JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قد وضعت مؤخرا تقنيات التصوير باستخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة مضان (NIRF) المساعدة في الكشف عن دور الجهاز الليمفاوي ورم خبيث يلعب في السرطان، والاستجابة المناعية، وإصلاح الجرح، وغيرها من الأمراض المرتبطة اللمفاوية.

Abstract

الأوعية الدموية اللمفية هو عنصر هام من عناصر جهاز الدورة الدموية التي تحافظ على التوازن السائل، ويوفر المراقبة المناعي، وتتوسط امتصاص الدهون في الأمعاء. لكن على الرغم من وظيفتها الجوهرية، هناك فهم قليل نسبيا لكيفية تكيف الجهاز اللمفاوي لخدمة هذه الوظائف في الصحة والمرض 1. مؤخرا، لقد أثبتنا القدرة على حيوي صورة العمارة اللمفاوي والليمفاوية "ضخ" العمل في مواضيع الإنسان العادي وكذلك في الأشخاص الذين يعانون ضعف اللمفاوي باستخدام إدارة أثر للصبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) الفلورسنت والعادة، الجنرال III- تكثيف نظام تصوير 2-4. وأظهرت NIRF التصوير تغييرات جذرية في بنية ووظيفة اللمفاوية مع الأمراض التي تصيب البشر. يبقى من غير الواضح كيف أن هذه التغيرات تحدث ويتم تطوير نماذج حيوانية جديدة لتوضيح أساس الجينية والجزيئية. في هذا البروتوكول، نقدم NIRF اللمفاوي، قمول التصوير باستخدام الحيوانات 5،6 خضرة الإندوسيانين (ICG)، وهي الصبغة التي استخدمت لمدة 50 عاما لدى البشر 7، وصبغ المسمى NIRF دوري المجال ملزمة الزلال (CABD-IRDye800) الببتيد التي ترتبط بشكل تفضيلي الماوس و 8 الألبومين البشري . ما يقرب من 5.5 مرات أكثر إشراقا من ICG، CABD-IRDye800 لديه إزالة اللمفاوي مماثلة الشخصي ويمكن حقن جرعات أقل من في ICG لتحقيق إشارات كافية للتصوير NIRF 8. لأن كلا من ربط CABD-IRDye800 وICG لالزلال في الفضاء الخلالي 8، كلاهما قد تصور بالموقع النقل والبروتين إلى داخل الأوعية اللمفاوية. تدار داخل الأدمة (ID) الحقن (5-50 ميكرولتر) من ICG (645 ميكرومتر) أو CABD-IRDye800 (200 ميكرومتر) في المياه المالحة إلى الجانب الظهري من كل مخلب هند و / أو الجانب الأيسر والأيمن من قاعدة ذيل ماوس isoflurane-تخدير. تركيز صبغة مما أدى إلى الحيوان هو 83-1،250 ميكروغرام / كغ للICG أو 113-1،700 ميكروغرام / كغ للCABD-IRDye800. مباشرة بعد الحقن، ويجري التصوير الوظيفي للموارد البشرية اللمفاوي 1 حتى باستخدام صغيرة مخصصة نظام التصوير NIRF الحيوان. يمكن كله القرار الحيوان المكانية تصوير الأوعية اللمفاوية الفلورسنت من 100 ميكرون أو أقل، وصور الهياكل يصل إلى 3 سم في عمق يمكن الحصول عليها 9. يتم الحصول على الصور باستخدام برنامج V + + وتحليلها باستخدام برامج MATLAB أو يماغيج. أثناء التحليل، يتم رسمها المناطق متتالية من الفائدة (رويس) يشمل القطر بأكمله على طول السفينة سفينة الليمفاوية معين. يتم الاحتفاظ الأبعاد لكل ROI المستمر لسفينة معينة وكثافة NIRF يتم قياس العائد على الاستثمار لكل إجراء تقييم كمي "الحزم" من خلال الأوعية الليمفاوية تتحرك.

Protocol

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا لمعايير من جامعة تكساس مركز العلوم الصحية (هيوستن، TX)، قسم الطب المقارن، ومركز التصوير الجزيئي بعد مراجعتها والموافقة عليها من البروتوكول كل منها رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC) أو رعاية الحيوان اللجنة (AWC).

1. إعداد الحيوانات 24 ساعة قبل التصوير

ويجب أن يتم الخطوات التالية (حسب الحاجة) في اليوم قبل التصوير اللمفاوي يحدث.

  1. المكان الحيوانية في مربع تحريض وقور مع isoflurane.
  2. وبمجرد أن الحيوان هو في حالة من التخدير العميق (مراقبة مع إصبع القدم مناورة قرصة)، والحيوان مخدرا مكان على وسادة حفاضات / زغب والأنف موقف في مخروط الأنف متصل الغاز isoflurane.
  3. كليب كل الشعر / الفراء (إن وجدت) في جميع أنحاء المنطقة المراد تصويرها.
  4. تطبيق مزيل الشعر عامل (NAIR) إلى منطقة قص وترك الأمر سن الجلد لمدة تصل إلى 3 دقائق.
  5. قم بمسح جميع من وكيل مزيل الشعر مع الشاش، دافئة رطبة أو منشفة ورقية.
  6. شطف الجلد بلطف بالماء الدافئ والجاف بلطف المنطقة مع الشاش أو منشفة ورقية.
  7. السماح لاستعادة الحيوانات على وسادة التدفئة أو تحت مصباح الحرارة، والعودة إلى قفص.

2. يوم التصوير

  1. إعادة التصوير مع وكيل الماء المعقم، ثم استخدام تمييع، طبيعية معقمة (0.85٪) لتحقيق المالحة 645 ميكرومتر (5 μg/10 ميكرولتر) لICG ميكرومتر أو 200 (6.8 ميكرولتر μg/10) لCABD-IRDye800. نضع الحلول في الظلام شروط واستخدام الموارد البشرية من خلال 6 إعادة.
  2. المكان الحيوانية في مربع تحريض وقور مع isoflurane.
  3. وبمجرد أن الحيوان هو في حالة من التخدير العميق (مراقبة مع إصبع القدم مناورة قرصة)، والحيوان مكان مخدرا على جانبها على لوحة حفاضات / زغب والأنف موقف في مخروط الأنف متصل الغاز isoflurane.
  4. إطفاء الأنوار (حتى الغرفة هوالظلام). إذا لزم الأمر، يمكن استخدام الهالوجين مكتب صغير للضوء كمية صغيرة من الضوء لمعرفة الحقن.
  5. حقنة الانسولين باستخدام بإبرة 31-قياس، حقن 5 ميكرولتر ID إلى 50 ميكرولتر من ICG أو CABD IRDye800 في الجانب الظهري من كل مخلب هند و / أو على الجانب الأيسر والأيمن من قاعدة الذيل، اعتمادا على مجال الاهتمام (انظر المناقشة). كل جرعة حقن قد تتراوح ،083-1،25 مغ / كغ (ICG) أو ،113-1،7 مغ / كغ (CABD-IRDye800). سوف تختلف مع حجم الضخ سلالة الحيوانات وموقع الحقن. بالنسبة للفئران athymic، يمكن أن يكون حجم حقن 5 ميكرولتر (مخلب هند) أو 10 ميكرولتر (قاعدة الذيل). إذا الحيوانية ليست تحت نظام التصوير للحقن (ق)، ضع الحيوانات تحت نظام التصوير مباشرة بعد حقن (ق).
  6. إذا اعتبر أي امتصاص الصبغة في الأوعية اللمفاوية، وخطوة 2،5 يحتاج إلى تكرار حسب الحاجة في بروتوكول الحيوانية.
  7. مرة واحدة وينظر الأوعية اللمفاوية، تغطية مكان الحقن مع الشريط الكهربائي أسود أو أسود السلطة الفلسطينيةفي.
  8. الحصول على صور اللمفاوية لمدة تصل إلى 1 ساعة باستخدام V + + برامج والحيوانات الصغيرة، والتصوير NIRF النظام. (يتم تحت التخدير isoflurane مع الحيوانات ويتم مراقبة التنفس بينما تكتسب الصور.) بينما الحيوانات الصغيرة، والتصوير NIRF متاحة تجاريا، ونحن الاستفادة من صغيرة مخصصة نظام التصوير NIRF الحيوان يتكون من ليزر ديود 785 نانومتر (1005-9MM-78503 ، مكثفة، شمال برونزويك، NJ) تجهيزه مع عدسة شبه كروي (C24TME-B، Thorlabs، نيوتن، NJ)، الناشر (ED1-C20، Thorlabs)، والتصفية (LD01-785/10-25، Semrock، روتشستر، نيويورك ) لإنشاء حقل الإثارة موحدة الذي يضيء الحيوانية في الحادث معدل فلوينس من أقل من 1.4 ميغاواط لكل سنتيمتر مربع 10. اتهم بضرب الإلكترون، إلى جانب جهاز (EMCCD، PhotonMax512، برينستون الصكوك، ترينتون، NJ) نظام الكاميرا مع مرشحات 830 نانومتر اثنين (AND11333، أندوفر شركة، سالم، NH) وعدسة نيكور 28-مم (1992، نيكون، يستخدم ميلفيل، NY) لالتقاط الصور مع تيم التكامل اللمفاويوفاق من 200 ميللي ثانية للتصوير دينامية وميللي ثانية 800 للتصوير ثابت 5. انظر الشكل 1 لتكوين النظام، والجدول للحصول على تفاصيل إضافية من كل مكون، ومناقشة للمناقشة وجيزة من خصائص تصوير الرئيسية.
  9. السماح لاستعادة الحيوانات على وسادة التدفئة أو تحت مصباح الحرارة والعودة إلى القفص، أو الموت ببطء.
  10. تحليل الصور باستخدام يماغيج أو برامج MATLAB. انظر الشكل 6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

مثال على التصوير اللمفاوي NIRF في الفئران

عندما يتم حقن ICG أو CABD IRDye800-ID في قاعدة ذيل الماوس العادي، يجب أن الأوعية الدموية اللمفية بين موضع الحقن عند قاعدة الذيل والعقدة الليمفاوية الأربية (LN) يمكن تصور فورا. بعد وقت قصير من الحقن (?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نستخدم صغيرة مخصصة نظام التصوير الحيوان NIRF لالتقاط الصور من الأوعية الليمفاوية وصفت في الفئران. أفلام لبناء الحركة الليمفاوية، يتم جمع 300 أو أكثر الصور. لمفاوية من التحليل الوظيفي من الأفلام، ويتم رسمها يدويا رويس اثنين أو أكثر على طول سفينة الليمفاوية. يتم الاحتفاظ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف، ولكن يتم سرد بعض الكتاب على براءة اختراع.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المنح التالية لSevick إيفا: NIH R01 R01 CA128919 وNIH HL092923.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
حلول والكواشف والمعدات شركة كتالوج رقم تعليقات
خضرة الإندوسيانين (ICG) Patheon ITALIA SPA NDC 25431-424-02 إعادة إلى 645 ميكرومتر (5 μg/10 ميكرولتر)
دوري المجال ملزم الزلال (CABD) Bachem عرف إعادة إلى 200 ميكرومتر (6.8 ميكرولتر μg/10)
IRDye800 ليثيوم COR IRDye 800CW إعادة تصنيع وفقا لتعليمات و؛ المتقارن مع CABD بتركيزات equilmolar
معقمة للمياه هوسبيرا، وشركة، وبحيرة الغابات، IL NDC 0409-4887-10
NAIR الكنيسة وشركاه دوايت،شركة متاجر المحلية www.nairlikeneverbefore.com
نظام تصوير (مكونات أدناه) مركز التصوير الجزيئي N / A بنيت خصيصا في المختبرات لدينا.
الإلكترون تتضاعف المسؤول إلى جانب جهاز (EMCCD) الكاميرا برينستون الصكوك، ترينتون، NJ الفوتون ماكس 512
نيكون عدسة الكاميرا شركة نيكون، ميلفيل، NY نموذج رقم 1992، نيكور 28MM
تصفية البصرية أندوفر شركة، سالم، NH ANDV11333 وتستخدم اثنين نانومتر ممر الموجة المرشحات 830.0/10.0 أمام عدسة
785 نانومتر ليزر ديود مكثفة المحدودة، شمال برونزويك، NJ 1005-78503-9MM 500 ميغاواط من انتاج البصرية
الموازاة البصريات Thorlabs، نيوتن، NJ C240TME-B Collimates خرج ليزر قبل مرشح تنظيف
تنظيف فلتر Semrock، وشركة، روتشستر، نيويورك LD01-785/10-25 يزيل الليزر في الفرقة الانبعاثات مضان
الناشر البصرية Thorlabs، نيوتن، NJ ED1-C20 ينشر ليزر على الحيوان
V + + بصريات الرقمية، البني خليج، أوكلاند، نيوزيلندا الإصدار 5.0 استخدام برنامج لمراقبة نظام الكاميرا وحفظ الصور إلى جهاز الكمبيوتر. http://digitaloptics.net/
ويمكن استخدام البرمجيات التحليلية لأي من حزم البرامج التالية لتحليل الصور
يماغيج الجهاز جرت مقاضاتها الوطنيةtutes للصحة في بيثيسدا، MD أحدث إصدار متوفر مجانية متاحة على http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB ماثووركس، ناتيك، MA النسخة 2008A أو في وقت لاحق http://www.mathworks.com/

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved