد المرات إلى dounce من خلال تنفيذ الخطوة 5.3 بعد كل السكتة الدماغية مع dounce. لا تبالغ في dounce، سوف douncing المفرط تدمير نوى.

4. نقل الخلايا هي lysed إلى ما قبل chilleد إيبندورف أنبوب وتدور في microfuge 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 1500 × ز. وبيليه يحتوي على نواة. نقل بعناية وطاف على أنبوب جديد دون تعطيل نوى. وطاف يحتوي على السيتوبلازم.

معلومات سرية ويمكن استخدامها السيتوبلازم كما هو أو مواصلة تجهيزها لS100 باستخدام نفس عالية السرعة تستخدم لزيادة ونقصان مقتطفات السائبة (انظر ¹ لإعداد S100 نشط من مقتطفات بالجملة).

6. الملح استخراج النواة

1. تقدير حجم جاهزة النووية (الباسكي) من خلال النظر في تدرج على أنبوب. وPCV من 500 ميكرولتر ينتج عادة الباسكي من 400 ميكروليتر.
2. إضافة ½ X الباسكي من الاحتياطي سولت الأقل إلى النواة عن طريق إدراج معلومات سرية micropipette إلى أسفل الأنبوب والتدفق ببطء المخزن المؤقت في نواة في حين خلط بلطف. لا الماصة صعودا وهبوطا. نفض الغبار بلطف الأنابيب للتأكد من أن يتم معلق تماما بيليه في المخزن المؤقت ملح قليلة قبل الشروع في الاستمرار.
<لى> إضافة ½ X الباسكي من مخزن الملح وتخلط بسرعة 1 مرة بواسطة أنبوب للقلب. لا تهز. تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

بلاغ كن لطيفا مع نواة عندما يكونون في مخزن الملح لتجنب lysing لهم.

4. تدور في درجة مئوية 4 في microfuge لمدة 15 دقيقة في ز س 18000. وطاف هو استخراج الملح ارتفاع النووية (HS-NE). ثلاث لوحات من الخلايا تنتج عادة 500-600 ميكروليتر من HS-NE.

7. وتركز Dialyze استخراج النووية

1. نقل 500 ميكرولتر من HS-NE إلى مبرد مصغرة centricons (Amicon)، وتدور لمدة 50 دقيقة في 4 درجات مئوية في microfuge في ز س 14000. عكس المصغرة centricon (Amicon) ووضعها في أنبوب إيبندورف جديد. تدور لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية 1000 x ج لاسترداد HS-NE. وسوف تتركز HS-NE إلى ما يقرب من 115 ميكرولتر.
2. باستخدام Pipetman P200، نقل 45 aliquots ميكرولتر من HS-NE إلى شريحة مصغرة لغسيل الكلى، Lyzers-A، ووضعها في 500 مل من مخزن مبرد غسيل الكلى. ضمان أن يتم محاذاة الجزء السفلي من الشريحة-A-Lyzer مع الجزء السفلي من العوام. يقلب لمدة 1-2 ساعات في 4 درجة مئوية. سوف تظهر NE غائم بعد لغسيل الكلى.

معلومات سرية لا الطرد المركزي لإزالة راسب غائم الذي لوحظ بعد لغسيل الكلى، حيث ان هذا الطرد المركزي يقلل من نشاط للاستخراج.

3. يمكن استخدام NE فورا أو aliquoted. وينبغي Aliquots فلاش مجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في درجة مئوية -80 ويمكن تخزين الشرق الأدنى والخضوع لاثنين على الأقل تجميد ذوبان دورات دون فقدان النشاط.

8. ممثل النتائج

مؤخرا، تم تطوير كفاءة في أنظمة الأنابيب لتوصيل RNAP الثاني النسخ إلى الربط ^2-5. هذه الأنظمة تستخدم خلايا هيلا تزرع بكميات كبيرة، وبالتالي فهي غير قابلة للاختبار بسرعة من آثار العلاجات الخلوية محددة على عينات متعددة. بناء على هذا في حاجة الىالثانية الأداة المساعدة العامة لبروتوكول استخراج الصغيرة (انظر المناقشة)، أنشأنا قوية صغيرة الحجم طريقة استخراج النووية. ويظهر بيانات تمثيلية مقارنة الثاني RNAP النسخ / الربط رد فعل في استخراج صغار النووية مع استخراج النووية السائبة في الشكل 2. تأنشا CMV الحمض النووي، التي تحتوي على مروج CMV وتشفير كانت تستخدم ركيزة الربط القياسي (المنطقة الحرة برأس ^3، الشكل 2A) للتحليل. وعندما حضنت هذا البناء في الجزء الأكبر (الممرات 1-3) أو على نطاق صغير (الممرات 4-6) استخراج، وتوليفها مستويات مماثلة من الوليدة قبل مرنا من قبل نقطة دقيقة وقت 5 (الشكل رقم 2، 1 و 4 حارات ). بعد إضافة α-أمانيتين لمنع مزيد من النسخ، والربط وسيطة ومنتجات تقسم المتراكمة على مر الزمن مع حركية مماثلة في كلا النوعين من مقتطفات (الشكل 2، والممرات 2، 3، 5، 6). هذه النتائج تدل على أن ممثل كفاءة للانقلاب بقيادة RNAP الثاني النسخ / الربط نظام مشابه في مقتطفات النووية السائبة وعلى النطاق الصغير.

للتدليل على فائدة من طريقة استخراج الصغيرة الحجم، وأعدت مقتطفات من خلايا هيلا تعامل مع المانع الربط، E7107، أو مجمع سيطرة سلبية pladienolide F ^6،7 ومن ثم تم تنفيذ RNAP الديناميكي الثاني النسخ / الربط فحص خارج. كما هو مبين في الشكل (3)، النسخ الثاني RNAP حدث بكفاءة في مقتطفات من استعداد كلا F Pladienolide وE7107 الخلايا المعالجة (10 نقاط الوقت دقيقة). في المقابل، وقعت الربط عادة في استخراج الخلايا المحضرة من طراز F-المعالجة Pladienolide لكن ألغي في الخلايا E7107 المعالجة (الشكل 3، نقطة 20-60 مرة دقيقة). هذه البيانات تقدم دليلا على مفهوم لاستخدام مقتطفات صغيرة الحجم النووي لمعاملة خاصة من الخلايا في نطاق ضيق.

JPG "/>
الشكل 1. التخطيطي من البروتوكول استخراج الصغيرة. الخطوة P1. وتزرع الخلايا كما monolayers، تحصد من لوحات باستخدام رافعة للخلية ومنتفخة من خلال إضافة العازلة منخفض التوتر. الخطوة P2. وهي lysed الخلايا باستخدام الخالط Dounce وطرد لتكوير نوى. الخطوة P3. يتم فصل النوى من السيتوبلازم والخضوع لاستخراج الملح. الخطوة P4. ويتركز استخراج النووية ومدال. الخطوة P5. ويتم الحصول على النتائج التي تظهر أن مقتطفات النووية وظيفية (انظر الشكل 2 لمزيد من التفاصيل).

الشكل 2. على نطاق صغير مقتطفات النووية القوية في فحص RNAP الديناميكي النسخ / الربط الثاني. A. التخطيطي لقالب الحمض النووي CMV، المنطقة الحرة برأس المستخدمة لالديناميكي RNAP الثاني النسخ / الربط. يشار إلى المروج CMV وأحجام إلى exons والإنترون. B. مقارنة RNAP الديناميكيثانيا النسخ / الربط فحص باستخدام مستخلص النووية السائبة أو صغيرة الحجم استخراج النووية. أضيف α-أمانيتين بعد 5 دقائق ولم يسمح النسخ والربط للتحدث لمدة 30 و 60 دقيقة. تم استخراج الحمض النووي الريبي ومجزأة على هلام 5٪ بولكرلميد تبديل طبيعة والكشف عنها بواسطة phosphoimager. يشار إلى أن وسيطة الربط والمنتجات. والذاتية U6 snRNA والحمض الريبي النووي النقال الموجودة في استخراج والتي هي مبينة ³² ف وصفت خلال حضانة. انظر ³ للبروتوكول مفصلة عن النظام الديناميكي RNAP النسخ / الربط الثاني.

الشكل 3. على نطاق صغير مقتطفات النووية المعدة من خلايا هيلا تعامل مع المخدرات E7107 الربط المانع معيبة في الربط. وعولج خلايا مع Pladienolide ميكرومتر 3 F أو كما E7107ووصف ⁽⁶⁾ وبعد ذلك تستخدم لإعداد صغار مقتطفات النووية. وأجريت الدورة مهلة باستخدام نفس النسخ / الربط الفحص كما في الشكل رقم 2. يشار إلى أن وسيطة الربط والمنتجات، وU6 snRNA والحمض الريبي النووي النقال.

Discussion

قمنا بتأسيس طريقة سريعة وقابلة للتكرار لإعداد مقتطفات النووية من كميات صغيرة من خلايا هيلا كما نمت monolayers. أثبتنا أن هذه المقتطفات هي قوية من خلال إظهار أن حركية وكفاءة فحوصات RNAP النسخ / الربط الثاني تتشابه في مقتطفات النووية الصغيرة الحجم وكبيرة الحجم. وأظهرت لنا فائدة مقتطفات من خلال إظهار أن أعدت مقتطفات من الخلايا تعامل مع الربط المخدرات المانع نشطة للنسخ ولكن عيب في الربط.

أنشئت لدينا وسيلة لإعداد صغار مقتطفات النووية من خلال الجمع بين وتحسين أساليب المحددة سابقا لصنع مقتطفات من خلايا هيلا نمت في التعليق على نطاق واسع في ^1،8 وطريقة لصغار إعداد مقتطفات ^9. أنشأنا لدينا بروتوكول لأن السابقة على نطاق صغير مقتطفات لم تكن وظيفية لبعض المقايسات، مثل النسخ إلى جانب / ليرة سوريةlicing فحص. فارق مهم بين البروتوكول على نطاق صغير السابقة ⁽⁹⁾ ولنا هو أننا أمثل الظروف لlysing الخلايا باستخدام dounce صغيرة في حين أن بروتوكول السابقة هي lysed الخلايا من خلال دفعهم من خلال إبرة صغيرة عيار ^9. نتائج إبرة تحلل في فقاعات، وهو ما قد يفسر السبب في أن مستخلصات كانت نشطة و / أو صعوبة في إعادة إنتاج لبعض المقايسات. وأضاف نحن أيضا خطوة تركيز على بروتوكول لدينا. هذه الخطوة يزيد من نشاط المقتطفات، والتي هي حساسة للغاية للتركيز، ويحد أيضا من التباين بين المقتطفات التي هي ملازمة لصغار الاستعدادات. أخيرا، ويتم بشكل روتيني إعداد للخروج مع ثلاثة فقط 150 ملم لوحات من الخلايا أحادي الطبقة، من دون أي تأثير كبير على النشاط مقارنة مقتطفات السائبة. وبالتالي، فإن الإجراء غير قابلة بسهولة لصغار الاستعدادات التي تتطلب الكواشف مكلفة أو محدودية توفر الخلية. على سبيل المثال، قمنا بإعداد SMAتستخدم ليرة لبنانية على نطاق مقتطفات من الخلايا ورني ضربة قاضية من خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن المريض (CLL)، وهذه مقتطفات لفحوصات وظيفية و / أو البيوكيميائية (EGF، JLH، وTY RR، غير منشورة). لقد وجدنا أن لا تقل قيمة عن مقتطفات رني تليها فحوصات البيوكيميائية محددة، مثل immunopreciptations، الغرب، وتلطيخ الفضة. بعد تأسيس فعالية هدمت بروتين معين، ويمكن إجراء دراسة أكثر تفصيلا من خلال جعل ضربة قاضية مستقر خلية الخط، والتي يمكن استخدامها لإعداد مقتطفات إضافية بتكلفة أقل. مطياف الكتلة من البروتينات الموجودة في immunoprecipitates تم الحصول عليها من هذه الخطوط الخلية ضربة قاضية ستكون أيضا مفيدة لتطبيق هذه الطريقة. بالإضافة إلى فحص النسخ / الربط إلى جانب ذلك كنا كمثال لوصف بروتوكول لدينا هنا، ينبغي على مقتطفات صغيرة الحجم قابلة للتطبيق بشكل عام إلى العديد من المقايسات الفنية والكيمياء الحيوية، مثل تلك المستخدمة في الحادي ومختلفالعائد على السهم في التعبير الجيني (مثل وضع حد أقصى، الربط، النسخ، وتجهيز تذييل بعديد الأدينيلات microRNA،). ويمكن أيضا أن البروتوكول يمكن تكييفها لأنواع الخلايا المريضة التي يمكن الحصول عليها إما في تعليق (مثل خلايا CLL) أو تزرع في ثقافة (مثل الخلايا الليفية المريض). أخيرا، يجب على جزء السيتوبلازمية التي تم الحصول عليها أثناء عملية مفيدة لكلا المقايسات الفنية والبيوكيميائية التي تتطلب السيتوبلازم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	الاسم الكامل للكاشف	شركة	فهرس العدد
HEPES	4 - (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حامض	سيغما	H3375-500G
MgCl 2 0.6 H 2 O	المغنيسيوم كلوريد هيدرات	سيغما	M2670-500G
بوكل	كلوريد البوتاسيوم	الصياد	P335-212
PMSF	Phenylmethanesulfonyl فلوريد	سيغما	P7626-100G
DTT	Dithiothreitol	الأمريكي Bioanalytical	AB00490-5G
EDTA	Ethylenediaminetetraacetate، الصوديوم، ثنائي الهيدرات	الأمريكي Bioanalytical	AB00500-01000
الغليسيرول		النائب Biomedicals	800689
DMEM	Dulbecco والوسيلة الأساسية الدنيا	إينفيتروجن	11995-073
FBS	الأبقار مصل الجنين	Gibco	16140
البنسلين / الستربتومايسين عقار		Gibco	15070
برنامج تلفزيوني	التخزين المؤقت فوسفات المالحة	Cellgro	21-040-CV
التريبان البقع الزرقاء بنسبة 0.4٪		Gibco	15250
خلية الرافعون		كورنينج	29442-200
150mm لوحات		VWR	353025
الموسعة Micropipette تلميح		Denville	P1126
الخالط Dounce، 1ml، مع ضيق مدقة		ويتون	357538
Slidealyzers، MWCO 10kDa		ThermoScientific	69572
مصغرة Centricons، MWCO 3kDa		ميليبور (Amicon)	UFC500396

حل	نهائي	الأوراق المالية	الاستغناء
ناقص التوتر	10 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9	1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9	5 مل
	1.5 ملم MgCl 2	1M MgCl 2	750 ميكرولتر
	10 ملي بوكل	3M بوكل	1.67 مل
	0.2 ملم PMSF	200 ملي مول PMSF	500 ميكرولتر
	0.5 مم DTT	2M DTT	125 ميكرولتر
			جلب ما يصل الى 500 مل مع الماء
منخفض الملح	20 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9	1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9	2 مل
	1.5 ملم MgCl 2	1M MgCl 2	150 ميكرولتر
	20 ملي بوكل	3M بوكل	667 ميكرولتر
& ملاحظة:س؛	0.2 ملم EDTA	0.5M EDTA	40 ميكرولتر
	25٪ الجلسرين	الغليسيرول	25 مل
	0.2 ملم PMSF	200 ملي مول PMSF	100 ميكرولتر
	0.5 مم DTT	2M DTT	25 ميكرولتر
			جلب ما يصل الى 100 ​​مل مع الماء
ارتفاع ملح	20 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9	1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9	2 مل
	1.5 ملم MgCl 2	1M MgCl 2	150 ميكرولتر
	1.4M بوكل	3M بوكل	48 مل
	0.2 ملم EDTA	0.5M EDTA	40 ميكرولتر
	25٪ الجلسرين	الغليسيرول	25 مل
	0.2 ملم PMSF	200 ملي مول PMSF	100 ميكرولتر
	0.5 مم DTT	2M DTT	25 ميكرولتر
			جلب ما يصل الى 100 ​​مل مع الماء
غسيل الكلى	20 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9	1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9	10 مل
	100 ملي مول بوكل	3M بوكل	16.625 مل
	0.2 ملم EDTA	0.5M EDTA	200 ميكرولتر
	20٪ الجلسرين	الغليسيرول	100 مل
	0.2 ملم PMSF	200 ملي مول PMSF	500 ميكرولتر
	0.5 مم DTT	2M DTT	125 ميكرولتر
			جلب ما يصل الى 500 مل مع الماء