الإرواء داخل الأوعية من الحبر أسود الكربون تسمح برؤية موثوق من الأوعية الدماغية

Mohammad R. Hasan; Josephine Herz; Dirk M. Hermann; Thorsten R. Doeppner

doi:10.3791/4374

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

تحليل التشريح القوارض الدماغية تلعب دورا مهما في مجال البحوث التجريبية السكتة الدماغية. وفي هذا السياق، فقد اعتبر نضح داخل الأوعية الملونة مع اللاتكس كأداة قياسية لعدة سنوات. ومع ذلك، هذه التقنية يعني القيود التقنية المتميزة، التي تقوض استنساخ لها. هنا، نحن تصف طريقة بسيطة لتصور الأوعية الدماغية بطريقة استنساخه. حقن مزيج من اثنين من الأحبار السوداء الكربون المتاحة تجاريا من خلال نتائج البطين الأيسر في عضلة القلب ملء الأوعية الدماغية كافية من التصور مع التباين العالي. لقد طبقنا بنجاح هذه التقنية لتحديد نقاط تفاغري بين الأراضي الأوعية الدموية الدماغية من الفئران مع خلفيات وراثية مختلفة. وأخيرا نقدم أدلة على أن يمكن الجمع بين هذه الطريقة ورواية بسيطة لتلطيخ السفينة مع كلوريد triphenyltetrazolium (TTC) تلوين - أداة تستخدم على نطاق واسع لمراقبة وتحليل كميات احتشاء في الفئران.

Abstract

التركيب التشريحي للسفن الدماغي هو أحد المحددات الرئيسية لديناميكا الدم في الدماغ وكذلك شدة الاصابة بعد الشتائم الدماغية. الأوعية الدموية الدماغية بشكل حيوي يستجيب لمختلف الدول المرضية في جسم المريض ويجعلها تظهر اختلافات كبيرة بين السلالات وتحت ظروف من التلاعب الجيني. أساسا، وهي تقنية يمكن الاعتماد عليها لتلطيخ السفينة داخل الجمجمة أمر ضروري من أجل دراسة التسبب في السكتة الدماغية. حتى وقت قريب، واستخدمت مجموعة من التقنيات المختلفة لتصور الأوعية الدموية الدماغية بما في ذلك حقن الراتنج اللزوجة المنخفضة، araldite F، مختلطة مع الجيلاتين الأصباغ المختلفة ¹ (أي كارمين الأحمر، الهند الحبر) أو اللاتكس مع ² أو ³ دون أسود الكربون. وقد نضح من مجمع المطاط الأبيض من خلال الأبهر الصاعد لاول مرة من قبل كويل وJokelainen ^3. عدلت مايدا وآخرون ⁽²⁾ وذلك بإضافة بروتوكول كاربون الحبر الأسود إلى مجمع اللاتكس لتحسين التصور المقابل من السفن بعد نضح المياه المالحة من الدماغ. ومع ذلك، من ذوي الخبرة في كثير من الأحيان غير فعالة نضح وشغل كافية من السفن بسبب اللزوجة العالية للمجمع المطاط ^4. لذلك، وقد وصفت لنا تقنية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة باستخدام مزيج من اثنين من الأحبار السوداء الكربون المتاحة تجاريا (CB1 CB2 و) لتصور الأوعية الدموية الدماغية بطريقة استنساخه ^5. وقد أظهرت لنا أن نضح مع CB2 + CB1 في نتائج الفئران في تلطيخ من الأوعية الدماغية أقل بكثير في أعلى كثافة بالمقارنة مع اللاتكس نضح ^5. هنا، نحن تصف بروتوكول لدينا للتعرف على نقاط تفاغري بين الأمامي (ACA) والشرايين الدماغية الأوسط (MCA) لدراسة التغيرات في الفئران السفينة مع خلفيات وراثية مختلفة. وأخيرا، فإننا بيان جدوى أسلوبنا في اتصال عابر نموذج نقص التروية الدماغية في الفئران من خلال الجمع بين CB1 +CB2 بوساطة السفينة تلطيخ مع تلطيخ TTC بدرجات مختلفة من الإصابات الدماغية.

Protocol

1. الحيوانات

وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية NIH لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي وافقت عليها السلطات المحلية. لجميع التجارب، C57Bl6 / J الفئران البرية نوع، ApolipoproteinE ^- استخدمت (ApoE KO) وSV129 الفئران (12-16 أسابيع من العمر، 26-30 غرام من وزن الجسم، 5-6 في المجموعة التجريبية الحيوانات) ^{- /.}

2. تلطيخ من الأوعية الدماغية مع اللثي الملونة

إعداد خليط من 25 ميكرولتر الحبر الكربون الأسود (Herlitz، ألمانيا) مع 0.5 مل من مجمع المطاط (Pebeo، فرنسا) بنسبة 1:20 في أنبوب EP والاحماء الخليط في C ° 37 في حمام مائي. جمع الخليط في حقنة 2 مل مع إبرة 30G-28 من قبل تخدير الحيوان.
حل 50 ملغ من مسحوق هيدروكلوريد papavarine في 1 مل من محلول ملحي معقم طبيعي. جمع المحلول في حقنة الأنسولين. قطع الإبرة من آخر حقنة الأنسولين العقيمة. وضع هذه الإبرة في نهاية C 20PE10 أنبوب مترا. الآن نعلق على هذا الأنبوب PE10 الإبرة من الحقنة تحتوي على الأنسولين papavarine حل هيدروكلوريد ليتم حقنه عن طريق الوريد الفخذي لضمان توسع الأوعية وملء السليم للسفن.
إعداد آخر المحاقن الأنسولين كل منهما يحتوي على 1 مل من محلول ملحي. المحاقن الأنسولين تسمح التسليم السلس لحقن السوائل في مكان محدد. ومع ذلك، ينبغي استخدام بسبب اللزوجة العالية من مادة اللاتكس، البديل 1 مل المحاقن مع الإبر أوسع القابلة للإزالة.
اتخاذ جميع المحاقن المعقمة وأدوات تشريح قريبة من مرحلة التشغيل. نشر ورقة حول درابر الجراحية المرحلة العملية. وينبغي أن المرحلة العملية مضيئة بما فيه الكفاية ويمكن استخدام مجهر التشغيل إذا لزم الأمر.
قياس وزن الجسم الآن على فأرة الحاسوب C57Bl6 / J ثم حمل التخدير مع 5٪ isoflurane يتبخر في 70٪ N ₂ O و 30٪ O _2. تواصل مع التخدير 1٪ من isoflurane تبخيرها. بعد positionin السليمز من الفأرة على ظهرها وتثبيت من أطرافه، وتقييم عمق التخدير. ثم قص الجلد فوق الفخذ الأيسر الوريد والوريد تحديد موقع. إدراج غيض من إبرة حادة وضعت على PE10 أنبوب وحقن ببطء papavarine حل هيدروكلوريد بمعدل من 100 ميكرولتر لكل دقيقة (50 وزن الجسم ملغ / كلغ).
بعد الحقن، وقطع تجويف البطن والحجاب الحاجز بيرس. قطع الأضلاع لفضح القلب دون الإضرار أو كدمات عليه. مقطع الشريان الأورطي الصدري النازل مع ملقط الشريان. اجراء خفض حاد خلال الأذين الأيمن للسماح للتجفيف الدم الوريدي. حقن 2 مل من المياه المالحة إلى البطين الأيسر، تليها حقن المطاط الملونة يدويا مع ضغط طفيف على ثوانى 18-20. استخدام المحاقن المعبأة سلفا واحدا تلو الآخر. تجنب أي فقاعات عن طريق الحقن.
بعد حقن المطاط، وترك الحيوان لمدة 5 دقائق. قطع رأس الحيوان وإزالة بعناية الدماغ كله. رعاية جيدة لا تجرح بنية السفينة وكورتيX أثناء إزالة العظم الجمجمة والسحايا. وضع الدماغ في طبق خلية تحتوي على 60 مم الثقافة 6-8 مل من PFA 4٪ لالتقاط صورة. وضع مسطرة القياس تحت طبق شفافة. التقاط الصور في التكبير 25X من ظهري وبطني من سطح الدماغ مع كاميرا ملحقة المجهر التشغيل. ينبغي أن تؤخذ الصور في زاوية 90 درجة بين طبق بتري والهدف المجهر من أجل تحديد المسافة الأصلي.
كرر الإجراء في آخر الحيوانات 4-5.

3. تلطيخ من الأوعية الدماغية مع خليط من أحبار الكربون الأسود

لمقارنة نتائج تلطيخ اللاتكس القائمة على بروتوكول مع الأوعية الدموية الدماغية لدينا، وإعداد خليط من 100 ميكرولتر من Herlitz Stempelfarbe الحبر (CB1) مع 900 ميكرولتر من شوارز البجع الحبر Scribtol (CB2) في أنبوب 1.5 مل EP. إعداد أنابيب EP اثنين إلى جعل الحجم الكلي للخليط مل 2 من CB1 CB2 وبنسبة 1:9. جمع الخليط في اثنين من محاقن الأنسولين منفصلة (1مل لكل منهما). تتويج للمحاقن ووضعها في حمام مائي في عملية الاحماء إلى 37 ° C. جمع 2 مل من محلول ملحي في آخر المحاقن الأنسولين اثنين، ووضعها في حمام مائي أيضا.
تخدير الحيوان وكرر نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه باستثناء الحقن من هيدروكلوريد papavarine. بعد حقن salaine مل 2 في البطين الأيسر، وضخ مزيج مل 2 من أحبار الكربون الأسود بدلا من اللون اللاتكس. أداء الحقن باليد مع ضغط طفيف على 18-20 ثانية لكل مل. مقطع الشريان الأورطي الصدري النازل قبل الحقن.
التضحية الحيوانية، وإزالة المخ والتقاط الصور.
على المدى الطويل الحفاظ على الدماغ، وطرح في الدماغ PFA 4٪ ثم بين عشية وضحاها من الحضانة مع زيادة تركيز السكروز مع تدريجيا حتى الدماغ العائمة يغطس تماما (5٪ ثم بنسبة 15٪ ثم 30٪). ويمكن أيضا أدمغة الحيوانات perfused مع اللاتكس ملونة يتم الاحتفاظ في نفس الطريق.
أداءالإجراء في آخر الحيوانات 4-5. لمقارنة الفرق في علم التشريح الدماغي الوعائي بسبب الخلفية الجينية المختلفة أو سلالات، كرر ذلك البروتوكول وعدد متساو من KO ApoE والفئران SV129، على التوالي.
لدراسة علم التشريح الأوعية الدموية تحت ظروف الدماغية، لحث عابرة نقص التروية الدماغية البؤرية لمدة 45 دقيقة أو 90 دقيقة وفقا لبروتوكول قياسي من انسداد داخل اللمعة من تحت التخدير العميق MCA (وصفا مفصلا لعملية جراحية خارج نطاق هذه المقالة، و ويشار إلى القارئ Doeppner وآخرون، 2010). في نهاية فترة المخطط ضخه (1 يوم أو 5 أيام)، نفذ تلطيخ الأوعية الدموية مع CB1 CB2 + الأحبار وصمة عار فقط الدماغ كله مع الحل TTC 2٪ في C ° 37 لمدة 5-10 دقيقة لتحديد حجم احتشاء . يتم تقليل TTC لformazan الملونة الحمراء من الانزيمات الميتوكوندريا (نازعة سكسينات خاصة). بعد تلطيخ TTC، وعملية الأيض الأنسجة النشطة البقع الحمراء العميقة في حين أن الأنسجة احتشاء يبقى unstaiNED ويظهر الأبيض بسبب انزيم الميتوكوندريا المختلة وظيفيا والتشويه والتحريف. جمع الصور بنفس الطريقة كما هو موضح أعلاه.

4. دراسة الأقاليم الوعائية الدماغية

لتحليل التشريح الإجمالي للسفن الدماغي والصور من السطح الظهري من الدماغ إما الملون مع اللاتكس أو الملونة CB1 يمكن تحليل + CB2 الأحبار مع برنامج يماغيج (مقرها جافا البرمجيات المستخدمة في المجال العام ومعالجة الصور وتحليلها). قد أدمغة perfused مع اللاتكس ملونة تظهر درجات متفاوتة من تلطيخ السفينة الموجودة على السطح الظهري، في حين CB1 CB2 + نضح وصمة عار جميع السفن على أسطح كل من بطني وظهري.
فتح ملف صورة مع برنامج يماغيج. تحديد جميع النقاط تفاغري بين ACA وMCA و. يتم تعريف نقطة تفاغري كموقع حيث القطر السفينة هو أضيق أو المسافة النصف بين أقرب نقطة المتفرعة من ACA وفروع MCA، على التوالي ^2. رسم خط وهمي (تفاغري خط) عن طريق وضع علامة على النقاط تفاغري بمساعدة رسم خط أداة مجزأة والبرنامج المساعد "خط منقط".
تعيين النطاق في مم. قياس المسافة بين خط وتفاغري خط الوسط في 4 مم الذيلية إلى القطب الجبهي من الدماغ باستخدام أداة رسم خط مستقيم و "التدبير" الأداة. أن تفعل الشيء نفسه في نحو caudally 6 مم من القطب الجبهي. تحليل الصور 3-4 في الحيوان وحساب القيمة المتوسطة. مقارنة القيم بين مجموعات مختلفة من الحيوانات للتعرف على الاختلاف من التشريح الدماغية. في C57Bl6 / J الحيوانات، ويمكن تتبع خط تفاغري بين ACA وMCA كلما اقتربنا من خط الوسط في 4 مم 6 مم مما كان عليه في نحو caudally من القطب الجبهي. سوف ApoE الفئران KO تقديم هناك اختلاف كبير في هذا الصدد. على العكس من ذلك، سوف الفئران في SV129 خط تفاغري تكمن مم وأخرى موازية لخط الوسط سواء في 4 مم و 6 من القطب نحو caudally الأمامية.
لتحليل التشريح الأوعية الدموية طن ظروف الدماغية، نفذ نفس الحسابات المذكورة أعلاه. تحديد الحدود احتشاء الأنسجة والهامش باللون الأحمر والأبيض تمثل الأنسجة النشطة أيضي والأنسجة نخرية غير ملوثين، على التوالي. قياس المسافة من الحدود احتشاء من خط الوسط في 4 مم 6 مم والذيلية في من القطب الجبهي من الدماغ. جمع القيمة المتوسطة من الصور 3-4 في الحيوان. مقارنة النتائج بين نقص التروية مختلفة وفترات ضخه.