تكرارية الأمثل من دوبلكسات DNA لبلورة-DNA من SeqA مجمعات

Summary

يمكن التركيب البلوري للبروتين DNA-المجمعات توفير نظرة ثاقبة وظيفة البروتين، وآلية، وكذلك، فإن طبيعة التفاعل محددة. هنا، ونحن التقرير كيفية تحسين طول، وينتهي تسلسل الحمض النووي دوبلكس للتبلور بالتعاون مع كولاي SeqA، منظم السلبية للبدء النسخ المتماثل.

Abstract

القولونية الإشريكية SeqA هو المنظم السلبية لتكرار الحمض النووي الذي يمنع المبكرة من الأحداث باستعادة مجموعات عزل GATC hemimethylated في الأصل من النسخ المتماثل ^1. ما وراء الأصل، تم العثور على الشوك SeqA النسخ المتماثل، حيث تنظم DNA تكرارها حديثا في الهياكل العليا أمرت ^2. SeqA الزميلة ضعيفة فقط مع تسلسل GATC واحدة، ولكنها تشكل مجمعات تقارب عالية مع الدوبلكس DNA التي تحتوي على مواقع متعددة GATC. الحد الأدنى من وحدة وظيفية وهيكلية من SeqA هو ديمر، موضحا بذلك الشرط ما لا يقل عن اثنين من سلاسل GATC لتشكيل مجمع عالية تقارب مع DNA hemimethylated ^3. بالإضافة إلى ذلك، فإن هيكل SeqA، مع oligomerization وDNA ملزم المجالات مفصولة رابط مرنة، تسمح ملزمة ليكرر GATC مفصولة حتى يتحول حلزونية الثلاثة. لذلك، فهم وظيفة SeqA على المستوى الجزيئي يتطلب آنا الهيكليةتحلل من SeqA بد أن تسلسل GATC متعددة. في البروتين DNA التبلور، يمكن DNA لا شيء لتأثير استثنائي على التفاعلات التعبئة اعتمادا على الأحجام النسبية والهندسة المعمارية من البروتين والحمض النووي لل. إذا كان البروتين أكبر من DNA أو آثار أقدام معظم DNA، وتوسط في المقام الأول على التعبئة من الكريستال البروتين البروتين التفاعلات. وعلى العكس، عندما البروتين هو نفس الحجم أو أصغر من DNA أو أنه لا يغطي سوى جزء بسيط من التفاعلات DNA، والحمض النووي DNA-DNA والبروتين تهيمن التعبئة وضوح الشمس. ولذلك، بلورة البروتين DNA المجمعات يتطلب الفحص المنتظم من ⁴ طول DNA وينتهي DNA (كليلة أو عبء) ^5-7. في هذا التقرير، ونحن تصف كيفية تصميم وتحسين وتنقية وبلورة دوبلكسات DNA hemimethylated تحتوي على جنبا إلى جنب يكرر GATC في مجمع مع متغير من مثنوي SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) للحصول على بلورات مناسبة لتحديد الهيكل.

Protocol

1. البروتين تنقية

رابط مرنة تربط. N-(oligomerization) ومحطة C-(DNA ملزم) مجالات المساعدات SeqA الاعتراف يكرر GATC hemimethylated فصل تلو الآخر لثلاث لفات على DNA لهذه الدراسة، كنا البديل مثنوي من SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) مع طفرة نقطة في المجال N-محطة يمنع oligomerization وكذلك تقصير رابط يقيد DNA ملزم لGATC جنبا إلى جنب يكرر فصل خاص من قبل واحد بدوره على الحمض النووي (الشكل 1) ^2،8.

1. تحويل BL21 (DE3) الخلايا التي تحتوي على البلازميد SeqA ترميز تحت سيطرة المروج T7،
2. لوحة رد فعل التحول في لوحات أجار LB-بما في ذلك 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين،
3. اختيار المستعمرات المختلطة لتطعيم ثقافة على نطاق ضيق بين عشية وضحاها (مع 100 ميكروغرام / مل سائل الإعلام الأمبيسلين LB)،
4. في صباح اليوم التالي لتطعيم L 1 من وسائل الإعلام باستخدام التخفيف 1:100 من overniGHT الثقافة،
5. تنمو الخلايا إلى OD ₆₀₀ من ~ 0.7 و حمل إنتاج البروتين بواسطة إضافة الآيزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside-1 (IPTG) إلى تركيز النهائي من 1 ملم،
6. مواصلة الحضانة لمدة 3 ساعة عند C ° 37 مع المدارية تهز ثم حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (10 دقائق في 3300 ز)،
7. إعادة تعليق بيليه خلية في تنقية العازلة A وليز من قبل صوتنة،
8. مسح المحللة بواسطة الطرد المركزي (40 دقيقة في 39000 ز) وتحميل طاف على عمود الهيبارين معايرتها مع العازلة تنقية،
9. أزل SeqA باستخدام الانحدار الخطي لكلوريد الصوديوم M 1 (SeqA elutes في كلوريد الصوديوم M ~ 0.7)،
10. تجمع الكسور التي تحتوي على SeqA معا، تمييع لخفض القوة الأيونية من العينة وتحميل إلى عمود اللوني الموجبة لتبادل معايرتها مع العازلة تنقية،
11. باستخدام التدرج الخطي الملح، SeqA النقي في elutes ~ M كلوريد الصوديوم 0.4،
12. تجمع الكسور التي تحتوي على SeqA معا، concentratه (3 ملغ / مل) وتخزينها في المخزن المؤقت التخزين.

2. DNA تنقية

1. لكي يكمل أليغنوكليوتيد] unmethylated وميثليته من شركة المفضلة لديك،
2. حل 1 ميكرومول من كل ضفيرة واحدة DNA في 800 ميكرولتر مجفف بالتجميد من ₂ تعقيمها O DDH، دوامة والسماح لها الجلوس لمدة 10-20 دقيقة،
3. إضافة 800 ميكرولتر من العازلة محمى تحميل 2X لكل قليل النوكليوتيد،
4. لأليغنوكليوتيد] النيوكليوتيدات 20-30 طويلة، إعداد كبيرة 10٪ هلام يبدل طبيعة (160 × 250 × 1 مم):
   * مزيج من 80 مل من مزيج PAGE 10٪، و 80 ميكرولتر TEMED و 800 ميكرولتر فوق كبريتات الأمونيوم في هلام وتصب،
   * بلمرة مرة واحدة، وإزالة المشط وشطف الآبار مع O DDH بدقة _2،
   * تجميع المواد الهلامية على الزهر بما في ذلك لوحة هلام التبريد وثم ملء الخزانات العلوية والسفلية مع تشغيل المخزن المؤقت (1X TBE)،
   * قبل تشغيل هلام في 700-750 V لتدفئة جل ° C تصل إلى 55 عاما،
   * إيقاف التشغيل وشطف الآبار thoroughly مع تشغيل المخزن المؤقت.
5. تسخين أليغنوكليوتيد] إلى 90 لمدة 2 دقيقة C °،
6. وتدور دوامة العينات وعلى الفور قبل تحميل هلام،
7. تشغيل هلام في V 700 ~ ووقف مرة واحدة قليل النوكليوتيد الخاص بك قد هاجروا في منتصف الطريق. (لاحظ أن على هلام بولكرلميد 10٪ الأزرق bromophenol شارك في يهاجر مع [أليغنوكليوتيد] ~ 20 قواعد طويلة والزيلين FF cyanol مع ~ 60 قواعد طويلة)،
8. وقف الجل أو تفكيكها من مربع هلام وإزالة الفواصل،
9. على سطح مستو، وإزالة لوحة واحدة من الزجاج وتغطية هلام مع غلاف بلاستيكي،
10. تحويل جل حولها، وإزالة لوحة من الزجاج وغيرها من تغطية ذلك مع غلاف بلاستيكي،
11. بمناسبة العصابات باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية لوحة نيون وراء جل لرؤية الظل DNA،
12. قطع الشريط بشفرة الحلاقة الى قطع صغيرة ونقلها إلى أنبوب العقيمة 15 مل،
13. أضف 9 مل من العازلة شطف وأزل بين عشية وضحاها في C ° 37 مع الانفعالات،
14. نقل بعناية الحلإلى أنبوب الطرد المركزي تعقيمها باستخدام تلميح ماصة هلام التحميل لتجنب نقل القطع مادة الأكريلاميد وإضافة 1 مل من 3 خلات الصوديوم M في الرقم الهيدروجيني 7 (1:10 التخفيف)، بالإضافة إلى 25 مل من الايثانول المبردة 100٪ (2.5 مجلدات)،
15. احتضان في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعة،
16. تدور باستمرار ونقل إلى أنبوب طاف منفصلة،
17. تجفيف بيليه على بطالة السرعة في نار متوسطة،
18. إعادة تعليق بيليه في 400 ميكرولتر من ₂ O تعقيمها DDH ونقل إلى أنبوب جديد،
19. ثم تخلط جيدا (الدوامة) واحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من 30 دقيقة في -20 ° C،؛ اضافة 40 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M في درجة الحموضة 7 و 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪
20. تدور لمدة 15 دقيقة في 18000 ز وتجاهل طاف،
21. شطف مع 100 ميكرولتر بيليه من الايثانول البارد 70٪ لإزالة الملح المتبقية من بيليه وتدور لمدة 6 دقائق في 18000 ز. تجاهل الإيثانول وتجفيف بيليه على بطالة السرعة،
22. إعادة تعليق بيليه في ما مجموعه 100 ميكرولتر من تعقيمها DDH _{2 O. قياس تركيز قليل النوكليوتيد،}
23. ليصلب دوبلكسات DNA hemimethylated، مزيج من خيوط تركيزات متساوي المولية واحد التكميلية وتسخين خليط إلى 95 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 5 دقائق ثم يبرد والسماح لهم ببطء إلى درجة حرارة الغرفة داخل حمام ماء.

3. البروتين DNA تشكيل مجمع وتحليل

1. خلط أحجام متساوية من SeqAΔ المطهرون (41-59)-A25 (81 ميكرومتر) والحمض النووي hemimethylated (81 ميكرومتر)،
2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى كنت على استعداد لاستخدامها،
3. الشاشة للظروف تبلور باستخدام مصفوفة التجارية متفرق الشاشات،
4. مرة واحدة وقد تم تحديد يؤدي تبلور الأولية، وتحسين الظروف للنمو بلورات نوعية الحيود،
5. Cryoprotect الناتجة SeqA-DNA عن طريق زيادة بلورات إما كمية الحاضر 400 PEG في بلورة الحل لتركيز النهائي من 25٪ (ت / ت) أو إضافة الجلسرين 20٪ (V / V) إلى بلورة حل،
6. حلج القطن البلورات الفردية مع حلقة النايلون، وفلاش تجميدها في النيتروجين السائل،
7. اختبار الحد حيود كل الكريستال في 100 K.

4. ممثل النتائج

للحصول على التركيب البلوري للSeqAΔ (41-59)-A25R بد أن DNA hemimethylated، ونحن الأمثل المعلمات الثلاث على التوالي على DNA: (ط) الفصل بين متواليات GATC hemimethylated، (الثاني) طول الوجهين؛ و(الثالث) غياب / حضور يتدلى 5 '.

المقايسات تحول الكهربائية التنقل إلى أن SeqAΔ (41-59)-A25R ترتبط بشكل تفضيلي يكرر GATC مفصولة أزواج قاعدة 9-10 (الشكل 1). ولذلك، فإننا في البداية فحص الدوبلكس أزواج قاعدة 23-24 (BPS) التي تحتوي على اثنين من سلاسل طويلة GATC hemimethylated مفصولة إما 9 أو بت في الثانية 10. التوصل إلى ثلاث دوبلكسات بلورات على شكل لطيف (الشكل 2). شركةرغم أن أيا من بلورات محلل لارتفاع القرار، وال 23 نقطة أساس على الوجهين طويلة مع الموقعين GATC مفصولة 9 نقاط أساس محلل أشعة X-أفضل من البقية، مشيرا إلى أن كان يفضل فصل GATC من 9 نقاط أساس لبلورة. ولذلك، فإننا ثابتة التباعد بين GATC إلى 9 نقاط أساس لجميع شاشات اللاحقة.

عموما، يفضل بلورة DNA المزدوجة لفترات المقابلة ليتحول حلزونية بالضبط لأن جزيئات DNA متعددة يمكن كومة من الرأس إلى الذيل لتشكيل المستمر B-DNA داخل ال ⁹ وضوح الشمس. ولذلك، فإننا تقصير الطول الاجمالي للدوبلكسات إلى 21 نقطة أساس (أي لفتين حلزونية). في حين لم نقطة أساس على الوجهين 21 مع نهايات حادة لا تسفر عن بلورات نوعية حيود (البيانات لا تظهر)، وعلى الوجهين نقطة أساس ل21 مع تراكم 5 'واحد النوكليوتيدات على كل نهاية لم تسفر عن البلورات التي محلل إلى 5 Å في مصدر وطننا. تحسين على حد الحيود اقترح أن نهاية إلى نهاية الرابطة المزدوجة ويفضل في الواقعجي الكريستال التعبئة.

منذ SeqA يتفاعل مع تسلسل GATC التي هي على نفس الوجه من الحمض النووي، ينبغي أن يتعرض الوجه الآخر من الوجهين DNA للمذيب. لمزيد من تحسين بلورات من المجمع، ونحن ثم تعديل تسلسل من الوجهين لتشمل ثنائي النوكليوتيد CG بين الموقعين GATC لتعزيز الأخدود العمود الفقري التفاعل مع جزيئات DNA المجاورة في الكريستال من خلال مواجهة الآخر من الوجهين، وهي طريقة وقد استخدم هذا لتعزيز تبلور DNA في ^{ال 10} الماضية. ومع ذلك، كان الحد حيود من بلورات نمت مع الوجهين CG المحتوية مماثلة لتلك نمت مع الوجهين DNA المماثلة التي لا تحتوي على ثنائي النوكليوتيد CG (الشكل 3). وأشارت هذه النتيجة التي الأخدود العمود الفقري التفاعلات لم تكن المهم في هذه الحالة. ونحن الأمثل لاحقا طول يتدلى من خلال مقارنة بلورات نمت مع الوجهين DNA التي كان اثنان النيوكليوتيدات إضافية في كلنهاية 5 '. كان هذا التغيير تأثير كبير على التشكل وضوح الشمس، وكذلك، والحد من الحيود تشير إلى أن النوكليوتيدات إضافية تغيرت بشكل كبير في تعزيز الاتصالات الجزيئية ومنظمة الكريستال (الشكل 3).

التركيب البلوري للSeqAΔ (41-59)-A25R بد أن هذا الاتجاه DNA الماضي أن وجهه خالية من الوجهين DNA لا تشارك في الاتصالات وضوح الشمس، كما هو متوقع من تأثير محدود من إدخال CG-ثنائي النوكليوتيد. على الرغم من الحجم النسبي للبروتين والحمض النووي، وتتوسط معظم التفاعلات بين زملائه من التماثل التفاعلات البروتين البروتين والبروتين DNA-(الشكل 4). ومن المثير للاهتمام، في هذه الحالة بالذات، والأثر الإيجابي لعبء ثنائي النوكليوتيد على 5 'لا يعود إلى تشكيل DNA شبه مستمر. بدلا من ذلك، نهاية 5 'من المشاريع حبلا ميثليته بعيدا عن محاور DNA وتتفاعل مع جزيء SeqA القريب من المجمع، موضحا لماذا النيوكليوتيدات 2 ث يحرث يتطلبها تغيير الكريستال التعبئة ^8،11.

الشكل 1. الملزمة للSeqAΔ (41-59)-A25R لDNA hemimethylated. (A) رسم تخطيطي للمجالات التي تتوسط SeqA oligomerization البروتين والحمض النووي ملزمة. (B) التحول التنقل الكهربي مقايسة من SeqAΔ (41-59)، مع السلطات الوطنية المعينة A25R تحتوي على اثنين من متواليات GATC hemimethylated مفصولة عدد متزايد من الأزواج الأساسية ( X). حارة أقصى اليمين (المسمى فارغ) يحتوي على خليط متساوي المولية للسلطات الوطنية المعينة مع 5 و 7 و 12 و 21 و 25 و 34 أزواج قاعدة بين اثنين متواليات GATC في غياب SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) مخطط تصور المتغيرات الثلاثة الأمثل على دوبلكسات للحصول على بلورات الحمض النووي نوعية حيود.

upload/4266/4266fig2.jpg "FO: المحتوى العرض =" 6in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
الشكل 2. تأثير متفاوتة بين GATC المسافة. موجز أليغنوكليوتيد] المستخدمة والبلورات التي تم الحصول عليها مع بي بي 23-24 دوبلكسات طويلة تحتوي على موقعين GATC hemimethylated مفصولة أزواج قاعدة 9 أو 10. أخذت كل الصور من بلورات في نفس التكبير ويشير حجم شريط 100 ميكرون. قرار الحد من كل SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA ويستند على الصور حيود الكريستال جمع على RU-300 Rigaku نظام مولد الأشعة السينية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. تأثير تغيير في الحمض النووي تنتهي. ملخص رانه أليغنوكليوتيد] المستخدمة والتي تم الحصول عليها ب 21 نقطة أساس بلورات دوبلكسات طويلة تحتوي على موقعين GATC hemimethylated مفصولة أزواج قاعدة بما في ذلك 9 و 0، 1 أو 2 النوكليوتيدات يتدلى نهاية 5 '. أخذت كل الصور من بلورات في نفس التكبير ويشير حجم شريط 100 ميكرون. قرار الحد من كل SeqAΔ (41-59) ويستند-A25R-DNA الكريستال على الصور التي تم جمعها حيود في beamlines X12C وX29 (NSLS، BNL). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 4. التعبئة من الكريستال SeqAΔ (41-59)-A25R بد أن DNA مع تراكم ثنائي النوكليوتيد: عرض من أعلى (A) والجانب (B). وحدة غير متكافئة يحتوي على اثنين من SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA المجمعات حيث يظهر البروتين في الرمادي بينما يظهر DNA في البرتقال. Symmetراي ذات صلة SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA وتظهر باللون الأبيض جزيئات البروتين لوالأصفر لDNA. وقد أعد هذا الرقم باستخدام PyMOL ^12. ويرتبط هذا الرقم إلى فيلم 1. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الفيلم 1. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .

Discussion

واحدة من أكبر التحديات في البلورات بالأشعة السينية الجزيئات هو الحصول على بلورات نوعية حيود. في حالة المجمعات البروتين أو البروتين DNA، ويتفاقم هذا التحدي بسبب المتغيرات الإضافية التي يجب أن يكون الأمثل. ويعتقد على نطاق واسع أن طول DNA وجود يتدلى زجة لتعزيز رابطة الجوا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج #	التعليقات (اختياري)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA)	فيشر العلمية	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	الحيوية الأساسية شركة	DB0058
كلوريد الصوديوم	Bioshop	SOD002.10
الغليسيرول	كاليدون	5350-1
سكر القصب	سيغما الدريخ	S5016-500G
كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)	Bioshop	SDS001.500
اليوريا	Bioshop	URE001.5
29:1٪ 40 مكررا / الأكريلاميد	الحيوية الأساسية شركة	A0007-500ml	تخزين عند 4 ° C
حمض البوريك	EMD	BX0865-1
الزيلين cyanol FF	بيو راد	161-0423
زرقة البروموفينول	Bioshop	BR0222
تعديل النظام المزدوج جل العمودي	CBC الشركة العلمية شركة	DASG-250
مؤشر بلورة الشاشة	البحث هامبتون	HR2-144	تخزين عند 4 ° C
معالج شاشة I تبلور	الزمرد النظم البيولوجية	EBS-WIZ-1	تخزين عند 4 ° C
معالج شاشة بلورة II	الزمرد النظم البيولوجية	EBS-WIZ-2	تخزين عند 4 ° C
كلاسيكيات بلورة الشاشة	QIAGEN	130701	تخزين عند 4 ° C
الصواني Intelliplate	الفن روبنز الصكوك	102-0001-00
			حلول البروتين العازلة تنقية: 100 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 2 مم EDTA، 2 DTT ملم والجلسرين 5٪. البروتين المخزن المؤقت التخزين: 20 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي DTT، 0.5 مم EDTA والجلسرين 5٪. هلام مزيج التحميل: إضافة 20 غراما من السكروز، 25 ملغ من اللون الأزرق bromophenol، 25 ملغ من FF cyanol الزيلين، 1 مل من 10٪ وزن / حجم SDS و 10 مل من TBE 10X إلى 70 مل من 2 تعقيمها O. DDH اثارة مع التدفئة خفيفة حتى يذوب السكروز وضبط النهائيحجم 100 مل لتعقيمها مع 2 O. DDH تخزين في C. ° 4 2X العازلة التحميل: إضافة 11 غرام من اليوريا إلى 10 مل من مزيج هلام التحميل. يحرك المزيج على لوحة الساخن حتى يذوب اليوريا. قسامة في أنابيب 2 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية. 10X مزيج PAGE: مزيج 420،4 غرام من اليوريا، و 100 مل من TBE 10X (تعقيمها)، 250 مل من 40٪ 29:1 مكرر / الأكريلاميد في DDH 2 O. يحرك حتى يذوب تماما وضبط مستوى الصوت إلى 1 لتر. تخزين في زجاجات داكنة في C. ° 4 10X TBE: حل 108 ز من TRIS، 55 غرام من حمض البوريك و 9.3 غرام من EDTA في 1 لتر من DDH 2 O. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. شطف العازلة: 8 مل من المخفف كلوريد الصوديوم M 5، 2 مل من 1 M الرقم الهيدروجيني 7،5 TRIS، 0.4 مل من 0.5 درجة الحموضة EDTA M 8 على 200 مل من DDH 2 O. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.