JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقنية تسمى C omprehensive M icroarray P التنميط olymer (CoMPP) لتوصيف glycans جدار الخلية النباتية. هذا الأسلوب يجمع بين خصوصية الاجسام المضادة الموجهة إلى الحواتم غليكان محددة مع منصة ميكروأري مصغرة التحليلية السماح الفحص وقوع غليكان في مجموعة واسعة من السياقات البيولوجية.

Abstract

جدران الخلايا النباتية هي مصفوفات معقدة من glycans غير المتجانسة التي تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء وتطوير محطات وتوفير المواد الخام اللازمة للمجتمعات البشرية (مثل الخشب والورق والمنسوجات والصناعات الوقود الحيوي) 1،2. ومع ذلك، فهم الحيوي وظيفة هذه المكونات لا تزال صعبة.

glycans جدار الخلية هي كيميائيا ومتنوعة conformationally نظرا لتعقيد اللبنات الخاصة بهم، بقايا غليكوزيل. هذه الروابط على مواقع متعددة شكل وتختلف في هيكل حلقة، أو التكوين ايزوميريا المصاوغ الكربونيلي، وبالإضافة إلى ذلك، يتم استبدال مع مجموعة من غير السكر المخلفات. غليكان تكوين يختلف في الخلية مختلفة و / أو أنواع الأنسجة أو حتى الميادين الفرعية من خلية واحدة الجدار 3. وعلاوة على ذلك، يتم تعديل تكوينها أيضا خلال التنمية 1، أو استجابة لمنبهات البيئة 4.

في السابقسيس من 2،000 الجينات لها جدران الخلايا النباتية هي مصفوفات معقدة من glycans غير متجانسة تم توقع أن تشارك في الخلية الحيوي غليكان الجدار وتعديل في 5 ل arabidopsis. ومع ذلك، فقد كانت قليلة نسبيا من الجينات السكروز تتميز وظيفيا 4،5. عكس النهج علم الوراثة يصعب في كثير من الأحيان بسبب الجينات وأعرب تفاضلي، في كثير من الأحيان عند مستويات منخفضة، وبين أنواع الخلايا 6. أيضا، في كثير من الأحيان يتم إعاقة دراسات الجينات الطافرة من التكرار أو آليات تعويضية لضمان الحفاظ على وظيفة مناسبة جدار الخلية 7. وبالتالي هناك حاجة إلى نهج جديدة لتوصيف بسرعة مجموعة متنوعة من الهياكل غليكان وتيسير النهج الجينوميات الوظيفية للخلية فهم الحيوي الجدار والتعديل.

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) ظهرت 8،9 كأداة هامة لتحديد هيكل غليكان والتوزيع في النباتات. هذه الاعتراف صالحواتم خاص بالمعهد الحالي ضمن فئات رئيسية من glycans جدار الخلية النباتية، بما في ذلك pectins وxyloglucans، xylans، mannans، وarabinogalactans جلوكان. مؤخرا تم تمديد استخدامها لفحص تجارب واسعة النطاق لتحديد الوفرة النسبية للglycans في مجموعة واسعة من النباتات وأنواع الأنسجة 9،10،11 في وقت واحد.

هنا نقدم لفحص غليكان ميكروأري على أساس طريقة تسمى البوليمرات ميكروأري الشامل التنميط (CoMPP) (الشكلان 1 و 2) 10،11 تمكن عينات متعددة (100 ثانية) ليتم عرضه باستخدام منصة ميكروأري مصغرة مع كاشف انخفاض حجم العينة و. ويمكن للإشارات بقعة على ميكروأري كميا رسميا لإعطاء نصف الكمية بيانات عن حدوث حاتمة غليكان. هي مناسبة تماما لهذا النهج تعقب التغييرات في النظم البيولوجية غليكان المعقدة 12 و تقديم نظرة عامة شاملة لتكوين جدار الخلية وخاصة عندما قبل س المعرفةو هذا غير متوفر.

Protocol

1. مجموعة الأنسجة وإعداد

  1. جمع 100 ملغ الوزن الطازج من الأنسجة النباتية (ما لا يقل عن 10 ملغ الوزن الجاف) في ما لا يقل عن ثلاث نسخ لكل الأنسجة من الاهتمام. تصف الخطوات التالية إعداد المواد جدار الخلية من الأنسجة النباتية. في حالة الأنسجة التخزين، تتم إزالة إنزيمي للامم المتحدة المطلوبين النشا قبل الشروع في استخراج البوليمرات جدار الخلية كما هو موضح سابقا 13.
  2. التجانس العينات إلى مسحوق ناعم مع النيتروجين السائل باستخدام TissueLyser QIAGEN II، مع 24 مجموعات محول أنبوب 3 مم والتنغستن الخرز كربيد (30 هرتز، 2 × 30 ثانية). وبدلا من ذلك يتم معالجتها إذا سوى بعض العينات، يتم استخدام هاون ومدقة.
  3. نقل الخليط إلى 10 مل أنابيب البلاستيك مخروطي.
  4. إعداد المواد جدار الخلية غسل الخليط في 10 مل ايثانول ت / ت 80٪ في RT vortexing وبقوة لمدة 2 دقيقة.
  5. أجهزة الطرد المركزي العينات في 3500 XG وتجاهل طاف. تكرار الايثانول 70٪ يغسل ثلاث مرات على الأقل أو حتى طاف هو واضح، ولا سيما بالنسبة للأنسجة التي تحتوي على الكلوروفيل.
  6. إجراء غسيل النهائي مع الأسيتون 100٪ وترك الكريات التي تحتوي على مخلفات غير القابلة للذوبان الكحول (AIR) في الهواء الجاف بين عشية وضحاها.
  7. غربال عينات الهواء مع شبكة 0.4 2 مم لتحقيق غرامة، ومسحوق متجانس وإزالة أكبر، سيئة الجسيمات الأرض التي لا تزال في وقت ما في جناسة.
  8. تزن 10 ملغ في عينة AIR microtubes، كل واحد منها الزجاج مم 3 حبة لمساعدة اختلاط العينات.

2. استخراج Glycans جدار الخلية

  1. يتم استخراج البكتين، والبوليمرات المرتبطة البكتين من عينات عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من CDTA ميكرومتر 50 (الرقم الهيدروجيني 7.5) لكل عينة.
  2. دوامة الأنابيب لفترة وجيزة لضمان المذيب على اتصال مع مادة العينة ثم تخلط باستخدام TissueLyser لمدة 3 ساعة في 8 هرتز.
  3. أجهزة الطرد المركزي العينات في 12000 XG، بعناية صemove في supernatants وتخزينها في C. ° 4
  4. غسل الكريات في 1 مل من غير المتأينة الماء لتخفيف وإزالة أي المتبقية المذيبات، وأجهزة الطرد المركزي في دوامة ز X 13،000. كرر هذه الخطوة من دون إزعاج بيليه وإزالة جميع السائل من الأنابيب قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  5. يتم استخراج بالتسلسل عبر ربط glycans من بيليه جدار الخلية المتبقية مع 500 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 4M بنسبة 0.1٪ وزن / حجم NaBH4، وذلك باستخدام نفس الإجراء موضح في الخطوات 2،1 حتي 2،4 لاستخراج CDTA. يضاف NABH 4 إلى الحد من ألدهيد (أو كيتوني) المجموعة في نهاية الحد من السكريات إلى الكحول وبالتالي منع تقشير قاعدة من السكريات.
  6. بعد الطرد المركزي، تتم إزالة supernatants مرة أخرى وتخزينها في 4 درجات مئوية، وغسلها مرتين في الكريات غير المتأينة المياه قبل الشروع في استخراج المقبل.
  7. وكخطوة اختيارية، يتم استخراج البوليمرات المتبقية، مثل السليلوز مع 500 ميكرولتر cadoxen (31٪ V / V 1،2-diaminoethane مع CDO M 0.78) باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوات 2،1 حتي 2،4. وبدلا من ذلك، يمكن تحديد محتوى السليلوزية المطلقة في الكريات المتبقية باستخدام فحوصات الخليك / النيتريك (انظر المناقشة).

3. الطباعة [ميكروأرس]

  1. تحتوي على استخراج supernatants الطرد المركزي البوليمرات جدار الخلية في 13000 XG لإزالة أي الجسيمات.
  2. تحميل 50 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة البولي بروبلين 384 عيار مكروي جيدا باستخدام تخطيط المصممة مسبقا حسب الطلب حيث يتم ترتيب العينات وفقا لنوع الأنسجة ونوع الاستخراج.
  3. تمييع العينة خلية البوليمر الجدار في سلسلة × 0، 5 و 25 مسلسل التخفيف بالماء منزوع الأيونات.
  4. يتم تعيين المعلمات مثل ارتفاع دبوس، جمع ويسكن الوقت، والخطوات الغسيل على البرنامج السيطرة على microarrayer.
  5. يتم التحكم في الرطوبة للغرفة الطباعة تصل إلى 60٪ لمنع تبخر العينة.
  6. بدء مهمة الطباعة باستخدام LabNEXT softwaوإعادة البرنامج الذي يتوافق مع تخطيط ميكروأري.
  7. يستخدم الروبوت الدبابيس الموجودة في القناة الشعرية لطباعة الحلول من لوحة عينة على 20 × 20 سم غشاء النيتروسليلوز التي يتم تركيبها على لوحة مسطحة في الجهاز. كل بقعة على مجموعة يحتوي على 15 NL من الحل وتطبع في ثلاث نسخ.
  8. تطبع ميكروأرس متطابقة بجانب بعضها البعض على الغشاء وقطع في صفائف الفردية بعد اكتمال مهمة الطباعة.
  9. في كل تجربة يمكن أن يتم تعديل صفائف من أجل استيعاب العينات أكثر أو أقل، أو التخفيفات مكررات.

4. التحقيق ميكروأرس غليكان

  1. بعد الطباعة، منع ميكروأرس الفردية في 5٪ ث / ت مسحوق الحليب منزوع الدسم الذائب في الفوسفات مخزنة المالحة (MPBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لتقليل غير محددة ملزمة.
  2. ميكروأرس التحقيق مع الاجسام المضادة المحددة لجدار الخلية الحواتم لمدة 2 ساعة غليكان في MPBS. غالبية antib وحيدة النسيلةodies ضد جدار الخلية glycans متاحة تجاريا من ثلاث شركات؛ Biosupplies ( www.biosupplies.com.au )، Carbosource خدمات ( www.carbosource.net ) وPlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. وتشمل المراقبة السلبية، وحضنت مع ميكروأري MPBS فقط وليس الأجسام المضادة الأولية.
  4. غسل ميكروأرس 3 مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 5 دقائق لإزالة غير محددة وملزمة.
  5. بحث في ميكروأرس مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق لالبيروكسيديز الفجل (HRP) في MPBS لمدة 2 ساعة. الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد معظم glycans جدار الخلية تتطلب الأجسام المضادة الثانوية مكافحة الفئران الفأر أو المضادة.
  6. كرر الخطوات 3 مرات مع غسل العازلة PBS لمدة 5 دقائق لإزالة غير محددة وملزمة.
  7. تطوير ميكروأرس باستخدام مولد اللون (3،3-Diaminobenzidine) أو chemiluminecent (كسيماترين) ركائز.

5. تحديد الكمية

  1. بعد التنمية، مسح ميكروأرس الفردية باستخدام عالية الدقة (1،200 نقطة في البوصة) الماسح الضوئي سطح المكتب وحفظ الصور والسلبية، وملفات TIFF 16 بت (الشكل 3).
  2. حساب كثافة لا يتجزأ من كل بقعة باستخدام برامج معالجة الصور إكسبلور (LabNEXT) مزودة أداة الشبكة الآلي. مشتق من كثافة بقعة لا يتجزأ من مجموع بكسل في المنطقة المحيطة الشبكة كل بقعة.
  3. يتم تصدير البيانات الشبكة لكل ميكروأري كملف TXT ويمكن استيراد يدويا في جدول بيانات Excel للتحليل. أداة على الإنترنت ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ وقد تم تطوير) لترجمة ومعالجة البيانات تلقائيا من ملفات TXT الفردية.
  4. وبلغ متوسط ​​كثافة بقعة لا يتجزأ عبر طباعة نسخ متماثلة والتخفيفات للحصول على بقعة 'يعنيشدة 'قيمة كل عينة (الشكل 2). بدلا من ذلك، تستخدم إشارات بقعة القيمة المقابلة لتخفيف واحد فقط على مجموعة لتحديد حاتمة غليكان النسبية وفرة لكل عينة.
  5. وتعرض النسبي بين متوسط ​​كثافة بقعة عينات مختلفة باعتبارها heatmap (الشكل 4) باستخدام التنسيق الشرطي في Excel أو أدوات heatmapper عبر الإنترنت ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). يتم تصحيح البيانات لكل نوع الأجسام المضادة إلى 100 وتفرض قيمة قطع 5٪ لإزالة إشارة الخلفية وايجابيات كاذبة.

النتائج

تم تحديد الوفرة النسبية للأنواع الأنسجة في glycans ستة (خيوط العضو الذكري، وحبوب اللقاح، المبايض، بتلات، كأسية ووصمة العار) من الزهور المجنح نيكوتيانا باستخدام CoMPP. الرقم 3A يظهر ميكروأري ممثل الذي تم بحثها مع محددة JIM5 ماب لhomogalacturonan (منخفض) جزئيا methylesterified (HG)، والذي ي...

Discussion

CoMPP هو وسيلة سريعة وحساسة للالتنميط تكوين غليكان مئات من العينات المستمدة من النباتات في غضون أيام. هذا الأسلوب يكمل المتاحة بالفعل البكتيرية أو الثدييات منصات لمجموعة غليكان الفرز الفائق الإنتاجية للتفاعلات الكربوهيدرات مع البروتينات غليكان ملزم مثل يكتينس، والم...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وIEM يود أن يقر مجلس البحوث الدانمركية (FTP وFNU) للحصول على التمويل. ERL تعترف بدعم منحة DP ARC. AB يعترف بدعم من مركز التميز في ARC خلية النبات الجدران المنحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
3 مم التنغستن كاربايد الخرز QIAGEN 69997
microtubes جمع (1.2 مم) QIAGEN 19560 يمكن أيضا 1.5 مل أنابيب microfuge استخدامها
QIAGEN TissueLyser II QIAGEN 85300
3 حبات الزجاج مم سيغما الدريتش Z143928
CDTA سيغما الدريتش 34588
الكادميوم أكسيد سيغما الدريتش 202894
1،2-diaminoethane سيغما الدريتش 03550
غشاء النيتروسليلوز (0.22 ميكرون حجم المسام) GE المياه وتقنيات عملية EP2HY00010 مختلفة الحجم الأغشية المسامية هي مناسبة لأنواع مختلفة دبوس
XACT II microarrayer الروبوت Labnext 001A تم تركيب الروبوت الثاني XACT مع العرف لوحة × 20 سم 20 السيراميك التي يتم إرفاق غشاء النيتروسليلوز
XTEND دبابيس ميكروأري RM Labnext 0037-350 يجب أن تكون مناسبة لدبابيس اكتشاف على الأغشية
384 وحات microtiter جيدا (البولي بروبلين) غرينر 781207
مكافحة غليكان الاجسام المضادة مجسات النبات /
CarboSource / Biosupplies 		المواقع؛ PlantProbes ( www.plantprobes.net )، Carbosource (ww.carbosource.net "الهدف =" _blank "> www.carbosource.net) وBiosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
مكافحة فأر مفتش (جزيء كله) - الأجسام المضادة البيروكسيداز المنتجة في الماعز. سيجما A9037 نوع من الأجسام المضادة الثانوية يعتمد على الأجسام المضادة الأولية المستخدمة (على سبيل المثال في رفع الخ الفئران الفأر والماعز و).
SIGMA FAST 3،3 '-Diaminobenzidine أقراص سيجما D4293 نوع كاشف النامية تعتمد على الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة وطريقة الكشف (colourmetric، أو chemiluminecent).
SuperSignal الركيزة بيكو الغربية Chemiluminescent Thermoscientific 34080 انظر أعلاه
إكسبلور برامج معالجة الصور LabNext 008 أنواع البرمجيات مع العديد من الأدوات الآلية gridding متاحةلقياس قيمة بكسل من البقع ميكروأري.
مصنع السكريات سيغما / Megazyme
TR>

References

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

70 CoMPP glycans arabidopsis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved