A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس
In This Article
Summary
نحن هنا تطوير الأدوات اللازمة لل خارج الحي التصوير الحي لتتبع الانقسامات خلية واحدة في الماوس E8.5 الظهارة العصبية
Abstract
قمنا بتطوير نظام يجمع بين التصوير الحي من علامات الفلورسنت وشرائح زراعة من الظهارة العصبية الجنينية الماوس. ونحن قد استفادت من خطوط الماوس القائمة لخلية تتبع نسب الوراثية: خط جنة المساواة العرقية تاموكسيفين محرض وخط مراسل لجنة المساواة العرقية معربا عن dsRed على إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة. باستخدام مستوى منخفض نسبيا من عقار تاموكسيفين، كنا قادرين على إحداث إعادة التركيب في عدد صغير من الخلايا، والسماح لنا لمتابعة انقسامات الخلية الفردية. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا استجابة النسخي إلى القنفذ الصوتي (صه) إشارات باستخدام Olig2-EGFP المعدلة وراثيا خط 1-3 ونحن رصدها تشكيل أهداب عن طريق إصابة شريحة مثقف مع فيروس معربا عن علامة أهداب، Sstr3-GFP 4. من أجل صورة الظهارة العصبية، ونحن حصاد الأجنة في E8.5، عزل الأنبوب العصبي، شنت شريحة العصبية في ظروف زراعة السليم في غرفة التصوير، وأجرى الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر. لدينا السابقينفيفو طريقة التصوير الحي تمكننا من تتبع الانقسامات خلية واحدة لتقييم توقيت النسبية لتشكيل أهداب الابتدائية واستجابة صه بطريقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هذه الطريقة يمكن تكييفها بسهولة باستخدام علامات الفلورسنت متميزة ويوفر مجال الأدوات التي لمراقبة سلوك الخلية في الوضع الطبيعي وفي الوقت الحقيقي.
Protocol
يصرح باستخدامها فئران بالغة من قبل خلع عنق الرحم الميكانيكية. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من قبل IACUC ولجنة السلامة الأحيائية في جامعة إيموري.
1. الجيل الجنين
- الصليب تاموكسيفين محرض لجنة المساواة العرقية خط، CAGGCreER، وخط مراسل dsRedCre (تيراغرام (CAG-Bgeo، DsRed *-MST) 1Nagy) (الشكل 1) 5،6. لرصد توقيت النسبي للاستجابة صه في الخلايا الوليدة، عبر CAGGCreER وخط dsRed مع Olig2-EGFP BAC الفئران المعدلة وراثيا (تيراغرام (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (الشكل 1) 7،8.
- حل تاموكسيفين في الإيثانول بنسبة 100٪، وأداء حقن داخل الصفاق من 2.5 ملغ تاموكسيفين لكل 40 غرام من وزن الجسم في الإناث الحوامل في الجنينية 6.5 (E6.5) للحث على لجنة المساواة العرقية التعبير ووضع العلامات dsRed في مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا.
- 48 ساعة في وقت لاحق تشريح الأجنة، وتحديد الأجنة إيجابية dsRed باستخدام المجهر الفلورسنت، ونقلها إلى طبق الثقافة وobservه الانقسامات خلية واحدة خلال التصوير خارج الحي (انظر أدناه).
2. كله ماوس الثقافة الأجنة
- تشريح E8.5 الأجنة في مرحلة ما قبل حرارة متوسطة غسل تحتوي على DMEM/F12 (1:1) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الوليد و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (P / S) 9.
- مباشرة بعد تشريح والأجنة مكان على 37 درجة مئوية مرحلة التسخين تحت المجهر الفلورسنت وتحديد وGFP و / أو dsRed إيجابية (انظر أدناه).
- نقل تصل إلى 2 الأجنة إلى 500 قطرة ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة قبل معايرتها تحتوي على الجرذ 50٪ مصل من الذكور سبراغ داولي و 50٪ DMEM/F12 (1:1) دون أحمر الفينول تستكمل مع L-الجلوتامين و 1٪ من 1 M HEPES في 0.85٪ كلوريد الصوديوم وP / S 9.
- تطبيق طبقة رقيقة (0.1 سم) من معايرتها الزيوت المعدنية الخفيفة على المدى المتوسط لمنع التبخر ونقل الطبق الثقافة التي تحتوي على الأجنة إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
3.العدوى الفيروسية
- من أجل أهداب التسمية في الظهارة العصبية، إضافة 5-10 ميكرولتر من Sstr3-GFP الفيروسة البطيئة، ما يقرب من 2 مليون virions، إلى 500 قطرة معايرتها ميكرولتر من مستنبت يحتوي على E8.5 الجنين.
- بعد 18 ساعة من الثقافة، ونقل الأجنة المصابة إلى عدة قطرات من غسل المتوسطة لتغسل الفيروس وتحضير شريحة الأنبوب العصبي.
4. الأنبوب العصبي إعداد شريحة للتصوير لايف
- تشريح الأنبوب العصبي للجنين E8.5 في مرحلة ما قبل حرارة متوسطة غسل باستخدام سكين صغيرة الحجم 0.025 مم، على طبق أجار 1٪ المغلفة.
- وضع معزولة الأنبوب العصبي الجانب البطني أسفل في قطرة 150 ميكرولتر من مستنبت معايرتها دون أحمر الفينول على ملم بولي-L-يسين المغلفة طبق أسفل الزجاج 35.
- وضع كميات صغيرة من 1:1 خليط مصنوعة من 100٪ نقية الفازلين والشمع الذائب (شمعة من IKEA) حول الأنبوب العصبي التي شنت، واضغط بلطف بواسطة قطعة ضيقة من الزجاج ساترة من أجللشل حركة العينة.
- تغطية صحن مع طبقة رقيقة (~ 0.1 سم) من معايرتها الزيوت المعدنية الخفيفة (الشكل 2).
5. يعيش التصوير والوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر
- مكان الطبق تحت A1R الليزر الضوئي نيكون متحد البؤر المجهر المقلوب مجهزة غرفة البيئية التي ينظم درجة الحرارة، وتعيين إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- استخدام 60X الهدف النفط الغمر لتسجيل GFP أهداب الخلايا وصفت وإيجابية dsRed، في حين أن استخدام الهدف النفط الغمر 40X لرصد Olig2-GFP إيجابية الخلايا وdsRed.
- فتح عناصر البرنامج شيكل لاقامة الوقت الفاصل بين التصوير الظروف. كل 10 دقيقة اكتساب Z-مداخن تصل إلى 25 ميكرون مع تباعد من 1.5 ميكرون (الهدف 40X) وحتى 8 ميكرون مع تباعد من 0.4 ميكرون (60X الهدف). استخدام 488 و 561 نانومتر موجات الإثارة وقناة تبث إذا لزم الأمر. الحصول على صور في 512 X 512 حجم. إعداد عدة مناطق المعرفة من قبل المستخدم إدارة النزاهة المؤسسيةerest لأداء تسجيل في وقت واحد.
تم تعديل التعرض الأمثل لقوة الليزر وسطوع الصورة عن طريق استخدام الليزر منخفض الكثافة (ما يصل الى 11٪ للmCherry 561؛ يصل إلى 4.5٪ EGFP 405/488)، سرعة المسح الضوئي 1، 2 متوسط خط وحجم ثقب دبوس (61 ميكرون لdsRED؛ 28.1 ميكرون لOlig2؛ 72 ميكرون لSSTR3GFP؛ 61.3 ميكرون لdsRED وSSTR3GFP؛ 58 ميكرون لdsRED وOlig2). تمكين استخدام للصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا لنا للكشف عن سطوع مع قوة الليزر منخفض. - تحليل البيانات المسجلة باستخدام برنامج 3D Imaris إعادة الإعمار.
6. المناعي
- إصلاح الأجنة أو أنابيب العصبية معزولة في بارافورمالدهيد 4٪ / 0.1 م العازلة الفوسفات على الجليد (4 ° C) لمدة 1 ساعة في طبق زجاج.
- غسل العينات 2 ساعة في برنامج تلفزيوني على الجليد (4 ° C) (تغيير PBS عدة مرات) ووضعها في السكروز 30٪ / 0.1 م العازلة الفوسفات أكثر من ليلة أو حتى الأجنة بالوعة.
- تغرس في أكتوبر، وتجميد الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية. Perform باجتزاء على ناظم البرد (10 مم).
- غسل الشرائح لمدة 10 دقيقة في محلول الغسيل التي تحتوي على 1٪ مصل الأغنام الحرارة المعطل و 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في محلول الغسيل في أعقاب تركيزات: الجرذ وحيدة النسيلة المضادة للRFP (5F8،) 1:200؛ أرنب المضادة للArl13b المصل 1:1500 والماوس وحيدة النسيلة المضادة للArl13b 01:05 (295B/54)؛ أرنب المضادة للOlig2 1:300؛ monoclonals ماوس Pax6، صه وNkx2.2 للجميع 1:10؛ والأرنب بولكلونل Ki67 1:500. إضافة حوالي 150 ميكرولتر لكل شريحة في غرفة ترطيب شقة، وتغطي مع parafilm لتجنب الجفاف وترك أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية.
- غسل الشرائح في حل يغسل ثلاث مرات، في كل مرة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 488، 568، 350 في الحلول يغسل في 1:200 التركيز. استخدام هويشت 1:3،000 أو TO-PRO-3 1:500 إلى نوى وصمة عار. إضافة 150 ميكرولتر لكل شريحة، وترك 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب محمية من الضوء.
- غسل الشرائح في غسل حل TWس مرات، و 30 دقيقة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
- جبل الشرائح في 80٪ إطالة الذهب كاشف مكافحة تتلاشى وعرض في غضون 24 ساعة.
النتائج
هنا أجرينا السابقين فيفو تصوير حي من خلية واحدة الانقسامات داخل الظهارة العصبية الماوس E8.5. لتسمية الخلايا الفردية، ونحن يسببها لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور في مجموعة فرعية من الخلايا التي تحتوي على خط مراسل لجنة المساواة العرقية التي عبرت عن dsRe...
Discussion
نظامنا فيفو السابقين تمكننا من مراقبة مباشرة الانقسامات خلية واحدة داخل الظهارة العصبية النامية في الوقت الحقيقي. وكمثال على ذلك درسنا الانقسامات الخلوية داخل الأنبوب العصبي الجنيني الماوس ومراقبتها إما تشكيل هدب أو استجابة صه. أكدنا نتائج التصوير دينا (ن
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgements
وأيد هذا المشروع البحثي عن طريق الملحق الأذربيجانية، 5 R01 NS056380. وقدم دعم إضافي من خلال ناقلات الفيروسية الأساسية والأساسية الميكروسكوب من إيموري علم الأعصاب NINDS كور المرافق منحة، P30NS055077. نشكر ماوس إيموري المعدلة وراثيا واستهداف الجينات الأساسية لاشتقاق خط الماوس من GENSAT؛ جريج Pazour لمستقر SSTR3-GFP IMCD3 خط الخلية، وبرادلي يودر لSstr3-GFP lentiviral بناء. تم الحصول على الاجسام المضادة من دراسات الإنمائية الضفة هجين، وضعت تحت إشراف معاهد الصحة القومية، والتي تحتفظ بها جامعة أيوا، قسم العلوم البيولوجية، مدينة أيوا، IA 52242. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من قبل IACUC ولجنة السلامة الأحيائية في جامعة إيموري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved