Method Article
ووصف إجراءات بسيطة وقابلة للتكرار لصنع الكولاجين ثلاث جمعيات متميزة هيكليا من نوع شائع المتاحة تجاريا I مونومر الكولاجين. نوع الأصلي، ويمكن أن تبنى تباعد طويلة ليفية أو قطعي الكولاجين تباعد طويل من خلال تغيير الظروف التي تكون طويلة و300 نانومتر يتعرض 1،4 نانومتر مونومر قطر بنة.
ييفات الكولاجين موجودة في المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة الحيوانية لتوفير السقالات الهيكلية والقوة الميكانيكية. هذه الألياف الكولاجين الأصلي لها دورية مميزة النطاقات من 67 نانومتر ~ وتتكون في الجسم الحي من خلال الجمعية هرمية من نوع الكولاجين مونومرات I، والتي هي 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. في المختبر، من خلال تغيير الظروف التي تكون ويتعرض اللبنات مونومر، يمكن بناء هياكل فريدة من نوعها تتراوح في جداول طول مدة تصل إلى 50 ميكرون، بما في ذلك ليس فقط الألياف نوع الأصلي، ولكن أيضا ليفية طويلة تباعد وقطعي الكولاجين تباعد طويل هنا، نقدم إجراءات تشكيل الكولاجين ثلاثة هياكل مختلفة من مونومر المشتركة الكولاجين متوفرة تجاريا. باستخدام البروتوكولات التي نحن وغيرنا قد نشرت في الماضي لجعل هذه الأنواع الثلاثة تؤدي عادة إلى مزيج من الهياكل. على وجه الخصوص، كانت الألياف عادة و unbandedound عند اتخاذ الكولاجين الأصلية، والألياف الأصلية كانت غالبا ما تكون موجودة عند اتخاذ الليفية الكولاجين تباعد طويل. هذه الإجراءات الجديدة لديها ميزة إنتاج الكولاجين المطلوب نوع يفية على وجه الحصر تقريبا. يتم التحقق من تشكيل الهياكل المطلوبة عن طريق التصوير باستخدام مجهر القوة الذرية.
الكولاجين هو فئة من البروتينات الهيكلية التي يكون لها هيكل ثلاثي حلزونية تكونت من ثلاث سلاسل ببتيد. هذه مونومرات الثلاثي حلزونية تجميع مزيد بطريقة الهيكل التنظيمي لتشكيل هياكل أكبر تدريجيا. هناك ما لا يقل عن 28 أنواع مختلفة وراثيا الكولاجين التي تم تحديدها 1. مجتمعة، تشكل الكولاجين 30٪ من البروتين الكلي وجدت في الحيوانات، مع النوع الأول الشكل السائد المحاسبة لمدة تصل إلى 90٪ من مجموع بروتينات الكولاجين و2. تم العثور على النوع الأول الكولاجين والهياكل fibrillous في الجلد، والأوتار والأربطة والعظام. مجهر القوة الذرية (AFM) والمجهر الالكتروني (EM) صور النوع الأول ألياف الكولاجين الأصلية عادة ما تظهر النطاقات مع فترة 67 نانومتر من سمات ~ (غالبا ما يشار إليها باسم D-النطاقات) 3-5.
النوع الأول الكولاجين مونومر هو heterotrimer حلزونية ثلاثية تتكون من اثنين من α1 متطابقة (I) سلاسل واحد α2 (I) السلسلة، أكثر من كلألف الأحماض الأمينية طويلة. وهو طويل ورقيقة مع أبعاد 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. النوع الأول يمكن الحصول عليها بسهولة مونومر الكولاجين عن طريق تحطيم هياكل تشكلت طبيعيا مرتبة أعلى 6. لقد أظهرنا الكثير من 8-10 7 و غيرها من الجهات التي يمكن بعد هذه مونومر ذوبان كتل بناء يمكن استخدامها لإعادة بناء D-النطاقات الألياف في المختبر (الشكل 1).
بالإضافة إلى الألياف الكولاجين الأصلية، تم العثور على اثنين آخرين الكولاجين أعلى ترتيب لتشكيل الهياكل في المختبر باستخدام بناء مونومر نفس الكتلة. الهياكل هما تباعد طويلة ليفية (FLS) وتباعد طويل قطعي (SLS) الكولاجين (الشكل 1). FLS الكولاجين هو بناء fibrillous مثل الكولاجين الأصلية، ولكن يتميز أكبر من الكولاجين دورية النطاقات المحلية 11. في المختبر، FLS الكولاجين تتشكل عندما يتم الجمع بين مونومر مع الكولاجين بروتين سكري الحمضية α1 12. وقد لوحظ FLS الكولاجين في الجسم الحي أيضا، على الرغم من أن نادرا ما 13. يوصف SLS الكولاجين وcrystallites ليتم محاذاة مونومرات في سجل مثل في الكريستال المشبك 14. SLS تشكل الكولاجين عندما يتم الجمع بين مونومر الكولاجين مع الأدينوساين ثلاثي (ATP) 15. وقد لوحظ التي تحدث بشكل طبيعي SLS الكولاجين في الخلايا الليفية المتوسطة ثقافة ولكن ليس في عينات الأنسجة المستخرجة. الأرجح بسبب صغر حجمها وعدم وجود ميزات الطبوغرافية مميزة 16
والهدف من هذا المخطوط هو تقديم الإجراءات التفصيلية لصنع الألياف الكولاجين الأصليين FLS جيدا وSLS الكولاجين أنه حتى الباحثين الأكثر الحاحا في الخبرة يمكن أن تتكاثر. استخدام المواد المتقدمة المتاحة تجاريا البداية، حاولنا جعل البروتوكولات بسيطة قدر الإمكان والعمل لا يزال يكون لهم بشكل موثوق. ونحن أيضا بالتفصيل كيفية استخدام AFM لوصف بنية الكولاجين مختلفةق التي يتم إجراؤها. وهذا العمل يكون مفيدا للباحثين الذين يرغبون في دراسة واحدة أو أكثر من هذه الهياكل أجل أعلى الكولاجين و / أو استخدامها كما السلائف في تطبيقات أخرى، ولكنها تفتقر حاليا من الخبرات أو ببساطة لا يرغبون في العمل مع عينات الأنسجة.
ملاحظة: المياه المستخدمة في بروتوكولات كل لها مقاومة> 18 MΩ.cm.
1. ييفات الكولاجين الأصلية
2. ليفية الكولاجين تباعد طويل
3. قطعي الكولاجين تباعد طويل
4. AFM توصيف
نوصي أولية 100 × 100 ميكرون 2 المسح الذي ينبغي أن تظهر على الأقل يبني الكولاجين قليلة. من التكبير، وهناك في لمسح أحجام 10 × 10 ميكرون 2 ثم 2 × 2 ميكرومتر 2 إلى مراقبة دورية النطاقات الكولاجين الأصلية وFLS، أو ملامح أدق من الكولاجين SLS. بل هو أيضا فكرة جيدة للتحقق من اثنين على الأقل من مناطق أخرى على عينة الكولاجين للتحقق من أن المسح الأولي تمثل.
الكولاجين الأصلية
خليط التفاعل قدره 0.3 ~ مونومر الكولاجين ملغ / مل في الفوسفات 100 ملم و 100 ملم على بوكل الرقم الهيدروجيني 7 غادر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 3-4 سوف تسفر محلول يحتوي على الألياف الكولاجين الأصلي نوع واضحة ~ 67 نانومتر D-النطاقات، دون الألياف unbanded.
تحت المجهر الضوئي في التكبير × 200، يمكن كتل من الألياف عدة ينظر عادة على الركيزة الميكا خاصة عندما شاهدوا على النقيض من التدخل الفرق (DIC) المجهر (الشكل 2). في عينة نموذجية، 100 × عشوائية سوف تفحص 100 ميكرون 2 من AFM عادة ما تظهر على الاقل الألياف القليلة التي هي ميكرون 5-50 طويلة (أرقام 3A-C). الفردية، يمكن ييفات الكولاجين مفصولة التعرف عليها بسهولة في هذه المرحلة. مع 512 × 512 بكسل مسح الصورة 2، التكبير إلى 10 × 10 ميكرون حجم 2 يبين المسح الضوئي التي تجمعت جميع الألياف (أرقام 3D-F ). من أجل قياس بدقة وتيرة النطاقات، فمن الأفضل للتكبير في حجم 2 × 2 ميكرومتر الفحص 2 (أرقام 3G-I).
يمكن ربط دورية يحددها قياس ببساطة وبلغ متوسط المسافة الطولية بين عدة قمم أو الوديان. بدلا من ذلك، إذا كان البرنامج يسمح AFM، وهو أحد الأبعاد تحويل فورييه على طول المقطع العرضي الطولي يمكن أن تستخدم أيضا. ويبين الشكل 4 صورة ارتفاع ليفية AFM والمقابلة طولية المقطع العرضي.
FLS الكولاجين
سوف خليط التفاعل من 1 بروتين سكري الحمضية μ1 ملغ / مل و~ 1 مونومر الكولاجين ملغ / مل في الماء ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تسفر عن حل لييفات الكولاجين FLS.
يمكن كتل من الألياف، على غرار ما لوحظ في حالة الكولاجين الأصلية، ينظر اليه بسهولة على الركيزة الميكا تحت المجهر الضوئي في 200 م ×agnification. في عينة نموذجية، وعشوائية 100 × 100 ميكرون 2 المسح بواسطة AFM عادة ما تظهر على الاقل الألياف قليلة. مع 512 × 512 بكسل حجم 2 صورة المسح الضوئي، يمكن قياس وتيرة النطاقات من التكبير إلى 10 × 10 ميكرون 2 المسح الضوئي (الشكل 5A) أو بدقة أكثر مع 5C الشكل 2 × 2 ميكرومتر 2 المسح الضوئي (الشكل 5B). يظهر طولية المقطع العرضي ليفية FLS.
SLS الكولاجين
سوف خليط التفاعل من 2 ملغ / مل ATP و~ 0.5 ملغ / مل من مونومر الكولاجين في 100 العازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 3،3 ملم على ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة تسفر عن حل الكولاجين SLS.
عادة، سوف crystallites SLS لا تكون مرئية تحت المجهر الضوئي. مطلوب AFM لتأكيد وجود crystallites SLS. في عينة نموذجية، وعشوائية 100 × 100 ميكرون 2 المسح بواسطة AFM عادة ما تظهر العديد منالنقاط. والتكبير في فحص 10 × 10 2 ميكرومتر عادة ما تظهر عدة SLS crystallites (الشكل 6A). و2 × 2 ميكرومتر 2 المسح الضوئي (الشكل 6B) يبين هيكل أدق من الكريستال SLS.
الشكل 1. والأشكال الثلاثة مختلفة هيكليا من الألياف الكولاجين التي يمكن تشكيلها في المختبر من مونومر الكولاجين. الصور التي تصور AFM مونومر الكولاجين الكولاجين وثلاثة هياكل النظام أعلى على مقياس كل نفس الحجم (2 × 2 ميكرومتر 2).
الشكل 2. الرقمية في صورة ~ التكبير × 200 بواسطة المجهر الضوئي من مدينة دبي للإنترنت الألياف الكولاجين الأصلية على الميكا (أ) لم يمسها و (ب) وشحذ ر thresholdedس تسليط الضوء على الألياف.
الشكل 3. الصور AFM من الألياف الكولاجين الأصلية على الميكا. وتظهر متقطعة الاتصال AFM وضع الصور السعة.
الشكل 4 (أ) 0.5 × 1 ميكرومتر 2 الوضع اتصال متقطع AFM صورة ارتفاع (المقياس العمودي = 100 نانومتر) و (ب) طولية المقطع العرضي ليفية الكولاجين الأصلية.
الشكل 5. الصور AFM من الألياف الكولاجين FLS على الميكا. (أ) 10 × 10 ميكرون 2 اتصل انحراف AFM وضع الصور، (ب) 2 × 2 ميكرومتر 2 اتصل انحراف AFM وضع الصور والطولية (ج)المقطع العرضي ليفية الكولاجين FLS.
الشكل 6. الصور AFM الكولاجين SLS على الميكا. وتظهر متقطعة الاتصال AFM وضع الصور السعة.
تنقية مونومر الكولاجين هو مستقر في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتشكيل الكولاجين الألياف الأصلي ينطوي أساسا رفع درجة الحموضة ودرجة حرارة الكولاجين حل مونومر. وقد وجدت إجراءات لإعادة تشكيل الكولاجين الألياف النطاقات من مونومرات لأكثر من 50 عاما. تلخيص الإجراء الذي مختبرنا المستخدمة في دراساتنا الأولى مع الكولاجين قبل 15 عاما واستند 7 على الإجراءات التي تشابمان وزملاء العمل في 1986 10. وكانت الظروف لتشكيل الكولاجين لييف في هذا العمل في وقت سابق 0.18 مغ / مل من الكولاجين في مونومر نا 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0.2، ودرجة الحموضة 7.4) المخزن المؤقت في 34 ° C. والعيب في هذه وغيرها من الإجراءات التي حاولنا أن هناك الألياف unbanded دائما إلى جانب تشكيل لييفات النطاقات المطلوب. شروطنا الجديدة ~ 0.3 ملغ / مل من الكولاجين في مونومر الفوسفات 100 ملم و 100 ملم على بوكل الرقم الهيدروجيني 7 غادر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 3-4. اإلجراءاتوصف dure هنا يختلف في كل جانب من جوانب من الإجراء في وقت سابق لصنع الألياف الكولاجين الأصلية. ولكن معظم بشكل ملحوظ، ونحن قد تضاعفت قوة الأيونية عن طريق رفع تركيز العازلة وبإضافة 100 ملي بوكل. الزيادة في نتائج القوة الأيونية في تشكيل أكثر اتساقا من الألياف الكولاجين النطاقات حصرا.
في تجربتنا، وكان مرات فقط أن هذا الإجراء لم تنتج الكولاجين نوع الأصلية عندما حل مونومر الكولاجين بعد موعد أوصت الشركة المصنعة للاستخدام. وعندما يحدث هذا، لوحظ ما يتراوح بين أقل الألياف التي unbanded جميع لاحظ العديد من الألياف ولكن لا يزال يغلب عليها الطابع unbanded. نلاحظ أن منتهية الصلاحية مونومر الكولاجين وغالبا ما يزال استخدامها بنجاح لجعل الكولاجين الأصلية، ولكن عندما فشل في ذلك يتعين شراؤها جديدة مونومر بالتأكيد أن الكولاجين.
كان أول من عرف من FLS Highberger وآخرون 17 في التحضيرات الكولاجين لحساب Orekhovicح وآخرون 18. أدى إجراء المزيد من الدراسات وHighberger شميت أن نستنتج أن كان بروتين سكري الحمضية α1 تعزز تشكيل FLS 12. كنا في وقت لاحق قادرة على تكرار الإجراء لصنع الكولاجين من خلال الجمع بين FLS المتاحة تجاريا مونومر الكولاجين وبروتين سكري الحمضية α1 في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحموضة مما يسمح ببطء ليرتفع بنسبة dialyzing الخليط ضد الماء لمدة 24 ساعة 11. نقدم الآن تعديل هذا الإجراء من قبل dialyzing المونمر الكولاجين ضد الماء أولا والجمع ببساطة مع α1 بروتين سكري الحمضية في الماء لتكوين الكولاجين FLS. شروط FLS الكولاجين الجمعية الموصوفة هنا هي اقل بكثير من مضيعة للوقت. ومونومر الكولاجين لا تزال بحاجة إلى أن تكون قبل مدال ضد المياه، ولكن يمكن أن يتم ذلك في معظم وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية حتى ستابلي استخدامها. هذا الإجراء الجديد غلة FLS في الغالب ييفات الكولاجين النطاقات.
من تجربتنا، α1 الحمضية غليكوالبروتين مع البروتين والماء أقل مجتمعة، وفقا للمحتوى الاستدلال أعلى السكر، أمر بالغ الأهمية لصنع الألياف FLS بنجاح. ونحن عادة تحقق مع الشركة المصنعة أن الكثير بروتين سكري الحمضية α1 التي نستخدمها ومجتمعة نسبة البروتين والماء من 82٪ أو أقل. ويمكن كما هو الحال مع الإجراء لتخليق الكولاجين الأصلية، مونومر الكولاجين ما هو قديم جدا يؤدي أيضا إلى عدم إنتاج الكولاجين FLS. وبالإضافة إلى ذلك، على نقاء المياه المستخدمة لغسيل الكلى أمر بالغ الأهمية في هذا الإجراء. على سبيل المثال، غسيل الكلى من مونومر الكولاجين حتى ضد ~ 8 MΩ.cm بدلا من> الماء MΩ.cm 18 نتيجة في حل الكولاجين التي لن تشكل الكولاجين FLS.
ثلاثة أنواع من الكولاجين ليفية، وأسهل لجعل هو SLS الكولاجين. ووصف أقرب إعداد SLS بواسطة شميت وزملاء العمل-15. نشرنا على التكيف من هذا الإجراء قبل 12 عاما لصنع الكولاجين باستخدام SLS كول المتاحة تجارياآجا 14. الإجراء ينطوي ببساطة الجمع بين 2 ملغ / مل و 0.5 ATP ملغ / مل من الكولاجين في مونومر 0.05٪ (V / V) حامض الخليك في درجة الحموضة 3.5، وترك الخليط في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
في تجربتنا، وجانبا مهما من الجمعية SLS التي يجب أن يسيطر هو الرقم الهيدروجيني للمحلول التفاعل. SLS تجميعها في ظروف أكثر الأساسية (درجة الحموضة 3،6-3،9 ~) النتائج المجمعة في كتل من crystallites. أكثر حمضية الظروف (درجة الحموضة 2،9-3،2 ~) النتائج في crystallites أرق، وأكثر من فصل تلك التي جمعت تحت الظروف المثالية من درجة الحموضة 3،3-3،5. بالوسط رد فعل خارج هذا النطاق (<2.8 و> 4) لا تسفر عن أي الكولاجين SLS. في الماضي، نحن تعديل الرقم الهيدروجيني للخليط التفاعل عن طريق إضافة حمض الخليك. لتبسيط الإجراء إلى أبعد من ذلك، في هذه المخطوطة قدمنا منطقة عازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك للسيطرة على الرقم الهيدروجيني.
ثلاثة هياكل مختلفة الكولاجين تكونت من البروتوكولات المذكورة أعلاه لها طابعلا يمكن إلا أن ميزات istic يمكن تمييزها عن طريق الصكوك قادرة على قرار نانومتر. وتتميز الكولاجين الأصلية وFLS من النطاقات دوريات من 67 نانومتر ~ و ~ نانومتر 270. أطول البعد الكولاجين SLS هو مجرد ~ نانومتر 360. وقد وصفت ونحن على وجه التحديد كيفية استخدام AFM لوصف ثلاثة هياكل الكولاجين مختلفة. ومع ذلك، فإن أي AFM التشغيل على اتصال متقطع أو وضع أي اتصال مع التحقيق AFM وجود <دائرة نصف قطرها 10 نانومتر تكون ايضا قادرة على صورة هذه الهياكل الكولاجين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون الإلكترون المجهري واستخدمت لوصف هذه الهياكل الكولاجين 19.
والميزة الرئيسية لهذه الإجراءات هو أنها تنتج في الغالب بناء الكولاجين المطلوب. الشكل الوحيد أخرى من الكولاجين التي وجدت في ردود الفعل هذه هو مونومر انطلاق، التي غالبا ما تكون وضوحا في الخلفية من الصور AFM. في حالة الكولاجين الأصلية وFLS، يمكن انهما انفصلا بسهولة من معظم unreaالمديرية مونومر بواسطة الطرد المركزي المتكررة وغسل الأم أو الناتجة FLS بيليه الكولاجين بالماء.
قدمنا إجراءات بسيطة وموثوق بها لجعل الأم، والكولاجين FLS SLS باستخدام المتقدمة، متوفرة تجاريا المواد الأولية. ومونومر الكولاجين المستخدمة في كل هذه الإجراءات هي متاحة تجاريا في شكل منقى. α1 بروتين سكري الحمضية وATP هي أيضا وكلاهما متاح تجاريا.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
نود أن نشكر جميع الماضي الجامعية كثيرة، طلاب الدراسات العليا وما بعد الدكتوراه الذين ساهموا وقتهم وجهدهم لدراسة تكون الألياف الكولاجين في مختبرنا. قدمت العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا باستمرار تمويل دراسات الكولاجين لدينا.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
المادة / كاشف | شركة | كتالوج رقم | التعليقات (اختياري) |
النوع الأول الكولاجين مونومر (~ 3 ملغ / مل في 0.01 N حمض الهيدروكلوريك) | Inamed المتقدمة Biomatrix | 5409 5005-B | الكثير 1261443 (2.9 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 2.1) الكثير 1629346 (3.2 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 2.1) الكثير 6006 (3.2 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 2.1) |
ATP | الكيميائية الحيوية البحوث الدولية | A-141 | الكثير FBJ-1194A |
α1 الحمضية بروتين سكري من البلازما البقري | سيغما الدريخ | G3643 | الكثير 051K7440 (89.8٪) الكثير 011K7410 (82٪) الكثير 065K7405 (71.2٪) الكثير 063K7495 (71.9٪) الكثير 117K7535 (75.9٪) (البروتين المحتوى المائي +) |
A1-حمض glycoprotein من البلازما البشرية | سيغما الدريخ | G9885 | الكثير 128H7606 (70.9٪) 049K7565V الكثير (68٪) (البروتين المحتوى المائي +) |
الميكا | تيد بيلا | 53 | |
Pointprobe - سيليكون SPM-الاستشعار | Nanoworld | NHC | السيليكون AFM التحقيق التي نستخدمها لوضع الاتصال المتقطع |
نصائح Veeco Nanoprobe | Veeco (بروكر الآن تحقيقات AFM) | NP-S | السيليكون نيتريد AFM التحقيق التي نستخدمها لوضع الاتصال |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved