حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Summary

وقد أنشئت فعال الجينوم على نطاق طفرة جين واحد باستخدام طريقة العقدية الدم كما كائن النموذج. وقد حققت هذه الطريقة من خلال تقارير إتمام المشروعات الإنتاجية العالية المؤتلف والتحولات.

Abstract

ينقول الطفرات والحذف واحد الجينات طريقتان في تطبيق خروج المغلوب الجينات في الجينوم على نطاق ^1،2 البكتيريا. على الرغم من الطفرات ينقول أقل مضيعة للوقت، أقل تكلفة، ولا تحتاج إلى استكمال المعلومات الجينوم، وهناك نوعان نقاط الضعف في هذه الطريقة: (1) إمكانية حدوث طفرات متباينة في مكتبة متحولة مختلطة مكافحة يختار المسوخ مع تقليل المنافسة؛ و (2) إمكانية تعطيل الجين جزئية حيث الجينات لا تفقد وظيفتها بالكامل بعد ادراج ينقول. قد أحادية الجين التحليل حذف التعويض عن العيوب المرتبطة الطفرات ينقول. لتحسين كفاءة الجينوم على نطاق حذف جين واحد، ونحن نحاول اقامة تقنية عالية الإنتاجية للالجينوم على نطاق حذف جين واحد باستخدام الدم العقدية باعتباره النموذج الحي. كل حذف الجينات في بناء S. تم تصميم الجينوم الدم لتشمل 1-KB المنبع من الجينات المستهدفة، الجين APHA-3، ترميز البروتين المقاومة الكانامايسين، و1-KB المصب من الجينات المستهدفة. ثلاث مجموعات من الاشعال F1/R1، F2/R2، وF3/R3، على التوالي، فقد تم تصميم وتجميعها في شكل لوحة 96-PCR-جيدا لالتكبير من تلك المكونات الثلاثة للحذف كل بناء. الاشعال R1 وتحتوي على 25-F3 بي بي متواليات التي هي مكملة لمناطق الجينات-3 APHA في نهاية ال 5 هم '. يتم تنفيذ A التضخيم PCR كبيرة الحجم من الجين-3 APHA مرة واحدة لخلق بنيات كل واحد حذف الجينات. في البداية تم استبعاد المروج من الجينات APHA-3 للتقليل من التأثير المحتمل للكاسيت الكاناميسين القطبية. لإنشاء بنيات حذف الجينات، يتم تنفيذ عالية الإنتاجية PCR التضخيم والتنقية في شكل لوحة 96-أيضا. وسيبذل الخطية AMPLICON PCR لكل المؤتلف حذف الجينات من خلال ردود الفعل PCR 4 عالية الدقة باستخدام البلمرة DNA. وexpon الأوليةential مرحلة نمو S. تستكمل الدم مثقف في مرق تود هيويت مع 2.5٪ يستخدم المصل الحصان المعطل لزيادة الكفاءة لتحويل PCR-المؤتلف يبني. تحت هذا الشرط، وتصل إلى 20٪ من S. يمكن أن تتحول الخلايا الدم ~ 50 نانوغرام باستخدام الحمض النووي. استنادا إلى هذا النهج، في نهاية المطاف تم الحصول على 2048 المسوخ مع احد الجينات الحذف من الجينات في 2270 S. الواردة الدم باستثناء 4 ORFs الجينات بالكامل داخل ORFs أخرى في S. الدم SK36 و 218 الجينات الأساسية المحتملة. هذه التقنية على خلق بنيات حذف الجين هو إنتاجية عالية، ويمكن أن تكون سهلة الاستخدام في الجينوم على نطاق الحذف جين واحد لأي بكتيريا التحويلية.

Protocol

1. تصميم التمهيدي

1. تم تصميم الاشعال باستخدام البرامج النصية في المنزل استنادا إلى S. الدم تسلسل الجينوم SK36. تم تصميم ثلاث مجموعات من الاشعال، F1/R1، F2/R2، وF3/R3 لتضخيم التسلسل-1 ك المنبع من الجين المستهدف، وترميز الجين APHA-3 الكاناميسين المقاومة (كم ^ص) البروتين ³ و 1 في تسلسل-KB المصب من الجين المستهدف، على التوالي (الشكل 1). ومن بين هذه الاشعال، فقد تم تصميم R3 باستخدام F1 وePrimer3 في جناح برامج زخرف ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) لتضخيم المناطق المحيطة رئيسية أو فرعية للهدف الجينات. تم تصميم الاشعال جين معين، R1 وF3، على أساس 5 'و 3' تسلسل الجين المستهدف. وR1 F3 الاشعال تحتوي على تسلسل محول 25-BP في نهاية ال 5 هم 'التي هي مكملة لAPHA-3الجينات. تم تصميم كل درجات الحرارة ذوبان التمهيدي لتكون أقرب ما يمكن إلى 60 ° C لتمكين استخدام زي درجة الحرارة الصلب لجميع ردود الفعل PCR في 96-جيدا الشكل.
2. وقد تم تجميع F1، R1، F3 والاشعال في 96-R3 وحات جيدة تستند إلى أمر الجينات. كل لوحة تحتوي على نوع واحد من الاشعال في ترتيب نفس الجين. تخفيف الاشعال في 96-وحة جيدا التمهيدي تعمل على تركيز النهائي من 10 ميكرومتر لتضخيم PCR باستخدام ماصة الأقنية.

2. عالية الإنتاجية PCR التضخيم والتنقية

1. عالية الإنتاجية لتضخيم 1-KB المنبع أو المصب من S. الهدف الجينات الدم، تجميع خليط كوكتيل PCR على الجليد في أنبوب مخروطي 15-مل تحتوي على 1640 ميكرولتر DDH ₂ O، 250 ميكرولتر العازلة 10xHigh الإخلاص PCR، 200 ميكرولتر من 10 ملي dNTP خليط، 100 ميكرولتر من 50 ملي MgSO _4، 100 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر S. الدم الحمض النووي الجيني SK36 و 10 ميكرولتر البلاتين طق polyme DNArase عالية الدقة ونقل 23 ميكرولتر من الخليط في كل بئر على 96-PCR باستخدام لوحة جيدا ماصة الأقنية. نقل 1 ميكرولتر من كل F1 وR1 (أو F3 وR3) من 10 ميكرومتر العمل التمهيدي لوحات لوحة PCR باستخدام ماصة الأقنية. ختم لوحة PCR التضخيم وأداء في C ° 94 لل1 دقيقة، و 30 ° C دورات 94 لل30 ثانية و 54 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة.
2. إعداد 1٪ agarose هلام يحتوي على إيثيديوم بروميد مع 48 بئرا المناسب الأقنية تحميل ماصة. خلط 4 المنتج PCR ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من العازلة تحميل 5xDNA على 96-وحة جيدا وتحميل العينات في هلام الاغاروز باستخدام ماصة الأقنية 10-ميكرولتر. تشغيل الكهربائي في V 135 لل30 دقيقة. دراسة النطاق على جل الوثائق تحت نظام UVP والتحليل.
3. تنقية المنتجات PCR بنسبة 96 PureLink عدة تنقية PCR باستخدام الطرد المركزي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ليبلغ حجمه DNA، اضافة 40 ميكرولتر معقمة [ده ₂ O إلى البئر لبinding وحة.
4. اختيار عشوائي عدة amplicons تنقيته على لوحة لفحص الحمض النووي باستخدام تركيزات الطيف NanoDrop. ضبط تركيز amplicons على لوحة ل~ 10 نانوغرام / ميكرولتر.
5. يتم هضم البلازميد التي تحتوي على راديو كاسيت ^ص كلم باستخدام EcoR I كقالب PCR. يتم تنقيته من البلازميد يهضم من قبل عدة QIAquick تنقية PCR ويتم ضبط DNA البلازميد إلى خطي تركيز DNA النهائية 10 نانوغرام / ميكرولتر. تجميع 25 ميكرولتر مزيج لAMPLICON كم كاسيت ^R بما في ذلك 16.4 ميكرولتر O ₂ DDH، 2.5 ميكرولتر العازلة PCR 10xHigh الإخلاص، 2 ميكرولتر من 10 ملي dNTP خليط، 1 ميكرولتر من المغنيسيوم 50 مم SO _4، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر F2، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر R2، 1 ميكرولتر الحمض النووي البلازميد و 0.1 ميكرولتر الخطية DNA بوليميراز طق البلاتين الإخلاص عالية. PCR التضخيم في أداء ° C 94 لل1 دقيقة، و 30 ° C دورات 94 لل30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. دراسة المنتج من قبل PCR الكهربائي للهلام الاغاروز على 1٪. برازلا الجزء الأكبر من الكاسيت كم AMPLICON ^R من 10 فرد PCR المنقى من عدة QIAquick تنقية PCR. ضبط تركيز AMPLICON إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر.
6. للحصول على الخطية النهائية AMPLICON PCR المؤتلف، يتم الجمع بين 3 amplicons PCR مع كل ميكرولتر 1 (بكميات متساوية تقريبا، الرحى) في لوحة PCR بئر واحد كقالب PCR. يضاف المكونات الأخرى بما في ذلك 14.4 ميكرولتر PCR O ₂ DDH، 2.5 ميكرولتر العازلة PCR 10xHigh الإخلاص، 2 ميكرولتر من 10 ملي dNTP خليط، 1 ميكرولتر من المغنيسيوم 50 مم SO _4، 1 ميكرولتر من F1 ميكرومتر 10، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر R3، 0.1 ميكروليتر DNA بوليميراز طق البلاتين عالية الدقة. PCR التضخيم يتم تنفيذ في C ° 94 لل2 دقيقة و 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية C ° 55 لمدة 30 ثانية و 68 ° C لحوالي 3.5 دقيقة، و 68 درجة مئوية لمدة أخيرا 4 دقائق.
7. دراسة amplicons PCR على هلام الاغاروز. تنقية وتحديد amplicons PCR على النحو المبين أعلاه. تجميد معاد amplicons PCR في -20 ° C.

3. كومأكفاء خلايا إعداد

1. ويتم إعداد مرق تود هيويت، ودرجة الحموضة المعدل إلى 7.6 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 N، يسخن حتى يغلي ثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتعقيمها باستخدام 0،22 ميكرون تصفية البوليسترين ^4. إضافة 300 ميكرولتر للحرارة المعطل مصل الحصان (تركيز النهائي إلى 2.5٪) إلى 11.7 مل مرق هيويت تود في أنبوب مل 15-المخروطية لتعويض TH + HS المتوسط. TH + HS قسامة المتوسطة في 2 مل و 10 مل في أنابيب.
2. تطعيم 5 ميكرولتر من الأسهم S. SK36 الدم المجمدة في C ° -80 إلى 2 مل المتوسطة TH + HS واحتضان الثقافة بين عشية وضحاها مع السد بإحكام عند 37 درجة مئوية، مصحوبة قبل احتضان 10 مل أنبوب HS-TH +.
3. بعد ليلة وضحاها، تحويل 50 ميكرولتر الثقافة في 10 مل + HS TH واحتضان الأنبوب في C ° 37 ساعة لمدة 3 (الموافق OD ₆₆₀ من 0،07-0،08)، وذلك باستخدام فورا للتحول.

4. تحول الخلايا واختيار المضادات الحيوية

1. إضافة 2 ميكرولتر من 70 نانوغرام S. SK36 تعوض الدمالببتيد تينس تحفيز (CSP) و 2 ميكرولتر الخطية المؤتلف PCR AMPLICON (~ 50 نانوغرام) لأنابيب إيبندورف على ما يرام-96 كتلة وقبل الدافئ لهم في 37 ° C. نقل 330 ميكرولتر من 3 SK36 الثقافة HR-المحتضنة في كل أنبوب. احتضان في C ° 37 لمدة 1 ساعة. استبدال DNA مع العقيمة O ₂ DDH والسيطرة.
2. وضع كتلة على الجليد وتنتشر 100 ميكرولتر من كل القلب ضخ التحول على الدماغ (BHI) لوحة أجار مع 500 ميكروغرام / مل الكاناميسين. احتضان لوحات في C ° 37 لمدة 2 د في ظل ظروف microaerobic.

5. متحولة تأكيد والتخزين

1. لكل متحولة استبدال، واختيار عشوائي بنسبة 2 المستعمرات الفردية، تطعيم مستعمرة في 5 مل تحتوي على 500 ميكروغرام BHI / مل الكاناميسين واحتضان بين عشية وضحاها microaerobically اللقاح في 37 ° C. Cryopreserve كل ثقافة في الجلسرين 30٪ في -80 ° C
2. لدراسة ما إذا كانت تحتوي على متحولة استبدال الجينات المتوقع، نفذ PCR مستعمرة لكل F1 متحولة باستخدام وR3الاشعال في 96-PCR لوحة جيدا. ويستخدم حوالي 1-ميكرولتر الثقافة بين عشية وضحاها من مستعمرة الفردية DNA كقالب في رد فعل التضخيم PCR-25-ميكرولتر. يتم تنفيذ PCR في C ° 94 لل5 دقائق و 35 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 ° C لحوالي 3.5 دقيقة، و 68 درجة مئوية لمدة أخيرا 4 دقائق.
3. لتحديد بالضبط المزدوج الفرقة المسوخ أو الملوثات AMPLICON PCR، ودراسة AMPLICON PCR بواسطة الرحلان الكهربائي لمدة 4 ساعة على> 12 سم طويلة الجل الاغاروز 2٪ مع تلطيخ بروميد إيثيديوم. تحت هذا الشرط الكهربائي الاغاروز هلام، وحددت بوضوح أي amplicons مع الفرق ≥ BP 100. عندما يتوقع العصابات الناتجة عن التضخيم من الكاسيت ^R كم والجين من النوع البري لتختلف باختلاف <100 شركة بريتيش بتروليوم، يتم استخدام التمهيدي T1 الداخلية لتحديد ما إذا كان يمكن الكشف عن الجين من النوع البري بواسطة PCR.
4. لمزيد من تأكيد الحذف، وتنقيته من amplicons بنسبة 96 PureLink عدة تنقية PCR وباستخدام تسلسل التمهيدي الذي P1بربط كاسيت ^ص كيلومتر. إبقاء المسوخ الصحيح الوحيد أكده التسلسل.

النتائج

بعد التضخيم PCR باستخدام بادئات F1 وR1، وF3 وR3، حوالي 1-KB المنبع والمصب لكل S. تم الحصول على الدم في شكل الجينات 96-حسنا، على التوالي (الشكل 2A). لدينا في ظل ظروف PCR وباستخدام البادئات المصممة، تم تضخيم منتج معين من S. الدم في كل الحمض النووي الجيني تفاعل P...

Discussion

للتقليل من الآثار المحتملة القطبية من استبدال جين واحد مع جين المضادات الحيوية المستهدفة الخارجية على الجينات المجاورة، وتتخذ خطوتين بينما التمهيدي الأولي تصميم. بالنسبة لمعظم الجينات حذف، فقد تم تصميم R1 الاشعال وF3 لحذف المنطقة الترميز من 6 BP بعد كودون بدء الغليان ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
التمهيدي F2	تقنيات الحمض النووي المتكاملة	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
التمهيدي R2	المرجع نفسه	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
التمهيدي F2P	المرجع نفسه	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
التمهيدي P1	المرجع نفسه	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
التمهيدي P2	المرجع نفسه	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
التمهيدي 5 'end_R1_seq	المرجع نفسه	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
التمهيدي 5 'end_F3_seq	المرجع نفسه	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
التمهيدي 5 'end_R1p_seq	المرجع نفسه	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	تسلسل: NH2-COOH-DLRGVPNPWGWIFGR
DNA البلمرة	إينفيتروجن	11304-102	DNA طق البلاتين البلمرة العالية والولاء
EcoRI	شركة نيو انغلاند Biolabs	R0101S	تقييد انزيم
آجار	Bioanalytical الأمريكية	AB01185
الاغاروز	Promega	V3125
BHI	BD العلوم البيولوجية	237500	تسريب الدماغ القلب
حصان المصل	فيشر العلمية	SH3007403	حصان المصل
كم	فيشر العلمية	BP906-5	كاناميسين
TH مرق	BD العلوم البيولوجية	249240	تود هيويت مرق
PureLink 96	إينفيتروجن	K310096	PureLink 96 طقم تنقية PCR
QIAquick	QIAGEN	28106	تنقية PCR QIAquick عدة
تصفية	كورنينج	431117	البوليسترين ميكرون تصفية 0،22
نظام Anoxomat	علم الأحياء الدقيقة مارت BV	Anoxomat مارك الثاني
الفوق الطرد المركزي	الحرارية العلمية	75004377	الكتب التي أسطورة RT زائد الدوار صفيحة ميكروسكوبية
جل الوثائق	UVP LLC	BioDoc-IT 210
حاضنة	فيشر العلمية	11-690-625D	Isotemp
Labnet في جل XL	Labnet	E0160	Labnet في جل XL
ميكروسنتريفوج	إيبندورف	22621408	ميكروسنتريفوج 5415 R
الحرارية Scientfic	4661040، 4661020	Finnpipette F1
Cycler الحرارية	شركة النظم البيولوجية التطبيقية	N805-0200	GeneAmp PCR النظام 9700