A الفحص انجذاب غلفاني لتحليل حركية العصبية السلائف الهجرة خلية في الحقل الحالي مباشرة التطبيقية خارجيا الكهربائية

Summary

في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية بناء الغرف المخصصة التي تسمح بتطبيق حقل كهربائي مباشر الحالية لتمكين الوقت الفاصل بين التصوير من الدماغ العصبية مشتقة الكبار إزفاء الخلية تمهيدا خلال انجذاب غلفاني.

Abstract

وقد أدى اكتشاف الجذعية العصبية والخلايا الاصلية (وهو ما يسمى خلايا السلائف جماعي العصبية) (الشخصيات) في دماغ الثدييات الكبار لمجموعة من البحوث التي تهدف إلى الاستفادة من خصائص متعددة القدرات والتكاثري من هذه الخلايا لتطوير استراتيجيات neuroregenerative. A خطوة حاسمة لنجاح هذه الاستراتيجيات هو تعبئة الشخصيات نحو موقع الآفة أو بعد زرع الخارجية لتعزيز الاستجابة للالسلائف الذاتية التي تم العثور عليها في المنطقة المحيطة بالبطين من الجهاز العصبي المركزي. وفقا لذلك، من الضروري لفهم الآليات التي تشجع، توجيه، وتعزيز الهجرة NPC. عملنا يركز على الاستفادة من حقول التيار الكهربائي المباشر (dcEFs) لتعزيز والهجرة مباشرة NPC - وهي ظاهرة تعرف باسم انجذاب غلفاني. الذاتية المجالات الكهربائية الفيزيولوجية يعمل واشارات حاسمة للهجرة الخلايا خلال التطور الطبيعي وإصلاح الجرح. تعطيل الدوائيةعبر أنبوب العصبي في الأجنة المحتملة قنفذ البحر يسبب تشوهات في النمو الحاد ^1. في سياق التئام الجروح، ويرتبط بشكل مباشر على معدل إصلاح القرنية الجرحى مع حجم إمكانيات الجرح الظهارية الذي ينشأ بعد الإصابة، كما يتضح من تعزيز الدوائية أو تعطيل هذا dcEF ^2-3. لقد أثبتنا أن اللجان التحضيرية الوطنية تحت البطانة العصبية الكبار الخضوع الهجرة السريع وإخراج المهبطي في المختبر عند تعرضها إلى dcEF يطبق خارجيا. في هذا البروتوكول وصفنا تقنيات المختبر لإنشاء مقايسة انجذاب غلفاني بسيطة وفعالة لتسوية عالية، على المدى الطويل مراقبة موجهة الخلية إزفاء الجسم (الهجرة) على مستوى وحيدة الخلية. وهذا الاختبار تكون مناسبة للتحقيق في الآليات التي تنظم تنبيغ dcEF في الحركة الخلوية من خلال استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب، RNA قصيرة التدخل، أو منبهات مستقبلات محددة / الخصوم.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات من جامعة تورونتو لحيوانات جنة رعاية فقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (البروتوكول رقم 20009387). يجب أن يتم تنفيذ الطرق التالية باستخدام أدوات معقمة والتقنيات، في الصفحي هود تدفق حيثما ينطبق ذلك.

في النص أدناه بروتوكول، فإن عبارة "EFH-SFM" يشير إلى وسائل الإعلام الحرة تستكمل مع مصل عامل نمو البشرة، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية والهيبارين. يستخدم EFH-SFM عند التحقيق في انجذاب غلفاني من الشخصيات غير متمايزة لأن هذه الشخصيات mitogens الحفاظ على دولتهم في ⁴ غير متمايزة. عند التحقيق في انجذاب غلفاني من الشخصيات التي يسببها على التمايز إلى أنواع الخلايا الناضجة، "FBS-SFM" يشير إلى وسائل الإعلام الحرة المصل تستكمل مع مصل بقري جنيني 1٪. FBS يعزز تمايز الشخصيات في الظواهر العصبية الناضجة ^5.

1. العزلة وثقافة العصبية السلائف (غيرهو مبين في الفيديو)

1. تخدير ماوس CD1 (6-8 أسابيع من العمر) مع isofluorane والتضحية عبر خلع عنق الرحم.
2. اخماد الرأس في الايثانول 70٪ وقطع رأس الحيوان مع مقص تشريح حادة.
3. في حين الضغط على الرأس مع ملقط جراحي، وإزالة الجلد على السطح الظهري لفضح الجمجمة.
4. وباستخدام مشرط لا. 11 شفرة، يسجل الجمجمة في الجيب الجبهي على طول محور الناصف الوحشي، وكذلك على طول الدرز السهمي في الاتجاه rostrocaudal.
5. قشر العظام الجدارية بعيدا عن الرأس مع عدم وجود. 7 ملقط المنحني، مع الحرص على عدم اختراق أنسجة المخ.
6. إدراج ملعقة رقيقة تحت الدماغ بدءا من تحت المخيخ والتقدم نحو المصابيح حاسة الشم. في حين عقد الجمجمة في مكان مع ملقط، وسحب بلطف الدماغ من الجمجمة ووضع على الفور في الجليد الباردة السائل النخاعي الاصطناعي (انظر صفات أدناه).
7. تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام العقيمةقطع مقص وملقط تشريح الدماغ إلى النصف على طول خط الوسط. تدوير كل نصف الكرة بحيث الإنسي (قطع) عن سطح البحر وتواجه صعودا.
8. تحديد نصف الكرة، ومع السطح الإنسي التي تواجه التصاعدي، حدد موقع splenium من الجسم الثفني (المنطقة الخلفية من الجسم الثفني).
9. إجراء شق من سطح القشرة إلى splenium من الجسم الثفني على طول محور ظهري بطني.
10. قشر القشرة قطعي نحو البصلة الشمية لفضح جدران الإنسي والجانبية للبطين الوحشي.
11. تدوير نصف الكرة بحيث يواجه السطح الظهري إلى أعلى، واستخدام microscissors المنحني لقطع الجدران وجمع يتعرض الإنسي والجانبية، والتي تحتوي على منطقة حول البطينات الدماغية حيث يقيم الشخصيات ^6.
12. كرر الخطوات من 1،8-1،11 لنصف الكرة الأرضية الأخرى.
13. ماصة الأنسجة المعزولة إلى 7 مل من محلول التربسين (انظر صفة أدناه) في أنبوب سم مكعب 15، ووضع أنبوب على الروك في C ° 37حاضنة لمدة 25 دقيقة.
14. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، نضح طاف، و resuspend الأنسجة في 2 مل من محلول التربسين المانع (انظر صفة أدناه).
15. يسحن بلطف الأنسجة مع صغيرة بئر مرات باستور 30-50 ماصة بعناية لتجنب فقاعات الهواء.
16. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، نضح طاف، و resuspend في 1-2 مل من SFM (انظر صفة أدناه) بواسطة الطحن وبيليه 3-5 مرات.
17. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، نضح طاف و resuspend في 1 مل من SFM + EFH.
18. عد كثافة الخلية يعيش مع وhaemocytometer وحة الخلايا في قارورة T25 الثقافة في مناطق ذات كثافة من 10 خلية لكل ميكرولتر في SFM + EFH.
19. السماح للثقافة أن تنمو دون عائق لمدة 7 أيام لانتاج التعويم الحر neurospheres الابتدائية تتألف من الشخصيات.

2. انجذاب غلفاني غرفة التحضير

1. المكان 3 مربع الزجاج لا. تغطية زلات 1 (22 × 22 × 0،17 مم) طNA زجاجة من حمض الهيدروكلوريك 6N بين عشية وضحاها.
2. في اليوم التالي، استخدم الماس طرف زجاج لقطع لشرائح 6 قطع مستطيلة (22 × 5 × 0،17 مم) من الزجاج من أي مربع. تغطية زلات 1.
3. نقل زلات حمض غسلها مربع ومستطيل زلات إلى الصفحي هود التدفق. غسل شرائح مستطيلة ومربعة الأولى مع الايثانول 70٪، ثم بالماء ثقافة الجودة الأنسجة تعقيمها، والسماح ليجف على كيم مسح (على العقم وأضاف، قد يسمح الزجاج لالهواء الجاف).
4. تطبيق الشحوم فراغ في محيط سطح واحد من الشرائح الزجاجية مربع، وختم لهم قاعدة 60 مم أطباق بتري بلاستيكية.
5. تطبيق الشحوم فراغ على طول محور واحد طويل سطح الزجاج شرائط مستطيلة، وختم لهم حواف الآخر من الشرائح الزجاجية مربع (بحيث تكون موازية لبعضها البعض) من أجل إنشاء حوض المركزية.
6. UV-تعقيم غرف على الأقل 15 دقيقة في الصفحي هود التدفق.
7. ماصة 250-300 ميكرولتر من بولي-L-lysiشمال شرق على الحوض الصغير للدوائر المركزية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
8. ما يقرب من 15 دقيقة قبل نهاية فترة الحضانة، وإعداد الحل Matrigel (انظر صفة أدناه).
9. نضح في بولي-L-يسين، وغسل أحواض وسط مع 1 مل من الماء تعقيمها، وماصة 250-300 ميكرولتر من حل لMatrigel على أحواض المركزية.
10. احتضان الدوائر في C ° 37 لمدة 1 ساعة.
11. نضح الحل Matrigel وغسل بلطف مع أحواض المركزي 1-2 مل من SFM.
12. ماصة 100 ميكرولتر من EFH-SFM أو FBS-SFM على أحواض للوسط ونقل الدوائر انجذاب غلفاني على خشبة المسرح المجهر من العد.
13. ماصة مل 3-4 من الثقافة التي تحتوي على neurosphere في طبق بتري 60 مم ونقل طبق بيتري إلى مرحلة المجهر العد.
14. إلى هدف عرضها 5X، استخدم ماصة نقل P10 5-8 neurospheres كله (ما يصل إلى أربعة في وقت واحد) على الحوض الصغير وسط كل انجذاب غلفانيغرفة دون الانفصال لهم، ونشر بعناية neurospheres حول الحوض الصغير دون تعطيل وسط الركيزة Matrigel.
15. إضافة ميكرولتر من 150-200 إضافية EFH-SFM أو FBS-SFM على وأحواض المركزية.
16. نقل الدوائر انجذاب غلفاني ° C إلى 37، 5٪ CO _2، حاضنة مرطب 100٪ لل17-20 ساعة (إذا تحليل الشخصيات غير متمايزة) للسماح للneurospheres على الانضمام إلى الركيزة Matrigel وفصل واحد في الخلايا كما هو موضح في الشكل (1) . إذا تحليل الشخصيات المتباينة، ينبغي أن تمتد فترة الحضانة إلى 69-72 ساعة للسماح للتمايز الخلايا.

3. تعيش خلية الوقت الفاصل بين التصوير

1. السماح للخلية الحية التصوير نظام للتوازن في 37 ° C، 5٪ CO ₂ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل الشروع في تسجيل الوقت الفاصل بين.
2. قطع قطعتين 12 سم من 1 مم سلك فضي، لفائف لهم من نهاية واحدة، ووضعها في كلوروكس بليتش لمدة 20 دقيقة لتشكيل جي / أجكل الأقطاب الكهربائية.
3. نقل الدوائر انجذاب غلفاني على خشبة المسرح المجهر من العد وتحديد أي غرفة سيتم استخدامها لخلايا الحية التصوير تحليل الهجرة على أساس المعايير التالية: ط) ينبغي أن يكون تقريبا neurospheres فصلها تماما في الخلايا واحد والثاني) الخلايا ينبغي أن يتمتع الأشكال التضاريسية جولة مع قليل إلى عدم العمليات تمتد من أجسام الخلايا.
4. نقل غرفة انجذاب غلفاني المحددة في الصفحي هود تدفق، جنبا إلى جنب مع أي مربع منفصلة. 1 زلة غطاء الزجاج والشحوم فراغ.
5. غسل غطاء ينزلق الأولى مع الايثانول 70٪، ثم تعقيمها بالماء، وتطبيق شريط من الشحوم فراغ على اثنين من حواف متوازية من الانزلاق الغطاء.
6. نضح وسائل الإعلام الثقافة من الحوض الصغير المركزية للغرفة، ثم وضع غطاء بسرعة الانزلاق (الشحوم من جانب أسفل) على هذه الدائرة أن بقية شرائح الشحوم على اتجاهين متوازيين شرائح مستطيلة من الزجاج، على نحو فعال خلق سقفإلى الدائرة.
7. ماصة 100 ميكرولتر من جديد EFH-SFM أو FBS-SFM في الحوض الصغير المركزية عن طريق عمل شعري.
8. استخدام الشحوم فراغ لخلق حدود لحمامات السباحة وسائل الإعلام الثقافة على كل نهاية الحوض الصغير المركزية، كما هو مبين في الشكل 2.
9. قطع قطعتين 15 سم من أنابيب PVC، واستخدام حقنة سم مكعب 10 مع إبرة قياس 18 إلى حقن بعناية الاغاروز حل في أنابيب، وضمان تشكيل فقاعات لا في أنابيب، والسماح للهلام لترسيخ لمدة 5 دقائق.
10. نقل غرفة انجذاب غلفاني لنظام الخلية الحية التصوير، جنبا إلى جنب مع أنابيب هلام الاغاروز، جي / أقطاب أجكل، وزوج من 60 مم فارغة أطباق بتري التي سيتم استخدامها وثقافة الإعلام الخزانات وسوف تحتوي على جي / أقطاب أجكل. السماح للغرفة انجذاب غلفاني للراحة في 37 ° C، 5٪ CO ₂ لمدة 20-30 دقيقة البيئة.
11. خلال هذا الوقت، وإعداد الأغطية من الأطباق الفارغة وبيتري 2 غطاء الطبق غرفة انجذاب غلفاني في بتري بواسطة حفر ثقوبلهم في دريميل اداة أو ما شابه ذلك كما هو موضح في الشكل 3.
12. ماصة 1-1،5 مل من EFH-SFM أو FBS-SFM على جانبي الحوض الصغير المركزية، و 7-8 مل من SFM في كل طبق بتري فارغة. طبق بتري مكان واحد على كل جانب من الحوض الصغير غرفة انجذاب غلفاني المركزي ومكان واحد جي / أجكل الكهربائي في كل طبق. جسر الفجوة بين غرفة انجذاب غلفاني وأطباق بتري لإنشاء الاستمرارية الكهربائية مع الجسور هلام الاغاروز، كما هو مبين في الشكل 4.
13. توصيل الأقطاب الكهربائية جي / أجكل إلى مصدر طاقة خارجي، مع مقياس التيار الكهربائي في سلسلة لقياس التيار الكهربائي، وتشغيل التيار الكهربائي. استخدام الفولتميتر لقياس قوة الحقل الكهربائي مباشرة عبر الحوض الصغير المركزية، وضبط إخراج التيار الكهربائي حتى يتم تحقيق المطلوب شدة المجال الكهربائي (للفحوصات التي أجريت في هذا المختبر الاستفادة من قوة dcEF من 250 بالسيارات / ملم مع التيار الكهربائي بين 1 و 1.5 مللي أمبير).
14. املبادراتالشركة المصرية للاتصالات وحدة مرور الزمن على نظام الخلية الحية التصوير، والسماح للتجربة لخوض المبلغ المطلوب من الوقت. بعد الانتهاء من الفحص، وتحديد الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ للتحليل المناعية القياسية.

النتائج

تحليل يكشف عن أن الحركية في وجود dcEF بالسيارات / 250 مم، عرض الشخصيات غير متمايزة انجذاب غلفاني الموجهة للغاية وسريعة نحو القطب السالب (الشكل 5A، الفيلم 1). في حالة عدم وجود dcEF، لوحظ حركة عشوائية من الخلايا (الشكل 5B، فيلم 2). في هذه القوة الميدانية،> 98٪ من...

Discussion

وقد تم تكييف هذا البروتوكول من أساليب راسخة من الدراسات السابقة ^7-9. ويمكن بناء غرف Galvanotactic باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات المختلفة، بما في ذلك بناء كوب منفصلة بشكل جيد لاحتجاز بذر الخلية، أو باستخدام الليزر التذرية CO ₂ لمن الحوض الصغير الدقيق microfabrication...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم البند	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
			عزل الخلايا العصبية السلائف
2M كلوريد الصوديوم	سيجما	S5886	ز 11،688 المذاب في 100 مل O 2 درهم
1M بوكل	سيجما	P5405	7،456 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم
1M MgCl 2	سيجما	M2393	20،33 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم
155 مم 3 NaHCO	سيجما	S5761	1،302 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم
0.5M الجلوكوز	سيجما	G6152	9،01 ز حل في 100مل DH 2 O
108 مم CaCl 2	سيجما	C7902	1،59 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم
البنسلين الستربتوميسين	Gibco	15070
الأبقار البنكرياس التربسين	سيجما	T1005
الأغنام الخصيتين هيالورونيداز	سيجما	H6254
Kynurenic حمض	سيجما	K3375
مخاطاني البيض التربسين المانع	ورثينجتون	LS003086
DMEM	إينفيتروجن	12100046
F12	إينفيتروجن	21700075
30٪ جلوكوز	سيجما	G6152
7.5٪ NaHCO 3	سيجما	S5761
1M HEPES	سيجما	H3375	23،83 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم
الجلوتامين L-	Gibco	25030
EGF	إينفيتروجن	PMG8041	إعادة في 1 مل من مزيج الهرمونات وقسامة إلى 20 وحدة ميكرولتر.
FGF	إينفيتروجن	PHG0226	إعادة في 0.5 مل من مزيج الهرمونات وقسامة إلى 20 وحدة ميكرولتر.
الهيبارين	سيجما	H3149
APO-ترانسفيرين	R & D أنظمة	3188-AT	0.1 غ في حل DH مل 4 2 0
بوتريسين	سيجما	P7505	حل 9،61 ملغ في آبو-ترانسفيرين ذلكlution
الأنسولين	سيجما	I5500	حل 25 ملغ في 0.5 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1N وإضافة إلى 3.5 مل من DH 2 0
عنصر السيلينيوم	سيجما	S9133
البروجسترون	سيجما	P6149
أدوات تشريح القياسية	أدوات العلوم الجميلة
تشريح المجهر	زايس	STEMI 2000
			انجذاب غلفاني غرفة التحضير
مربع الشرائح الزجاجية غطاء	VWR	16004
6N حمض الهيدروكلوريك	VWR	BDH3204-1
ارتفاع الشحوم فراغ	داو كورنينج
60 مم أطباق بتري	فيشر العلمية	0875713A
بولي يسين-L-	سيجما	P4707
Matrigel	BD العلوم البيولوجية	354234	ذوبان الجليد وقسامة إلى 150 وحدة ميكرولتر
FBS	إينفيتروجن	10082139	استخدام فقط في حالة حمل تمايز NPC، وإلا استخدام وسائل الإعلام الثقافة SFM + EFH كما هو مبين أعلاه
عد المجهر	OLYMPUS	CKX41
			تعيش خلية الوقت الفاصل بين التصوير
الفضة الأسلاك	الفا Aesar	11434
عالى النقاء الاغاروز	إينفيتروجن	15510-027
الحرارة Inactivated FBS	سيجما	16140071
PVC أنابيب	فيشر العلمية	80000006	3/32 "ID X 5/32" OD
تبييض	كلوروكس
10 سم مكعب حقنة	BD	309604
18 إبرة قياس	BD	305195
DREMEL الحفر	DREMEL	نموذج 750
المجهر المقلوب غرفة مجهزة، مرطب المحتضنة	زايس	Axiovert-200M
			وصفات بند حجم 2M كلوريد الصوديوم 6،2 مل 1M بوكل 0.5 مل 1M MgCl 2 0،32 مل 155mM NaHCO 3 16،9 مل 1M الجلوكوز 1 مل 108 مم CaCl 2 0،09256 مل البنسلين الستربتوميسين 1 مل تعقيمها المياه 74 مل السائل النخاعي الاصطناعي بند حجم أو كتلة السائل النخاعي الاصطناعي 30 مل الأبقار البنكرياس التربسين 40 ملغ الأغنام الخصيتين هيالورونيداز 22،8 ملغ Kynurenic حمض 5 ملغ الحل التربسين بند حجم أو كتلة SFM 15 مل مخاطاني البيض التربسين المانع 10 ملغ التربسين المانع الحل بند حجم تعقيمها المياه 37 مل 10X DMEM/F12 10 مل 30٪ جلوكوز 2 مل 7.5٪ NaHCO 3 1.5 مل 1M HEPES 0.5 مل ترانسفيرين، بوتريسين الحل 4 مل 25 ملغ حل الأنسولين 4 مل عنصر السيلينيوم 100 & مو؛ L البروجسترون 100 ميكرولتر ميكس هرمون (100 مل المجموع، المحل في -20 درجة مئوية) بند حجم تعقيمها المياه 37،5 مل 10X DMEM/F12 (3:1) 5 مل 30٪ جلوكوز 1 مل 7.5٪ NaHCO 3 0،75 مل 1M HEPES 0.25 مل هرمون مزيج 5 مل الجلوتامين L- 0.5 مل البنسلين الستربتوميسين 0.5 مل المصل وسائل الإعلام الحرة EFH-SFM: إضافة 10 ميكرولتر من EGF، 10 ميكرولتر من جمعية جيل المستقبل، و3.66 ميكرولتر من الهيبارين FBS-SFM: إضافة 0.5 مل FBS
بند	حجم
Matrigel	150 ميكرولتر
SFM	3،6 مل

بند	حجم أو كتلة
عالى النقاء الاغاروز	300 ملغ في DDH مل 10 2 0
SFM FBS المعطل الحرارة	8 مل 2 مل