العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

Summary

يتم عزل نواة القلب عن طريق الترسيب وكثافة immunolabeled مع الأجسام المضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) لتحديد وفرز النوى cardiomyocyte بواسطة التدفق الخلوي.

Abstract

وقد تم تحديد نوى cardiomyocyte تحديا في المقاطع النسيجية حيث أن معظم استراتيجيات الاعتماد فقط على البروتينات علامة حشوية ^1. أحداث نادرة في myocytes القلب مثل انتشار وموت الخلايا المبرمج يحتاج الى تحديد دقيق للنواة خلية عضلية قلبية على تحليل تجديد الخلوية في التوازن وفي الحالات المرضية ^2. هنا، ونحن نقدم وسيلة لعزل نواة cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة بواسطة الترسيب كثافة والوسم المناعي مع أجسام مضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) واللاحقة الفرز التدفق الخلوي. هذه الاستراتيجية تسمح للتحليل إنتاجية عالية والعزلة مع الاستفادة من العمل بشكل جيد على قدم المساواة في الأنسجة الطازجة والمجمدة المواد الأرشيفية. هذا يجعل من الممكن لدراسة المواد التي تم جمعها بالفعل في biobanks. هذه التقنية قابلة للتطبيق واختبارها في مجموعة واسعة من الأنواع ومناسبة للتطبيقات المصب متعددة مثل الكربون 14 التي يرجع تاريخها ^3، خلية-CYCLE تحليل ^4، تصور من نظائرها ثيميدين (على سبيل المثال BrdU وإيدو) ^4، وتحليل transcriptome وجينية.

Protocol

1. العزلة من نوى القلب

1. أنابيب منبذة فائقة معطف (أنابيب الطرد المركزي بيكمان # 363664) مع 10 مل من 1٪ حل طلاء جيش صرب البوسنة / برنامج تلفزيوني. تتويج الأنابيب والسماح لهم بالتناوب لمدة 30 دقيقة في محور دوار أنبوب. إزالة حل طلاء، والسماح مطلوب من أجهزة الطرد المركزي أنابيب الهواء الجاف (أنبوب واحد في قلب فأر لتحليل قلوب ماوس واحدة، قلوب بالتناوب الماوس تصل إلى 5 أو 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع ويمكن (على سبيل المثال الإنسان) يمكن معالجتها في أنبوب واحد).
2. يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد. تشريح البطين الأيسر من القلب الماوس طازجة أو مجمدة مبكرة مع مشرط. علما، هو الأمثل لهذا البروتوكول قلب فأر ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع الفئران أو قلب الإنسان. بدلا من ذلك، استخدام ما يصل الى 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع.
3. تقليم عينة في مقصورات صغيرة مع مشرط.
4. نقل القطع الأنسجة في أنبوب 50 مل مليئة الصقر 15 مل من عازلة تحلل.
5. تجانسأنسجة القلب مع T-25 الخالط مسبار الترا Turrax (IKA) في 24000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية.
6. تمييع جناسة مع حجم مساو من عازلة تحلل إلى 30 مل.
7. استخدام douncer زجاج (40 مل) إلى مزيد من التجانس والأنسجة وخالية من النواة. أداء 8 السكتات الدماغية مع مدقة تخليص كبير.
8. تمرير نواة عزل الخام من خلال 100 ميكرون و 70 ميكرومتر شبكة النايلون مصفاة خلية دينار بحريني (العلوم البيولوجية)، على التوالي.
9. تدور باستمرار على عزل نواة الخام في جهاز للطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة.
10. إزالة طاف بعناية بواسطة أنابيب للقلب ومسح داخل أنبوب مع منشفة ورقية. يجب الحرص على عدم تعكير صفو كريات النوى.
11. حل نوى الخام عزل في 5ml من عازلة السكروز بواسطة pipetting الحل عدة مرات صعودا ونزولا. إضافة مزيد من 25 مل من عازلة السكروز إلى بيليه المنحل.
12. إضافة 10 مل من عازلة السكروز الطازجة إلى أنبوب منبذة فائقة المغلفة (انظر الخطوة 1.1).
13. تراكب بعناية المضافة 10 مل من عازلة السكروز مع بيليه نوى معلق في حل العازلة السكروز من الخطوة 1.9.
14. تحقيق التوازن في أنابيب الطرد المركزي قبل وضعها في الدوار مجانا JS13.1 يتأرجح ووضع الدوار في جهاز الطرد المركزي عالية السرعة (بيكمان أفانتي S-25).
15. تدور عينة النوى في 13000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
16. عندما تدور انتهت، وإزالة الأنابيب بعناية من الدوار وتجاهل طاف بواسطة أنابيب للقلب والقضاء على ما تبقى من الحطام داخل الأنابيب مع منشفة ورقية.
17. حل كريات النوى في 1ml من المخزن تخزين النوى (NSB زائد عازلة). ملاحظة: NSB زائد يحتوي على 1.5 ملي السبيرمين باعتبارها عامل استقرار الحمض النووي.
18. المضي قدما في الخطوة 2.1، المناعية من نوى cardiomyocyte.

2. المناعية عن التدفق الخلوي

1. إعداد سيطرة سلبية على المناعية. يأخذ قسامة من خارج ميكرولتر 20 من عينة نوى وDD 980 ميكرولتر من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى العازلة.
2. إضافة مادة مضادة للمحيط بالمريكز 1 الأضداد (أرنب المضادة للPCM-1، الأجسام المضادة أطلس) لعينة النوى في التخفيف من 1:500 إلى نوى immunolabel cardiomyocyte. إضافة الجسم المضاد isotype في تخفيف نفس الأجسام المضادة لمكافحة PCM-1 لسيطرة السلبية، التي أعدت في الخطوة 2.1.
3. احتضان سيطرة السلبية وأنبوب عينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
4. غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت).
5. إضافة المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية فلوري (FITC أو APC) إلى سيطرة السلبية وأنبوب عينة في التخفيف من 1:1000.
6. احتضان سيطرة السلبية وأنبوب العينة في درجة مئوية 4 ل 1 ح.
7. غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت).
8. المضي قدما في تحليل تدفق cytometric والفرز.

3. تدفق الخلوي

1. أنابيب معطف جمع النوى (فالكون 15 مل) مع حل جيش صرب البوسنة / PBS 1٪ قبل البدء في التدفق الخلوي الفرز كما هو موضح في الخطوة 1.1.
2. تصفية العينة ومراقبة سلبية من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 30 و تحميل لأول مرة سيطرة السلبية على تدفق عداد الكريات دينار بحريني (تدفق). تعريف البوابة الأولى والثانية لتحديد نوى و singlets (نواة واحدة)، استنادا إلى الأمام مبعثر (FSC)، إلى الأمام عرض نبض مبعثر (FS نبض العرض) والتشرذم الجانب (SSC) (الشكل 2a و ب). ويمكن إضافة الحمض النووي وصمة عار (DRAQ5 (1:500)) إلى نموذج يساعد على التعرف على سكان نوى في البداية.
3. تحميل عينة immunolabeled وتحديد بوابة ثالثة لعزل نواة cardiomyocyte (PCM-1-positve) من غير cardiomyocyte نوى (PCM-1-سلبية). بدء الفرز(الشكل 2C ود).

اختياري: من أجل تحليل محتوى الحمض النووي (الصيغة الصبغية) وإجراء تحليل دورة الخلية إضافة الحمض النووي المناسب وصمة عار على النوى (على سبيل المثال هويشت 33342 أو DRAQ5) (الشكل 2E).

4. بعد الفرز التدفق الخلوي، ووضع نواة على الجليد وإعادة تحليل لتحديد نقاء فرز (الشكل 3A و ب).
5. تدور باستمرار نوى فرزها في أنابيب جمع في 1500 XG في جهاز للطرد المركزي المبردة لمدة 15 دقيقة.
6. حل كريات النوى في منطقة عازلة متوافقة مع تطبيق المصب.

4. ممثل النتائج

ويمكن تقييم التشكل نوى وسلامتها من قبل بقع الحمض النووي وتصور بواسطة المجهر (الشكل 1). ويمكن تقييم نجاح PCM-1 وضع العلامات بواسطة المجهر epifluorescence والتدفق الخلوي (الشكل 1 والشكل 2C ود). PCM-1-positiهاء، وينبغي أن يفصل تماما من السكان سلبية عن بعضها البعض (الشكل 2C ود). في البطين الأيسر الفئران يجب أن حوالي 30٪ من جميع نوى أن تكون نواة cardiomyocyte (الشكل 2D). ويمكن فرز نقاء يتم تقييمها من خلال إعادة تحليل نوى فرزها (الشكل 3A و ب). وينبغي على حد سواء السكان نواة لديها نقاء فرز تتجاوز 95٪.

الشكل 1. PCM-1 يحدد الأنوية cardiomyocyte. ملطخة نوى القلب (أ) مع الأجسام المضادة للPCM-1 (ب) وNkx2.5 (ج) في قلب فأر بالغ. (د) وتحيط PCM-1-وصفت من قبل نواة السيتوبلازم cardiomyocyte (ميوسين الثقيلة سلسلة (MHC))، وأعرب عن عامل النسخ Nkx2.5، وتوثيق وتحديد دقيق للنوى cardiomyocyte بواسطة تلطيخ-1 PCM (الحانات نطاق 20 ميكرون و 10 ميكرومتر (د، أقحم)). (ه) العزلات نوى القلب تصور مع الحمض النووي وصمة DRAQ5. (و و ز) Cardiomyocوصفت نوى yte مع الأجسام المضادة ضد PCM-1 (مقياس شريط 10 ميكرون). علما، ونمط تلطيخ epinuclear من PCM-1 في نواة خلية عضلية في قسم الأنسجة ومعزولة في نوى (سهام).

الشكل 2. فرز تدفق cytometric من نوى cardiomyocyte. (أ) يتم تحديد نوى القلب بواسطة المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC). (ب) من بوابة ثانية يحدد نواة واحدة من قبل FSC ونبض FS عرض ^5. (ج، د) النابضة نيون يسمح للفصل من نوى cardiomyocyte (PCM-1-إيجابي)، وغير cardiomyocyte-(PCM-1-سلبية) نواة من أنسجة القلب. (ه) cardiomyocyte الفأر هي في معظمها (> 80٪) مضاعفا (2N)، فقط مجموعة فرعية صغيرة من رباعي الصيغة الصبغية (4N) ^6. علما، العضلية الإنسان تحتوي على تردد أعلى من نوى تعدد الصيغ الصبغية (> 2N) ^7،8.

الشكل 3. تحليل نقاء فرز النوى cardiomyocyte وغير cardiomyocyte. إعادة تحليل فرز النوى غير cardiomyocyte (أ) و cardiomyocyte (ب). على حد سواء من السكان وتظهر نقاء فرز تتجاوز 99٪.

Discussion

تحديد دقيق للنوى cardiomyocyte هو أمر حاسم لتحليل عمليات التجدد في عضلة القلب ^2،3. تقوم أساسا التقنيات التقليدية لعزل العضلية من الأنسجة جديدة على الهضم الأنزيمي من البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتنقية لاحق من الخلايا الخلالي عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة. ل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. تحلل الواق
اسم كاشف
0،32 م السكروز
تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8)
5 مم CaCl 2
5 خلات ملي المغنيسيوم
2.0 مم EDTA
0.5 مم EGTA
1 مم DTT

2. السكروز العازلة

اسم كاشف

2.1 متر السكروز

تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8)

5 خلات ملي المغنيسيوم

1 مم DTT

3. نوى عازلة للتخزين (جهاز الأمن القومي زائد)

اسم كاشف

0،44 م السكروز

تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 7.2)

70 ملم بوكل

10 ملي MgCl 2

1.5 ملم السبيرمين

الكواشف والمعدات	شركة
Isotype أرنب مفتش رقاقة الصف، # ab37415	Abcam
أرنب المضادة للPCM-1 الأضداد، # HPA023374	الأجسام المضادة أطلس
حمار ثانية. الأجسام المضادة، المضادة للأرنب ترتيب 488 فلور، # A-21206 ثانية أو ما يعادلها. فلوري الأضداد	الحياة تكنولوجيز
DRAQ5	Biostatus
مصافى الخلية 30 ميكرون، ميكرومتر 70 و 100 ميكرون	العلوم البيولوجية دينار بحريني
زجاج douncer (40 مل)، والمدقه "L"	VWR (ويتون للصناعات المحدودة)
T-25 الترا Turrax الخالط	IKA ألمانيا
أداة تفريق S25 N-18 G	IKA ألمانيا
بيكمان أفانتي جهاز طرد مركزي	بيكمان كولتر
صقر أنابيب 15 مل و 50 مل	VWR
أنابيب الطرد المركزي بيكمان # 363664	بيكمان كولتر
JS13.1 مجانا الدوار يتأرجح	بيكمان كولتر
تدفق عداد الكريات	بيكمان كولتر
أنبوب الدوار	VWR