JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

استخدام وسيفيراز ونظم التصوير في الجسم الحي (IVIS) كوسيلة جديدة لتحديد النقاط النهائية السريرية التطورات المرض قبل أن يحدث. وقد سمح لنا IVIS لتصور في الوقت الحقيقي غزو الفيروسات بالتهاب الدماغ خلال الأيام متعددة، وتوفير نموذج المرض أكثر دقة للدراسة في المستقبل. وقد سمح ذلك لنا أيضا لتحديد ملامح المحتملة واقية من الأدوية المضادة للفيروسات واللقاحات أسرع من النماذج الحيوانية المستخدمة حاليا. القدرة على الاستفادة من الحيوانات الفردية على نقطة زمنية متعددة يضمن متطلبات الحيوانات خفضت، والتكاليف، والاعتلال الكلي للحيوانات تستخدم وسيلة ضمان أكثر إنسانية وأكثر من دراسة علمية المرض.

Abstract

التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير تشجيع مواصلة تطوير وصقل في الطريق ويتم إنجاز البحوث الفيروسية. اقترح في البداية من قبل رسل وبورش في 3Rs هيوم (استبدال، والحد، والصقل)، واستخدام نماذج حيوانية في البحث العلمي تحت ضغط مستمر لتحديد منهجيات جديدة للحد من استخدام الحيوان مع تحسين الدقة العلمية والسرعة. ومن التحديات الرئيسية لمديري هيوم ومع ذلك، هو كيفية ضمان دراسات إحصائية دقيقة مع تقليل المراضة الحيوانية من الأمراض والعدد الإجمالي. الدراسات نجاعة اللقاح تتطلب حاليا عدد كبير من الحيوانات من أجل أن تعتبر ذات دلالة إحصائية وغالبا ما تؤدي إلى ارتفاع معدلات المراضة والوفيات النهاية لتحديد الحماية المناعية. نحن تستخدم في الجسم الحي التصوير أنظمة (IVIS) بالتزامن مع انزيم bioluminescent اليراع لتتبع تدريجيا غزو الجهاز العصبي المركزي (CNS) من قبل سينعقدphalitic الفيروس في نموذج الفئران. عادة، يتطور المرض ببطء نسبيا، ولكن تكاثر الفيروس سريعا، وخاصة داخل الجهاز العصبي المركزي، ويمكن أن يؤدي إلى نتيجة، وغالبا مميتة. بعد العدوى داخل الأنف من الفئران مع TC83 لوك، وهو الموهن الفنزويلي فيروس التهاب الدماغ الخيلي سلالة معدلة ليعبر عن الجين وسيفيراز، ونحن قادرون على تصور تكاثر الفيروس داخل الدماغ على الأقل قبل ثلاثة أيام من ظهور أعراض المرض السريري. استخدام CNS الغزو كمفتاح بالتهاب الدماغ مرض نقطة النهاية التنمية ونحن قادرون على التعرف بسرعة العلاجية وحماية قاح ضد TC83 لوك العدوى قبل ظهور الأعراض السريرية تطوير. مع التكنولوجيا IVIS ونحن قادرون على إظهار اختبار سريع ودقيق من العلاجات واللقاحات المخدرات مع تقليل أعداد الحيوانات والاعتلال.

Protocol

1. إعداد الحيوان

  1. وصول الحيوان: ولدى وصوله إلى مستوى السلامة الأحيائية الحيوانية 2 (ABSL2) المرافق، والسماح الحيوانات ما لا يقل عن 2 يوما ليتأقلم مع بيئته الجديدة. بعد هذه الفترة بقية، وفحص الحيوانات لتقييم صحتهم والمظهر الخارجي بشكل عام.
    1. عند استخدام صحفيين الفلورسنت من المهم أن تضع جميع المواد الحيوانية على نظام غذائي البرسيم مجانا للحد من كمية من تألق ذاتي وGI إشارة الخلفية.
  2. حلاقة الحيوانات: تحسين الكشف عن إشارة bioluminescent من منطقة الجمجمة أثناء التصوير؛ يحلق رؤوس جميع الحيوانات. تخدير الحيوانات مع خليط من غاز الأكسجين وتبخيرها isoflurane. مرة واحدة في تخدير الحيوانات بشكل كامل، استخدم كليبرز الكهربائية لحلاقة رؤوسهم. بعد الانتهاء من الحلاقة مع، والعودة إلى أقفاص الحيوانات ومراقبة للشفاء التام من آثار التخدير.
  3. بيانات الطبيب الحيوينظم الإدراج باقة (BMDS) (بحيث تنعقد بعد الحلاقة من الفئران في حين أن الحيوانات هي تخدير كامل): للحصول على وسيلة أقل الغازية لتتبع زرع درجة حرارة مبرمج مسبقا باقة اللاسلكية BMDS تحت الجلد في المنطقة الظهرية من كل الماوس. هذه المجاوبة تسمح لتحديد اللاسلكية وتسجيل درجات الحرارة. بعد زرع باقة، وتطبيق لاصقة الأنسجة البيطرية الصف على الجرح.
  4. جمع المعطيات الأساسية: قبل الإصابة، تسجيل درجة حرارة خط الأساس والوزن لجميع الحيوانات. جمع الدم للتحليل البلاك تحييد التخفيض (PRNT) من خلال اختبار تنزف (RO) خلف الحجاج في حين أن الفئران هي تحت التخدير. بعد جمع الدم، وتطبيق مرهم العين المضادات الحيوية البيطرية للحد من إمكانية العدوى البكتيرية الثانوية. وينبغي استكمال هذه المجموعة خط الأساس مع مراعاة عدد المرات يتم وضع الحيوانات تحت التخدير بسبب الضغط على الفئران. المستقبل مجموعات RO قhould معها يكتمل بعد التصوير، في حين لا يزال الماوس تحت تأثير مخدر. ينبغي أن الدم التي تم جمعها من أقصى RO يكون حوالي 200 ميكرولتر.
  5. العدوى: الفئران مكان تحت التخدير كما هو موضح سابقا. التخزين المؤقت من خلال تطعيم الطريق داخل الأنف باستخدام جرعة من PFU 6 إلى 7 5x10 5x10-TC83 وسيفيراز في حجم ما مجموعه 40 ميكرولتر من الفوسفات المالحة المخفف (PBS) من خلال العدوى داخل الأنف. بعد العدوى، ضع داخل قفص الفئران السكن ومراقبة الانتعاش.

2. الحيوان التصوير

تنويه: حافظ على الفئران داخل الوحدة السكنية الخاصة بهم، ومجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (BSC)، أو مربع الاحتواء XIC في جميع الأوقات. وBSCS المعتمدة لهذا البروتوكول هي نوع II B1 B2 أو فئة.

  1. حقن جميع الحيوانات مع 10 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم من وسيفيرين (IP) داخل الصفاق بتركيز 15 ملغ / مل.
    1. الفئران تلقي Ampligen أن تكون injecteد IP بجرعة قدرها 12.5 وزن الجسم ملغ / كغ في -4 ساعة عدوى أو آخر العدوى +48 آخر ساعة بناء على جماعتهم.
  2. قبل الحقن مع وسيفيرين، فصل الفئران إلى مجموعات من ثلاثة لضمان تناسب المناسبة ضمن مربع الاحتواء XIC-3.
    1. لجميع والتصوير، واستخدام مرهم العين / زيوت التشحيم لمنع جفاف القرنية في جميع أنحاء الداخلي.
  3. فتح البرنامج واضغط على LivingImage تهيئة لإعداد مربع التصوير؛ مجموعة إنقاذ السيارات، والتعرض لوقت السيارات (زمن التعرض على السيارات هي ميزة جديدة للبرنامج LivingImage 3.2 و أحدث)، عرض الحقل لC، ومرشح لفتح؛ الميدانية ويستند نظر على عدد من الفئران كنت التصوير، ويمكن أن يكون الأمثل تصفية حسب الحاجة لمشاريع التصوير الأخرى.
  4. تأكد من أن الهواء مرشحات الفحم لم منتهية الصلاحية، خزان الأوكسجين ممتلئة، ويتم تعبئة الخزان isoflurane. وضع شرائط صغيرة من الشريط الكهربائي في الاول XIC-3 للمربع تحلول الذي يساعد في تقليل حركة الحيوانات خلال التصوير.
  5. حقن الفئران مع وسيفيرين IP كما هو موضح في القسم 2.1 ومكان داخل غرفة تحريض Isoflurane (مع غطاء فتح) لمدة 3-5 دقيقة.
  6. بعد 5 دقائق، أغلق غطاء للغرفة تحريض وبدء تدفق isoflurane. التي يتم فيها تشغيل مخدر في حوالي 3-5٪ مع معدل تدفق الأوكسجين مجموعة في حوالي 2.0 L / دقيقة. مرة واحدة بشكل كامل وعيه الانتظار 30 ثانية إضافية ونقل الفئران إلى مربع العزلة XIC-3. ضمان سلامة الأحيائية مجلس الوزراء يجري استخدامها يسمح لمسح آمنة من isoflurane كما سيشمل هذا الإجراء فقدان isoflurane من غرفة التحريض (وحدة IVIS يحتوي على قنابل خاصة بها العادلة سلبية واحتواء مربع XIC-3 يربط مباشرة إلى داخل / خارج مآخذ لضمان تدفق الواردة مخدر).
    1. نقل الفئران على أساس رقاقة / المجموعة رقم في خانة العزلة XIC-3 مع موصل إرفاق isofluraneد فتح. وضع الفئران بحيث يتم وضع هذه الطائرات في الاستلقاء القصية مع رؤساء يستريح بلطف على شرائط الشريط.
  7. مسح أسفل مربع الاحتواء XIC بأيد الإيثانول رذاذ، والجزء السفلي من 3-XIC مع cavicide، ونقل إلى غرفة التصوير IVIS. أعد توصيل التخدير إلى مربع الاحتواء مرة واحدة داخل وحدة التصوير.
  8. بعد 10 دقيقة بعد حقن وسيفيرين، صورة الفئران من خلال البرنامج الصورة الحية.
  9. بعد التصوير الأولي مع مرشح فتح، بدء DLIT الأبعاد 3-التصوير باستخدام تحليل تسلسل وصورة لمعالج إعداد وسيفيراز اليراع bioluminescent. هذه العملية سوف تأخذ دقيقة التصوير 4-5 وينبغي أن تستكمل في مجال الرؤية ذات الصلة لعدد من الفئران المطلوب.
    1. فيفو السابقين التحليل التشريح الممكنة التالية وجمع من الدماغ. وضع الدماغ على طبق بتري معقمة، بالتنقيط 50-100 ميكرولتر من وسيفيرين الأسهم على أعلى، ويتم في معهد العالم العربيجينج مربع.
  10. وضع اللمسات الأخيرة في الثانية صورة مرشح مفتوحة في 15-17 دقيقة الإصابة آخر عند الانتهاء من التصوير DLIT. ضمان تحليل تسلسل إيقاف ويتم إرجاع مجال الرؤية وضبط مرشح لالإعدادات السابقة.

3. الفئران العودة وتحليل البيانات

  1. إيقاف المرذاذ isoflurane ونقل مربع الاحتواء XIC العودة الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  2. وضع الفئران مرة أخرى داخل الوحدة السكنية الخاصة بهم، أغلق الأعلى، رش السطح الخارجي مع مطهر والمكان المناسبين مرة أخرى على الرف الإسكان.
    1. وانتعشت ضمان الفئران تماما من التخدير.
  3. كرر الإجراء أعلاه والتجربة يتطلب التصوير حتى اكتمال.
  4. تطهير BSC، إيقاف تشغيل المعدات، ونقل جميع البيانات إلى موقع مختبر خارج لمزيد من التحليل.
  5. تحليل البيانات وتوليد الأبعاد 3-الصور استنادا إلى نتائج IVIS التهاب المسالك البوليةlizing البرنامج LivingImage.
    1. الصورة ضمان موجه بشكل صحيح والإضاءة / تم تعيين لون التوازن. داخل لوحة الأداة الخيارات ادراج صورة ضبط والإصلاحيات ومعلومات الصورة، وأدوات ROI.
    2. استخدام الأشكال ROI لتحديد نقاط القوة إشارة محددة على أساس الموقع.
    3. إعادة بناء تضاريس سطح الجسم لتسليط الضوء على الماوس، 3D تهيئة DLIT إعادة الإعمار، واستخدام مناسبا خطية لضبط الجهاز الخريطة الطبوغرافية لإعادة إعمار.
  6. يمكن أن تكتمل بمزيد من التحليل، من خلال المعايرة الفيروسية جمع الدم والأعضاء. تم الانتهاء المعايرة في هذه الدراسة من خلال تجانس أنسجة المخ في تعديل النسور المتوسطة (MEM). تم تخفيفه بشكل متسلسل في جناسة ونحن المصابة لوحة 6 جيدا من الخلايا فيرو لمدة 1 ساعة. تمت تغطية الخلايا مع تراكب agarose/2xMEM 1.5٪ وحضنت لمدة 2 أيام في 37 درجة. تم إصلاح الخلايا مع الفورمالين 10٪ لمدة 30 دقيقة وملطخةالكريستال البنفسجي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

مع فيروس معدل وراثيا، TC83-وسيفيراز، رأينا زيادة في قوة الإشارة bioluminescent كما تكاثر الفيروس ينتقل من منطقة الأنف في CNS المركزية (الشكل 1). نظرا لمعدل تكاثر الفيروس عالية، ونحن نتوقع أن نرى مستويات عالية من إشارة bioluminescent (الشكل 2A) تعتمد على ناقلات الأمراض ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في حين أن هذا البروتوكول يغطي جوانب التصوير لفي تحليل الجسم الحي، فمن المهم التعرف على ناقلات bioluminescent كعامل أساسي للدراسات المستقبلية. استخدام لدينا من TC83، وهي سلالة اللقاح الموهن من VEEV، كناقل للتعبير عن وسيفيراز يضمن أن يجري انتاج كميات كبيرة من انزيم بسب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

منحة معهد NIH-بالحركة UTMB العلوم 1UL1RR029876-01 وبراثير اليشا لمساعدتها مع تحرير الفيديو لهذه المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
D-وسيفيرين
Isoflurane
Xenogen IVIS نظام (الطيف) الفرجار العلوم الحياتية
XGI-8-الغاز تخدير النظام الفرجار العلوم الحياتية
XIC-3 الاحتواء صندوق الفرجار العلوم الحياتية
LivingImage 4،0 البرمجيات الفرجار العلوم الحياتية
القياس عن بعد / تحديد رقائق الطبيب الحيوية لنظم البيانات IPTT-300 ID الحيوانية والمزاجature
BD انتيغرا حقنة TB 1ML مع 26 GX إبرة 3/8 " فيشر العلمية 305279
التعليم والتدريب المهني لاصقة بوند الأنسجة فيشر العلمية NC9259532
Vetropolycin العيون مرهم ويبستر منتجات البيطرية 78444656
التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة 1X إينفيتروجن 14190-144
BMDS المعالج قارئ الطبيب الحيوية لنظم البيانات DAS-7007S
DAS-HOST البرمجيات الطبيب الحيوية لنظم البيانات تستخدم لتنزيل معلومات التحقيق

References

  1. Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
  2. Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
  3. Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
  4. Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
  5. Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
  6. Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
  7. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
  8. Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592(2009).
  9. Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
  10. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
  11. Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
  12. Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

70 IVIS VEE CNS Neuroinvasion 3Rs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved