دراسة كمية تحرك بحرية من حوض الكائنات الحية الدقيقة باستخدام حيود الليزر

Summary

المجهرية الحية مثل الديدان الخيطية السباحة الحرة C. ايليجانس والعيش والتصرف في بيئة ثلاثية الأبعاد المعقدة. نحن تقريرا عن نهج الرواية التي يقدم تحليلا لل C. ايليجانس باستخدام أنماط الحيود. يتكون هذا النهج من تتبع وتيرة الزمني للأنماط الحيود الناتجة عن توجيه ضوء الليزر عبر كوفيت.

Abstract

التربة والكائنات الحية المجهرية المائية الحية والتصرف في بيئة ثلاثية الأبعاد المعقدة. معظم الدراسات للسلوك الكائن المجهري، في المقابل، أجريت باستخدام المجهر النهج القائمة على، التي تحد من الحركة والسلوك إلى الساحة الضيقة، التنسيق ما يقرب من الأبعاد. ¹ نحن تقديم نهجا جديدا التحليلية التي توفر في الوقت الحقيقي تحليل السباحة بحرية C. ايليجانس في كوفيت دون الاعتماد على المعدات القائمة على المجهر. يتكون هذا النهج من تتبع وتيرة الزمني للأنماط الحيود الناتجة عن توجيه ضوء الليزر عبر كوفيت. نقيس الترددات التذبذب للالنيماتودا السباحة بحرية.

تحليل أنماط الحيود بعيدة الميدان يكشف أدلة حول الطول الموجي من الديدان الخيطية. الحيود هو عملية الانحناء الضوء حول كائن. في هذه الحالة الضوء محلل من الكائنات الحية. موجات الضوء تتداخل ويمكن أن تشكل إعلانiffraction النمط. حقل بعيد، أو فراونهوفر، يتم تشكيل نمط حيود إذا كانت المسافة الشاشة إلى كائن هو أكبر بكثير من الكائن diffracting. في هذه الحالة، يمكن حساب نمط حيود (على غرار) باستخدام تحويل فورييه .. ²

ايليجانس C. أحرار المعيشة التربة التي تعيش الديدان الخيطية التي تنقل في ثلاثة أبعاد. تتحرك كلا على مصفوفة صلبة مثل التربة أو أجار في نمط الحركي الجيبية تسمى الزحف والسائل في نمطا مختلفا دعا السباحة. ³ والأدوار التي تقوم بها المعلومات الحسية التي تقدمها ميكانيكية حسية، حسي كيميائي، والخلايا التي تحكم thermosensory التغييرات التجميلية في الحركي أنماط ومفاتيح في أنماط هي بداية فقط إلى توضيح .. ⁴ وصفنا هذا النهج البصرية لقياس تنقل الديدان الخيطية في ثلاثة أبعاد التي لا تتطلب المجهر وسوف تمكننا من البدء في استكشاف التعقيدات للتنقل الديدان الخيطية تحت المشارك مختلفةnditions.

Protocol

1. C. ايليجانس التحضير لتحليل الفيديو

1. نقل الديدان الخيطية الكبار 10-20 حامل لوحات أجار NGM جديدة بتري مليئة باستخدام رقيقة، والأسلاك المسطحة اختيار البلاتين. أطباق بتري مليئة أجار NGM تحتوي على بقعة صغيرة دائرية من E. القولونية (سلالة النمو المحدود، OP50، ويعطي أفضل النتائج) لالديدان الخيطية لتناول الطعام. السماح للالديدان الخيطية لوضع البيض لمدة 3-5 ساعة ثم قم بإزالة البالغين، وبذلك صغيرة، والثقافة تنمويا، متزامنة من 50-150 الديدان الخيطية. السماح للالديدان الخيطية في النمو إلى مرحلة البلوغ المبكرة من احتضان لوحات بيتري في C ° 20 لمدة 4-5 أيام. وتستند هذه الأساليب الثقافة على إجراءات المعمول بها (Stiernagle 2006) .. ⁵
2. في اليوم من تحليل الفيديو، طرد الديدان الخيطية لوحة من الشباب البالغين مع 1 مل من الماء، منزوع الأيونات المقطر، وجمع بذلك 50-150 الديدان من ثقافة متزامنة. ويمكن أيضا حل العازلة مثل M9 أو PBS استخدامها. استخدام ميكروسنتريفوج تدور ثorms إلى أسفل الأنبوب، أو السماح لهم تسوية عن طريق الجاذبية لمدة 15 دقيقة. إزالة الغالبية العظمى من المياه من الأنبوب واستبدالها مع 1 مل من الماء، منزوع الأيونات المقطر من أجل غسل أي بكتيريا الالتزام من الديدان الخيطية.
3. نقل النيماتودا في الماء أو المخزن المؤقت إلى كوفيت الكوارتز باستخدام micropipette. من المهم العمل مع عدد قليل، عن النيماتودا 5-10 في مجموع في وقت واحد أو أقل وذلك حتى أن أحد الديدان الخيطية في وقت من المرجح أن تكون مضيئة بواسطة الليزر. إذا كان عدد الديدان الخيطية على لوحات ثقافة كبيرة جدا، يخفف من الديدان في الماء أو المخزن المؤقت حتى يتم التوصل إلى الكثافة المطلوبة. ومن الممكن أيضا لاختيار الديدان الخيطية الفردية لقطرة ماء أو المخزن المؤقت على طبق أجار جديدة لغسلها ونقل الديدان الفردية إلى كوفيت. في دراستنا، استخدمنا 1 مم، 2 مم و 5 مم أحجام كوفيت لدراسة آثار القيود الفعلية على السباحة السلوك.

2. البصرية الإعداد لs تحليل الفيديوق

1. أداء الإعداد كما هو موضح في الشكل 1 نانومتر باستخدام 543 (أخضر) الهيليوم النيون (HeNe) الليزر، واثنين من المرايا الألومنيوم الأمامية السطح، حامل كوفيت، شاشة الإسقاط، وكاميرا عالية السرعة (كاسيو Exilim ت عالي السرعة) قادرة من التصوير في FPS 240 ~. وتستخدم اثنين من المرايا لتوجيه شعاع الليزر من خلال كوفيت. ويمكن استخدام أحجام مختلفة من cuvettes تبعا لطبيعة الدراسة. وعلى سبيل المثال، استخدمنا cuvettes التي هي 5 مم لإظهار آثار القيود المكانية على ترددات السباحة. يجب أن شعاع الليزر يستوفي شروط الإفراط؛ أي كائن يجب أن لا تعيق أكثر من ثلث من شعاع الليزر. لC. ايليجانس، يجب أن يكون شعاع الليزر حوالي 2 مم في القطر عندما يتفاعل مع الديدان الخيطية. ينبغي أن لا يكون شعاع الليزر أكبر من 5 مم في القطر منذ نمط حيود سيكون من الصعب العثور عليها. ينبغي أن المسافة من الحي diffracting إلى الشاشة تكون أكبر بكثير منالكائن الحي نفسه.
2. مكان parafilm على الجزء العلوي من كوفيت وعكس ذلك لخلط النيماتودا في عمود الماء. وضع كوفيت في حامل كوفيت بحيث الديدان في البداية بالقرب من الجزء العلوي من كوفيت. باستخدام المرايا، توجيه شعاع الليزر من خلال مركز كوفيت. لأن الديدان الخيطية هي أكثر كثافة من الماء، فإنها تقع ببطء إلى أسفل كوفيت، بينما في الوقت نفسه السباحة في عمود الماء.
3. على لون الإسقاط، شاشة البقعة المقابلة لشعاع الليزر المنقولة السوداء للحد من تشتت وشعاع المنقولة يفي شاشة العرض (الشكل 2). وبدلا من وضع فتحة في شاشة العرض للسماح للشعاع المنقولة لتمرير من خلال الشاشة. والقضاء على أو الحد من تشتت شعاع المنقولة حفاظ على مجموعة من الكاميرا CCD من تشبع نظرا لشعاع المنقولة.
4. لالتقاط مقياس لحجم نمط حيود، رسم خطحوالي 5 سم على شاشة العرض المقبل الى مكان الحادث شعاع الليزر المنقولة دون التدخل في صورة ضوء محلل.
5. بدء التسجيل مع الكاميرا في حين أن ضوء الغرفة على ذلك أن الخط 5 سم على لقطات نفس الصور الحيود. تحويل قبالة ضوء الغرفة. صور الحيود القياسي على الشاشة مع الكاميرا والديدان تمر من خلال شعاع الليزر.

3. الفيديو إعداد البيانات

1. تثبيت برنامج الفيديو التحليل (المسجل برو: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) على الكمبيوتر. استيراد الفيديو في برنامج تحليل الفيديو
2. تعيين الأصل ليتزامن مع بقعة الليزر المنقولة. تعيين النطاق باستخدام سطر 5 سم على شاشة العرض.
3. تتبع التشريد الزاوي للصورة الحيود التي شكلتها كل الديدان الخيطية باستخدام برنامج تحليل الفيديو (الشكل 3)
4. العثور على انجولاص النزوح عن طريق اتخاذ ظل الزاوية القوسي (Y / X)، ونسخة لصق البيانات في جدول بيانات (اكسل) وإضافة 180 درجة أو π لجميع الزوايا السلبية لإنتاج رسم بياني مستمر (Figure. 4).

4. الحصول على البيانات الحقيقية الوقت لمراقبة فورية للترددات سباحة

1. باستخدام نفس الإعداد لتحليل الفيديو، ضع الثنائي الضوئي (DET10A من ThorLabs) مع منطقة صغيرة (~ 1 ملم ²⁾ قبالة مركز في نمط حيود الحق أمام شاشة العرض.
2. توصيل الثنائي الضوئي إلى الذبذبات الرقمية (PicoScope الذي أدلى به التكنولوجيا بيكو) الذي يربط إلى جهاز الكمبيوتر عبر منفذ USB. مراقبة أنماط سحق على شاشة الكمبيوتر.
3. حفظ البيانات المكتسبة في شكل مجموعات ASCII أو النص.

5. تحليل البيانات

1. استيراد البيانات باستخدام الفيديو أو المكتسبة الثنائي الضوئي وإلى تحليل بيانات البرنامج قادر على الطول الموجي المناسب باستخدام خي مربع الحد. البرنامج المستخدم هنا هو الاصل ( http://www.originlab.com/ ). تناسب منحنى الجيبية لتحديد تردد سحق (أرقام 4 و 5).
2. الترددات سباحة متوسط ​​من عينات مختلفة، وتحديد التباين. لهذه الدراسة، تم تحليل البيانات إحصائيا باستخدام ANOVA واحد عامل يليه اختبار Bonferroni مقارنات متعددة. واعتبر A ف قيمة <0.05 ذات دلالة إحصائية.

6. أنماط الحيود باستخدام نموذج الرياضيات كمثال

ملاحظة: يمكن أن تكون على غرار أنماط الحيود باستخدام العديد من الأدوات الحاسوبية المختلفة. وهذا الإجراء تختلف عن الأدوات الحسابية المختلفة مثل Matlab، إكسل، الخ المنشأ

1. إنشاء الصورة: التقط صورا من الديدان الخيطية على شريحة المجهر باستخدام مجهر التقليدي.
2. Binarize الصورة: استيراد "دودة" صورة دودة طn لالرياضيات عن طريق سحب الصورة في الرياضيات. تحويل الصورة إلى صورة بالأبيض والأسود (binarize). ويمكن تحقيق هذا الأمر مع 'Binarize' في الرياضيات: BlackandWhiteImage = Binarize [دودة]. ويمكن بعد ذلك أن ينظر إلى صورة كصورة بالأبيض والأسود.
   بدلا من ذلك، استخدم الأمر "EdgeDetect 'لإنشاء BlackandWhiteImage: EdgeDetect [دودة، 6.0،0.035]، حيث الرقمين زائدة السيطرة على خشونة الحواف الناتجة عن ذلك.
3. تحويل الصورة إلى مصفوفة من أصفار ومنها: ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الأمر "ImageData 'في الرياضيات: مصفوفة = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. تحويل فورييه مصفوفة: استخدام "فورييه" الأمر في الرياضيات لتحويل فورييه المصفوفة باستخدام FourierParameters المبين: FTransform = فورييه [مصفوفة، FourierParameters -> {0، -2}].
5. معامل مربع من المصفوفة للحصول على مصفوفة حيود وتحسين تباين الصورة: ساحة المطلقةقيمة مصفوفة وعرض الصورة الناتجة عن ذلك، والذي هو نمط حيود الموافق الصورة الأصلية. أيضا، استخدم 'سجل' وظيفة لقياس تباين الصورة: صورة ImageContrast = [سجل [1 + (القيمة المطلقة [FTransform]) ^ 2] / 0.5].
6. تغيير حجم الصورة لعرض سهلة: المحاصيل نمط حيود وسط وتغيير حجم كما هو مطلوب: ImageResize [ImageContrast [ص، 100]، 500].
7. مقارنة مع أنماط الحيود غرار أنماط الحيود تم الحصول عليها من الديدان السباحة بحرية. (الشكل 6)

النتائج

وكمثال على ذلك، درسنا C. ايليجانس في الطول الكوارتز 1 كوفيت واسعة، 5 مم و 4 سم كوفيت طويل القامة. أخذ العينات دودة واحدة باستخدام تحليل الفيديو، وتواتر سباحة متوسط ​​تم الحصول عليها من تحليل الفيديو في كوفيت سميكة 5 مم هو حوالي 2.5 هرتز (الشكل 4). وبالمثل، وأخذ العينات دودة واحد باستخدام طريقة الحصول على البيانات الحقيقية الوقت، ونحن الحصول على تردد من السباحة نحو 2.7 هرتز (الشكل 5)، وذلك باستخدام الذبذبات الرقمية (PicoScope). ويمكن تكرار هذا الإجراء للديدان كثيرة. دراسة تفصيلية من الديدان السباحة بحرية كشفت تردد سباحة متوسط ​​يبلغ 2.37 هرتز في كوفيت مم 5 .. ⁶ وكما هو متوقع، وتواتر السباحة أعلى من دودة الزحف (~ 0،8 هرتز) ³ الحيود باستخدام هذا الأسلوب، في الترددات سباحة متوسط ​​C. وقد وجد ايليجانس، والذي يقتصر على شريحة المجهر، لتتناسب مع القيمة التي تم نشرها مسبقا من 2 هرتز. ^1،7

ve_content "> الإجراءات التالية 3) ثم 6.) يسمح للنمذجة أنماط الحيود السباحة بمساعدة من الصور التي تم الحصول عليها مع دودة المجهر التقليدية. وتستخدم أنماط الحيود على غرار لمحاكاة دورة السباحة للايليجانس C. ( الشكل 6). نموذجا ناجحا يتكون من الممكن جسديا أنماط السباحة المتعاقبة مطابقة الترددات السباحة. الدودة يجب أن تكون في نفس الشكل في نهاية دورة السباحة كما كان في بداية دورة السباحة.

الشكل 1. تم استخدام الليزر الأخضر HeNe لخلق نمط حيود الديناميكية باستخدام الحية C. ايليجانس. تم تصوير هذا نمط حيود في 240 إطارا في الثانية.

الشكل 2. ذراع الجناح نقطة سوداء يزيد امتصاص شعاع المنقولة. يتم تقليل التشبع من الكاميرا بسبب الضوء المتناثرة ونمط حيود تصبح مرئية.

الشكل 3. لقطة من الشاشة للفيديو برامج التحليل (المسجل برو) مع دودة نمط حيود التي يتم تتبعها. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 4. بيانات الفيديو المقابلة لدورة السباحة من الديدان الخيطية في كوفيت 5 مم. تناسب منحنى يكشف عن تردد من السباحة هرتز 2.5 ~.

"/>
الشكل 5. البيانات في الوقت الحقيقي المقابلة لدورة السباحة من الديدان الخيطية في كوفيت 5 مم. تناسب منحنى يكشف عن تردد السباحة من 2،7 هرتز ~.

الشكل 6. الصف العلوي يمثل أنماط الحيود الفعلية ويتم مطابقة لأنماط الحيود غرار في الصف السفلي. تم إنتاج أنماط الحيود باستخدام غرار الديدان على شريحة المجهر (الصف الأوسط).

Discussion

وقد وضعنا نهجا جديدا لقياس الوقت الحقيقي من الحركة والسلوك الحركي بسيطة في الكائنات الحية المجهرية مثل الديدان الخيطية التي لا تتطلب استخدام المجاهر. يمكن أيضا ⁸ وهذا النهج المنهجية استخدامها لدراسة الكائنات الحية المجهرية مثل العديد من الأولانيات. ويقتصر هذا الأسلوب فقط من الطول الموجي للضوء المستخدم. يجب أن لا يكون الكائن أصغر من الطول الموجي للضوء. بالإضافة إلى وفورات التكلفة وقابلية المعدات اللازمة، واحد الميزة الرئيسية لهذا النهج هو القدرة على قياس السلوك في الوقت الحقيقي وفي ثلاثة أبعاد، دون قيود ضيقة من طائرات صورة تحت المجهر. من الممكن أيضا مع هذه التقنية لدراسة تأثيرات قوى الجاذبية أو ظروف أخرى عديدة على السلوك الذي لا يمكن دراستها باستخدام المجهر النهج القائمة على .. ⁹ وهكذا، يمكننا تحقيق فهم أفضل لالحركي الدقيق beha الطبيعيةviors تحررت من حدود قطرات المجهر الشريحة أو غرف متخصصة ميكروفلويديك (بارك وآخرون، 2008) ¹⁰

عدم وجود معلومات في مرحلة نمط حيود لا يسمح لاسترجاع المباشر للصورة المقابلة لكائن diffracting منذ نمط حيود بعيدة مجال يتناسب مع مربع القيمة المطلقة للتحويل فورييه. ولذلك نحن حساب أنماط الحيود من الصور الدودة بحيث يمكن مطابقتها مع أنماط الحيود من الديدان الخيطية السباحة بحرية (الشكل 6).

وقد أسفرت نتائج هذه الطريقة لحقا السباحة بحرية C. يمكن تطبيقها على أي ايليجانس والأنواع المجهرية التي مناورات في بيئة شفافة بصريا مثل الماء أو العديد من الحلول الأيونية مختلفة. المجاهر التقليدية لا تسمح الدراسات وعلى عمق التنسيق بناء على أمر من ميكرومتر. ¹¹ هذا ويرجع ذلك إلى محدوديةعمق الميدان عندما تركز الضوء:

حيث F-N عدد لديه علاقة متبادلة مع دائرة الارتباك (ج) بحيث يرتبط بطول قصير التنسيق مع ج كبيرة. ^12،13 في حين أن هذا الأسلوب الحيود هي بالتأكيد ليست بديلا للفحص المجهري التقليدية، وأنها قادرة لتقديم النتائج الكمية بسرعة بحيث يمكن أن يتم التلاعب حتى الأنواع في الوقت الحقيقي بتكلفة منخفضة. يمكن الحصول على أنماط الحيود مع أي مؤشر ليزر. ويمكن تصوير أنماط الحيود في القرار ألف الزمنية انخفاض باستخدام كاميرا رقمية العادية. في حين أن المستخدم قد لا يكون المجهر الضوئي أو متاحة بسهولة ل، يمكن إكمال الأجزاء الرئيسية من هذه التجربة مثل قياس الترددات سحق وتقييم أنماط الحيود بتكلفة منخفضة للغاية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
543 نانومتر ليزر HeNe	ميليس Griot	LGX1	ويمكن استخدام الليزر في أي مجموعة مرئية مع أقل من 5 ميغاواط.
2 ألمنيوم السطح الأمامي مرايا	Thorlabs	PF10-03-F01
كاميرا عالية السرعة Exilim ت	كاسيو
الكوارتز كوفيت	خلايا Starna	21/G/5
LoggerPro (برمجيات)	الورنية مقياس الكسور		http://www.vernier.com/products/software/lp/
8 الرياضيات	التنجستين عنصر فلزي