بدء تصوير دبقي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; من خلال نافذة رقيقة الجمجمة ملمع وعززت القحف

Summary

من خلال الجمع بين ومصقول المقوى رقيقة الجمجمة (منافذ) الجمجمة وورم أرومي دبقي إطار حقن الخلايا (GBM)، يمكننا أن نلاحظ بدء دبقي والنمو من خلايا GBM حقن في دماغ فأر حي طوليا.

Abstract

دبقي هي واحدة من أكثر أشكال السرطان فتكا من الإنسان. العلاج الأكثر فعالية لدبقي جراحة حديثة تليها الاشعاع المعاملة يقدم المرضى فوائد متواضعة، حيث أن معظم المرضى لا البقاء على قيد الحياة أكثر من خمس سنوات بعد التشخيص بسبب الانتكاس ^1،2 دبقي. اكتشاف الخلايا الجذعية السرطانية في أورام الدماغ البشري يحمل وعدا عن وجود تأثير هائل على وضع استراتيجيات علاجية جديدة لدبقي ^3. وتعرف الخلايا الجذعية السرطانية بقدرتها على حد سواء في تقرير المصير، وتفرق لتجديد، ويعتقد أن تكون الخلايا السرطانية فقط في أن لديها القدرة على الشروع في أورام جديدة ^4. ويعتقد دبقي الانتكاس العلاج الإشعاعي التالي لتنشأ من مقاومة الخلايا الجذعية دبقي (GSCs) للعلاج ^5-10. في الجسم الحي، وترد GSCs للإقامة في محراب حول الوعاء وهذا أمر مهم للحفاظ على الخلايا الجذعية من خصائص شبيهة ^11-14 . المركزية إلى املنظماتzation من مكانة GSC هي خلايا بطانة الأوعية الدموية ^12. الأدلة الموجودة تشير إلى أن GSCs وتفاعلها مع خلايا بطانة الأوعية الدموية هي مهمة للتنمية الورم، وتحديد GSCs وتفاعلها مع الخلايا البطانية كأهداف العلاجية الهامة لدبقي. يتم تحديد وجود GSCs تجريبيا من قدرتها على بدء أورام جديدة على زرع مثلي ^15. ويتحقق هذا عادة عن طريق حقن عدد محدد من الخلايا المعزولة من الأورام GBM الإنسان في أدمغة الفئران التي تعاني من نقص المناعة الشديد، أو من الخلايا GBM الماوس في أدمغة الفئران مسانج مشترك المضيف. ثم يتم إجراء فحوصات لنمو الورم بعد الوقت الكافي للسماح GSCs بين خلايا GBM حقن تثير أسابيع الأورام عادة جديدة، أو عدة أشهر. وبالتالي، المقايسات القائمة لا تسمح دراسة العملية المرضية من المهم بدء الورم من GSCs واحدة في الجسم الحي. ونتيجة لذلك، من الضروري طnsights في أدوار معينة من GSCs وتفاعلها مع خلايا بطانة الأوعية الدموية في المراحل الأولى من بدء الورم غير متوفرة. رؤى مثل هذه العناصر الهامة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لدبقي، وسيكون لها آثار كبيرة على منع الانتكاس في المرضى الذين دبقي. هنا تكيفنا المنافذ الجمجمة إجراء إطار ¹⁶ و في الجسم الحي ثنائي الفوتون المجهري للسماح التصور من بدء الورم من الخلايا المحقونة GBM في دماغ فأر حي. سوف أسلوبنا تمهيد الطريق لمستقبل الجهود لتوضيح الآليات الرئيسية عصبي بين خلايا بطانية GSCs والأوعية الدموية أثناء بدء دبقي.

Protocol

1. بروتوكول

1. تخدير الماوس مع الكيتامين وزيلازين بجرعة الكيتامين ملغ 0.1 و 0.01 ملجم من زيلازين في 1 غرام من وزن الجسم. يستخدم كاربروفين (0.005 ملغ لكل 1 غرام من وزن الجسم) لتسكين ويدار قبل الجراحة.
2. جميع الأدوات الجراحية، بما في ذلك قمة الحفر الأسنان، وبخار تعقيم الأوتوكلاف في. إذا العمليات الجراحية هي الدفعة التي يتعين القيام بها، لا بد من نصائح من الأدوات الجراحية إعادة تعقيمها مع حبة تعقيم الزجاج (أدوات العلوم الجميلة FST 250) قبل كل عملية جراحية لاحقة.
3. مرة واحدة الماوس قد وصلت إلى الطائرة من التخدير الجراحي، المقررة من قبل عدم وجود استجابة لقرصة أخمص القدمين، يتم وضعها على وسادة من القطن التي يتم وضعها على وسادة ثم ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم من ~ 37 ° C. ويتم رصد عمق التخدير أثناء الجراحة في كثير من الأحيان.
4. تتم إزالة الفراء من رئيس الظهرية في منطقة الثلاثي تقريبا 3 مم ~ الذيلية إلى فتحتي الأنف وتمتد إلى نحو caudally مrvical فقرات. يتم تطبيق مرهم للعين للعيون لحمايتهم من الجفاف والاحمرار.
5. يتم وضع الماوس في recumbancy بطني وتطهير الجلد مع جراحية اليود، والإيثانول 70٪، ومسحات معقمة. تتم إزالة A الطول 0.8 * 1.0 من رفرف الجلد الذي يغطي الجانب الظهري الأمامي من عظام والجداري من الجمجمة باستخدام مقص غرامة.
6. يتم تطبيق مسكن موضعي، يدوكائين 0.5٪، محليا إلى السمحاق والأنسجة في محيط يتعرض للجرح. تتم إزالة السمحاق عن طريق كشط بلطف الجمجمة بشفرة مشرط، وهذا سوف يساعد الغراء CYANOACRYLATE التمسك العظام.
7. ويرد في المنطقة القشرية من الفائدة على الجمجمة مع علامة. يجب أن لا مجال الاهتمام يكون موجودا على خطوط خياطة الجمجمة، لتجنب الأضرار التي لحقت السفن الكبيرة الكامنة.
8. يتم تطبيق طبقة رقيقة من مادة لاصقة CYANOACRYLATE على هامش الجرح، لمنع تسرب السوائل من serosanguinous، والجمجمة إلا فيومجال الاهتمام.
9. ويستخدم ضوء تنشيط الاسمنت الأسنان في بروتوكول لدينا لاغلاق الجمجمة. قبل تطبيق الاسمنت الأسنان، يتم معاملة جميع الجمجمة يتعرض باستثناء المنطقة المخصصة لترقق مع الاشعال في وقت لاحق مع وكيل الرابطة من عدة ضوء تنشيط الاسمنت الأسنان. مرة واحدة يتم تجفيف كيل الرابطة، يتم تطبيق الاسمنت ضوء تنشيط الأسنان لتغطية الجمجمة. لتحقيق الاستقرار في الرأس من الفأرة لعملية جراحية لاحقة والتصوير، وجزءا لا يتجزأ من معقمة عرافة الجوز # 00-90 في الاسمنت الأسنان على مسافة من المنطقة المراد ضعيفة. استخدام ضوء تنشيط الاسمنت الأسنان يتيح لنا إعداد الجمجمة دون الحاجة إلى التسرع في إنهاء الإجراء بأكمله. بمجرد الانتهاء من إعداد الاسمنت الأسنان على الجمجمة، وخلوه من الاسمنت الأسنان مع الضوء المرئي.
10. بعد الشفاء من الاسمنت الأسنان، هي التي شنت حامل خوذة من الجهاز المجسم إلى عرافة الجوز على رأسه باستخدام الماوس المسمار # 00-90.
11. A الدكتورالمرجع درجة الحرارة داخل الغرفة، يتم تطبيق ملحي معقم بنسبة 0.9٪ إلى منطقة الجمجمة التي ضعفت. مع المعونة من stereomicroscope، يتم استخدام عالي السرعة الحفر الصغيرة لمنطقة دائرية رقيقة من الجمجمة (عادة ~ مم 4-5 في القطر) على المنطقة من الفائدة. يتم تنفيذ الحفر وتطبيق المالحة إلى منطقة حفر بشكل متقطع أثناء إجراء رقيق لتجنب الإصابة الحرارية للأنسجة الدماغية الكامنة. المالحة يمتص الحرارة ويساعد ايضا على تخفيف العظام.
12. الجمجمة الماوس تضم اثنين من طبقات رقيقة من العظم المضغوط، يقحم طبقة سميكة من العظم الإسفنجي. يتم إزالة الطبقة الخارجية من العظم المضغوط ومعظم العظم الإسفنجي باستخدام الحفر.
13. بعد إزالة الغالبية العظمى من العظم الإسفنجي، يمكن أن ينظر تجاويف المتبقية داخل العظم الإسفنجي تحت المجهر تشريح، مشيرا إلى أن الحفر تقترب من طبقة داخلية العظم المضغوط. في هذه المرحلة، يجب أن يكون لا يزال سمك الجمجمة أكثر من 50 ميكرومتر. يجب أن يكون رقيق الجمجمةواصلت بعناية للحصول على إعداد رقيقة جدا (~ 20 ميكرون) وسلس.
14. بمجرد تحقيق سمك المطلوب من الجمجمة (~ 20 ميكرون)، ومصقول لأول مرة الجمجمة باستخدام سوط سيليكون حسب الطلب مع معجون الماس (6-15 ميكرون) لحوالي 10 دقيقة. وتلميع الماس معجون يخدم غرضين. أولا، يخفف المزيد من الجمجمة دون ممارسة الضغط على الجمجمة ضعيفة، وبالتالي تجنب تلف عرضي لأنسجة المخ الأساسية. الثاني، أنها بمثابة خطوة أولية لتلميع الجمجمة ضعيفة قبل استخدام أكسيد القصدير غرامة الحبيبات لتلميع الجمجمة أخرى.
15. بعد تلميع الماس لصق، ومصقول الجمجمة ضعيفة مع أكسيد القصدير لحوالي 10 دقيقة. مرة واحدة الجمجمة هو مصقول، يتم مسح بعيدا أكسيد القصدير مع المالحة حتى الجمجمة ضعيفة يبدو نظيفة.
16. في هذه الخطوة، إذا كان إطار الجمجمة هي لاستخدامها في التصوير في الجسم الحي طولية، وجفت تنظيف منطقة الجمجمة رقيقة. قطرة صغيرة من الواضحيتم تطبيق الغراء CYANOACRYLATE لاغلاق النافذة في الجمجمة. يجب طبقة من الغراء CYANOACRYLATE بين الجمجمة ضعيفة وساترة لتكون رقيقة قدر الإمكان.
17. إذا كان الحقن هو المراد تنفيذها بعد إنشاء نافذة الموانئ الجمجمة، في هذه الخطوة، يتم استخدام إبرة حقنة 26-مقياس لخلق فتحة صغيرة على جانب واحد من الإطار رقيقة الجمجمة المصقول. ويستخدم هذا الانفتاح لحقن الخلايا GBM.
18. يتم سحبها ماصة زجاجية معقمة مع طرف فتح ما يقرب من 50 ميكرومتر في القطر باستخدام مجتذب ماصة. وسوف تستخدم هذه ماصة للحقن الخلايا GBM، وتحميلها على مياداة مجهرية. يتم تحميل ماصة بزاوية 30 درجة بحيث حقن الخلايا GBM الموقع سيكون بعيدا عن موقع التصوير النهائي. تتم إزالة غيض من ماصة تحت المجهر تشريح. تعليق خلية GBM هو الأمامية تحميلها في ماصة عن طريق الشفط باستخدام مضخة الحقنة.
19. مرة واحدة يتم تحميل ماصة حقن الخلايا مع الخليج للحاسبات الآلية، يتم نقل الماوس مرة أخرى تحت اله المجهر. وخفضت ماصة حقن نحو فتحة صغيرة في الجمجمة وإدراج نافذة أخيرا إلى الدماغ من خلال فتح باستخدام مياداة مجهرية. يتم حقن 1 ميكرولتر من تعليق خلية GBM في الدماغ 100-200 ميكرون من سطح الدماغ (السرعة: 0.1 ميكرولتر / دقيقة، المدة: 10 دقيقة).
20. تجفف الجمجمة، يتم تطبيق قطرة صغيرة من الغراء واضحة لCYANOACRYLATE الجمجمة المجفف، وانضمت قطعة من 3 ملم حجم رقم 1 ساترة لمنطقة الجمجمة رقيقة ومصقولة. وختم ساترة مسافة بين الأسنان المجاورة والأسمنت الغراء مع CYANOACRYLATE.
21. بعد الجراحة، ويتم حقن تحت الجلد الماوس مع 1 مل العقيمة المالحة الدافئة، وقدمت مع الحرارة تكميلية للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى تعافى تماما من التخدير.
22. التصوير، والفئران هي تخدير مع الكيتامين وزيلازين في جرعة الكيتامين ملغ 0.1 و 0.01 ملجم من زيلازين في 1 غرام من وزن الجسم. ويجمد الفئران باستخدام إطار المجسم مخصصتحت المجهر. إذا يتم تنفيذ المتكررة في التصوير المجراة على أساس يومي، وسوف isofluorane يكون خيارا أفضل، والفئران سوف تظهر علامات الاعتماد مع استخدام المتكررة من الكيتامين.

2. ممثل النتائج

A ناجحة الموانئ جراحة الجمجمة يسمح نافذة نافذة الجمجمة أن تبقى واضحة لأسابيع أو أشهر. ويبين الشكل 1 الأوعية الدموية تحت الجمجمة نافذة الموانئ وتصور باستخدام الضوء المرتدة. واستخدمت هذه الصور الأوعية الدموية ومعالم لتحديد مكان وجود مناطق الدماغ نفسه للتصوير المتكررة. لتصور كل من خلايا الأوعية الدموية وخلايا بطانة الأوعية الدموية GBM، عبرنا عن B6.Cg-TG (تك، لجنة المساواة العرقية) 1Ywa / J الماوس، التي تصف خلايا بطانة الأوعية الدموية مع 26Sor (ROSA) B6.Cg ^{GT-tm9 (CAG-tdTomato ) Hze} / J الماوس، والفئران ولدت مع خلايا بطانة الأوعية الدموية المسمى مع بروتين فلوري الأحمر tdTomato. نفذنا ثم إجراء حج القحف المنافذ على هذه ميلم، وحقن الخلايا GFP المسمى-GBM في أدمغتهم من خلال فتحة صغيرة على جانب نافذة في الجمجمة. ثم نفذنا في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير طوليا على الفئران المحقونة. تم تعيين الطول الموجي الإثارة الليزر بمبلغ 910 نانومتر، مما أدى إلى إثارة كلا GFP وtdTomato. تم تنفيذ اثنين من الفوتون التصوير على المجهر مبنية خصيصا الليزر المسح الضوئي ثنائي الفوتون مع اثنين من أجهزة إنذار لللفي وقت واحد الخضراء / الحمراء القدرة على الكشف مضان. الشكل 2 يظهر في الجسم الحي المثال من بدء دبقي من خلايا GBM حقن بالقرب من الأوعية الدموية. نافذة الموانئ الجمجمة أيضا اختيارا ممتازا للالمزمنة الوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي. ويبين الشكل 3 تلطيخ GFAP من أقسام القشرية من الماوس دون جراحة الموانئ والفأر 7 أيام بعد الجراحة والموانئ، وماوس 7 أيام بعد الجراحة والموانئ المالحة الحقن. ويتضح من الصور التي الماوس دون جراحة والفأر مع البرتغالTS جراحة لم يكن لديك دباق، في حين حقن المياه المالحة بعد، ويلاحظ دباق في أنسجة المخ من الفأرة، وذلك بسبب تغلغل ماصة وحقن محلول ملحي في الدماغ. هذه النتيجة تبين أن دباق لا تحدث تحت النافذة الموانئ الجمجمة، وتوفير التحقق من صحة المستقلة أن منفذي نافذة الجمجمة وصفها هنا لا يؤدي إلى دباق التي ترتبط عادة مع نافذة "الجمجمة مفتوحة" الجمجمة المزمن. ويبين الشكل 4 عالية الدقة تصوير العمود الفقري شجيري من الماوس نفس يوم الجراحة (يوم 0) وبعد 32 يوما من إنشاء نافذة منافذ (يوم 32)، مما يدل على أن الإطار الموانئ أيضا اختيارا ممتازا للذات الدقة العالية في التصوير المجراة.

الشكل 1. التصور من الأوعية الدموية تحت نافذة مصقول المقوى والجمجمة الجمجمة ضعيفة باستخدام الضوء المرتدة. تمثل أيام ر تم التقاط صور اعتبارا من اليوم لعملية جراحية على الفور بعد الانتهاء من حقن الخلايا GBM، وأنه عدد الأيام بعد الجراحة. شريط النطاق: 0.5 مم اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2. التصور من الخلايا والأوعية الدموية GBM حقن في الجسم الحي. واستخدمت كل من الفئران تحمل تك لجنة المساواة العرقية، وROSA26 CAG-tdTomato للحقن الخلايا GBM. وصفت الخلايا البطانية الوعائية مع tdTomato (الحمراء)، وخلايا وصفت GBM مع GFP (الخضراء). صور تم الحصول عليها يبدأ في 24 ساعة بعد حقن الخلايا GBM. أخذت ما مجموعه الحقول المجاورة من 10-12 النظر وتم تجميعها بالقرب من بعضها البعض، مع الخلايا التي تم تحديدها GBM حقن في وسط الميدان المجموع، لإنتاج الصور النهائية. أيام تمثل عدد أيام بعد الجراحة. مقياس بار: 100 ميكرومتر.أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" الهدف = "_blank"> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 3. دباق لا تحدث بعد الجراحة الموانئ النافذة في الجمجمة. العلوي لوحات: الفأر القسم الدماغ الاكليلية تحت التكبير أقل. ويلاحظ أي التنشيط GFAP في أنسجة المخ؛ ماوس دون أي عملية جراحية في الجمجمة نافذة: اللوحة اليمنى. ويلاحظ أي التنشيط GFAP في أنسجة المخ؛ ماوس مع نافذة الموانئ الجمجمة ولدت في الجانب الأيمن من الدماغ: لوحة الأوسط. اللوحة اليمنى: ماوس مع نافذة الموانئ الجمجمة وحقن المياه المالحة من الجانب من النافذة الموانئ. ويلاحظ GFAP تفعيل على جانب الإطار الموانئ، ولكن ليس على جانب أنسجة المخ سليمة. مقياس بار: 1 مم. اللوحة السفلى: أعلى سلطة صور أنسجة المخ في المناطق كما هو مبين في المربع الأبيض من الصور العلوية لوحة. مقياس بار: 100 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 4. التصوير عالية الدقة في العمود الفقري شجيري من خاصتك-1 YFPH الفئران. صور تم الحصول عليها في يوم الجراحة الموانئ، وبعد 32 يوما الموانئ الجراحة. من الواضح من الصور أن معظم أشواك موجودة على يوم 0 مرئية بوضوح 32 يوما بعد الجراحة الموانئ. مقياس بار: 2 ميكرومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المفتاح لنجاح الموانئ نافذة الجمجمة هو رقيق والتلميع. في حين لا يمكن أن يؤديها الأولية ترقق بسرعة، ينبغي توخي الحذر لضمان متجانسة ترقق في الجمجمة على مساحة واسعة. عادة نطبق طبقة رقيقة من المياه المالحة في الجمجمة، والجمجمة رقيقة ثم مرور واحد في وقت واحد، على ان يكون ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
DMEM/F12 (1:1) مع البيروفات الصوديوم	العلوم الحرارية Hyclone	SH3026101
B-27 الملحق المصل الحرة (50X)	إينفيتروجن	17504-044
GlutaMax-1 الملحق	إينفيتروجن	35050061
البنسلين الستربتوميسين الحل	العلوم الحرارية Hyclone	SV30010
Accutase انزيم متوسطة خلية مفرزة	eBiosciences	00-4555-56
T25-قوارير تنفيس غطاء أخضر	SARSTEDT	83.1810.502
70٪ كحول	JAX LAHS
10٪ بوفيدون حل موضعي	JAX LAHS
الكيتامين هيدروكلوريد	بتلر التموين صحة الحيوان	NDC # 11695-0550-1
زيلازين	Akorn، وشركة	NADA # 139-236
كاربروفين	JAX LAHS
مرهم العيون	Dechra منتجات البيطرية	17033-211-38
0.5٪ ليدوكائين هيدروكلوريد	REGENT، وشركة	NDC 0517-0625-25
CYANOACRYLATE الغراء	شركة هنكل	46551
معقم مسحات	فيشر العلمية	23-400-114
لصق الماس	القطعة التموين	BBE60
القصدير أكسيد	LORTONE، وشركة	591-038
بطانة بوند 2V	KURARAY الطبية وشركة	1921-KA
AP-X Clearfil	KURARAY الطبية وشركة	1721-KA
ملحي	JAX LAHS
تغطية الزجاج	وارنر الصكوك	64-0720
عرافة الجوز	أجزاء صغيرة، وشركة	HNX-0090-C
حقنة مضخة	Syringepump.com	NE-1000
ثنائي الفوتون التصوير نظام	المبنية حسب الطلب (أي نظام من شأنه التجاريةالعمل)