JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ووصف هو عملية وضع العلامات على مرحلتين باستخدام β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) لنقل أزيد من الغلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5، تليها الكيمياء اضغط هنا لرابط نقل البيوتين لتخصيب سهلة وكثافة مستقلة. هذه الطريقة فعالة ووضع العلامات المحددة تمكن من مؤسسة حمد الطبية تخصيب-5 مع خلفية منخفضة للغاية وعالية الإنتاجية عن طريق رسم الخرائط epigenomic الجيل القادم التسلسل.

Abstract

5-ميثيل سيتوزين (5-MC) ~ يشكل 2-8٪ من إجمالي cytosines في الحمض النووي الجيني الإنسان ويؤثر على مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، وصيانة سلامة الجينوم، يطبع الوالدين، تعطيل كروموسوم X-، وتنظيم التنمية، والشيخوخة، والسرطان 1. مؤخرا، تم اكتشاف وجود MC-5 أكسدة، 5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية)، في خلايا الثدييات، وخاصة في الخلايا الجنينية (ES) والخلايا العصبية الجذعية 2-4. يتم إنشاء مؤسسة حمد الطبية من قبل 5-5-أكسدة MC يحفزه TET الأسرة الحديد (II) / α-كيتوغلوتارات التي تعتمد على dioxygenases 2، 3. ويقترح 5-مؤسسة حمد الطبية للمشاركة في الحفاظ على الخلايا الجنينية (MES) الجذعية، تكون الدم العادي والأورام الخبيثة، واقحة التنمية 2، 5-10. من أجل فهم أفضل وظيفة مؤسسة حمد الطبية-5، وهو نظام التسلسل موثوق بها ومباشرة أمر ضروري. يمكن التسلسل بيسلفيت التقليدية لا يميز مؤسسة حمد الطبية 5-5-MC من 11 12.

نحن هنا وصف بسيط من خطوتين الداخلي لوضع العلامات الكيميائية الانتقائي لمؤسسة حمد الطبية-5. في خطوة وضع العلامات الأولى، هو المسمى في مؤسسة حمد الطبية 5-DNA الجيني مع حفز-6-أزيد من الجلوكوز GT-β، وهو من ناقلة الغلوكوزيل عاثية T4، في الطريقة التي ينقل 6 أزيد-الجلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5 من معدلة العامل المساعد، UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). في biotinylation الثانية، الخطوة، تم إرفاق رابط ثاني كبريتيد البيوتين إلى مجموعة من الكيمياء أزيد فوق. كل الخطوات هي محددة للغاية وفعالة، مما يؤدي إلى استكمال وضع العلامات بغض النظر عن وفرة من مؤسسة حمد الطبية في المناطق-5 الجينومية وإعطاء خلفية منخفضة للغاية. بعد biotinylation من مؤسسة حمد الطبية-5، ثم يتم شظايا الحمض النووي 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوية على انتقائي القبضباستخدام الخرز streptavidin بطريقة الكثافة مستقلة. يمكن استخدام الناتج مؤسسة حمد الطبية 5-التخصيب شظايا الحمض النووي لتحاليل المصب، بما في ذلك الجيل القادم التسلسل.

وضع العلامات لدينا انتقائية وبروتوكول القبض يضفي حساسية عالية، تنطبق على أي مصدر من الحمض النووي الجيني مع الكميات المتوفرة من مؤسسة حمد الطبية 5-متغير / متنوعة. على الرغم من أن الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول هو تطبيقه المصب (أي.، الجيل التالي من التسلسل لرسم توزيع 5-مؤسسة حمد الطبية في الجينوم)، وهو متوافق مع جزيء واحد، في الوقت الحقيقي SMRT (DNA) التسلسل، وهو قادرة على تقديم واحدة من قاعدة التسلسل قرار مؤسسة حمد الطبية-5.

Protocol

1. الجينومية DNA تجزئة

جزء الحمض النووي الجيني باستخدام صوتنة إلى مجموعة مناسبة الحجم المطلوب لمنصة تسلسل الجينوم على نطاق. (ونحن عادة يصوتن لشركة بريتيش بتروليوم 300 ~.) تحقق من حجم توزيع الحمض النووي الجيني مجزأة على 1٪ الاغاروز هلام (الشكل 1).

2. إعداد DNA

تحديد المبالغ بدءا DNA يعتمد على وفرة من مؤسسة حمد الطبية-5 في الحمض النووي الجيني. منذ 5-مؤسسة حمد الطبية مستويات تتفاوت تفاوتا كبيرا في أنواع الأنسجة المختلفة، بدءا كميات DNA تعتمد على مستويات 5-مؤسسة حمد الطبية من العينات. يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على أمثلة.

3. β-GT حفز رد الفعل (الجلوكوز نقل رد فعل)

  1. مزيج من pipetting الخليط على النحو المفصل في الجدول 2 واحتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 1 ساعة.
  2. بعد الحضانة، وتنظيف التفاعل مع كيت QIAquick إزالة النكليوتيد، وذلك باستخدام 10 ميكروغرام من الحمض النووي فيالعمود. أزل مع 30 ميكرولتر المياه في عمود والجمع.

4. رد الفعل Biotinylation (انقر الكيمياء)

  1. إضافة DBCO-SS-PEG3-البيوتين حل المتقارن العمل (1 ملم) في الحل DNA مزال (من الخطوة 3) إلى تركيز النهائي من 150 ميكرومتر (أي، 5 ميكرولتر من حل العمل بنسبة 30 ميكرولتر حل DNA).
  2. مزيج من pipetting واحتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 2 ساعة.
  3. تنظيف التفاعل مع كيت QIAquick إزالة النوكليوتيدات. المثل الأعلى هو مجموع حجم شطف 100 ميكرولتر.
  4. قياس كمية الحمض النووي استرداد باستخدام مقياس الطيف ميكروليتر (على سبيل المثال، NanoDrop).

5. القبض على 5-DNA التي تحتوي على مؤسسة حمد الطبية

  1. يغسل 50 ميكرولتر من Streptavidin Dynabeads C1 MyOne 3 مرات مع 1 مل من 1X B & W العازلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. فصل حبات مع موقف المغناطيسي.
  2. إضافة حجم مساو من 2X B & W عازلة لD والمعقدة البيروكسيديز تعافىNA (100 UL) إلى الخرز غسلها.
  3. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لطيف مع التناوب على محور دوار.
  4. فصل حبات مع موقف المغناطيسي وغسل حبات 3 مرات مع 1 مل من 1X B & W العازلة.
  5. أزل الحمض النووي عن طريق احتضان حبات في 100 ميكرولتر من DTT الطازجة 50 مم لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لطيف مع التناوب على محور دوار.
  6. فصل حبات مع موقف المغناطيسي. نضح في وشاطف تحميل على عمود 6 مايكرو الحيوية سبين وفقا لتعليمات تصنيع لإزالة DTT. والهدف هو DNA في حل الآن.
  7. تنقية DNA مزال من الخطوة السابقة من MinElute QIAGEN كيت تنقية DNA PCR وأزل في 10 ميكرولتر من العازلة EB. تحديد DNA باستخدام مقياس التألق و qubit، أو إذا NanoDrop تركيز أعلى من 20 نانوغرام / أيار. الحمض النووي جاهز للالمصب تسلسل الجينوم على نطاق إعداد المكتبة.

6. ممثل النتائج

إذا يا جودةو الحمض النووي الجيني عالية، والمحاصيل الانتعاش بعد نموذجية GT-β وردود الفعل هي biotinylation ~ 60-70٪. ومع ذلك، فإن كفاءة التقاط تتفاوت تفاوتا كبيرا مع أنواع الأنسجة المختلفة اعتمادا على مستويات 5-مؤسسة حمد الطبية من العينات. عادة، وكفاءة لالتقاط الحمض النووي الجيني الدماغ ~ 4-9٪، وفي بعض الحالات القصوى، وكفاءة قد تصل إلى 12٪. لخلايا ES، وكفاءة التقاط متوسط ​​~ 2-4٪، وعلى النقيض من 0.5٪ ~ للخلايا الجذعية العصبية. أقل كفاءة رأيناه حتى الآن كان لمن الحمض النووي الجيني الخلايا السرطانية. جميع DNA المخصب جاهز للمعيار الجيل المقبل من إعداد بروتوكولات المكتبة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن القبض على DNA أن تستخدم قالب في الوقت الحقيقي PCR للكشف عن تخصيب بعض شظايا مقارنة الحمض النووي المدخلات، وإذا كان الاشعال ذات الصلة المتاحة.

figure-protocol-4600
الشكل 1. Sonicated الحمض النووي الجيني الإنسان شظايا فيوsonicated 1٪ الاغاروز هلام. 10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني معزولة عن خلايا الجذع الإنسان في 120 ميكرولتر من 1X العازلة TE باستخدام جهاز صوتنة (Covaris). بعد صوتنة، تم تحميل 2 ميكرولتر من الحمض النووي على جل الاغاروز sonicated 1٪ باستخدام 100 علامة بي بي DNA لمقارنة أحجام شظايا الحمض النووي sonicated.

عنصر حجم تركيز النهائي
ماء ميكرولتر _
10 X العازلة رد فعل β-GT 2 ميكرولتر 1 X
تصل إلى 10 ميكروغرام الحمض النووي الجيني ميكرولتر _ ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر
UDP-6-3-N GLC (3 ملم) 0،67 ميكروليتر 100 ميكرومتر
β-GT (40 ميكرومتر) 1 ميكرولتر 2 ميكرومتر
اجمالى حجم التداول 20 ميكرولتر

ط) للأنسجة الحمض النووي الجيني (الأعلى 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوى> 0.1٪)

عنصر حجم تركيز النهائي
ماء ميكرولتر _
10 X العازلة رد فعل β-GT 10 ميكرولتر 1 X
ما يصل الى 20 ميكروغرام الحمض النووي الجيني ميكرولتر _ ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر
UDP-6-N3-GLC (3 ملم) 1،33 ميكروليتر 100 ميكرومتر
β-GT (40 ميكرومتر) 2 ميكرولتر 2 ميكرومتر
اجمالى حجم التداول 40 ميكرولتر

الثاني) للحصول على الخلايا الجذعية الجينية DNA (متوسط ​​5-مؤسسة حمد الطبية محتوى ~ 0.05٪)

عنصر حجم تركيز النهائي
ماء ميكرولتر _
10 X العازلة رد فعل β-GT 10 ميكرولتر 1 X
تصل إلى 50 ميكروغرام الحمض النووي الجيني ميكرولتر _ ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر
UDP-6-N3-GLC (3 ملم) 3،33 ميكروليتر 100 ميكرومتر
β-GT (40 ميكرومتر) 5 ميكرولتر 2 ميكرومتر
اجمالى حجم التداول 100 ميكرولتر

ثالثا) بالنسبة لسرطان الخلية الحمض النووي الجيني (الأقل 5-مؤسسة حمد الطبية محتوى ~ 0.01٪)

الجدول 1. أمثلة على كميات من المدخلات وردود الفعل DNA وضع العلامات باستخدام عينات مع مستويات مختلفة 5-مؤسسة حمد الطبية من خلال طريقة وضع العلامات الكيميائية انتقائية.

عينة 5-مستوى مؤسسة حمد الطبية بدءا DNA (ميكروغرام) الانتعاش بعد وضع العلامات (المدخلات إلى الخرز) (ميكروغرام) الانتعاش العائد المنسدلة DNA (NG) المنسدلة تسفر
الكبار الماوس المخيخ 0.4٪ 10 7.5 75٪ 236 3.1٪
بعد الولادة المخيخ يوم 7 الماوس 0.1٪ 11 9 82٪ 140 1.6٪
ES الماوس الخلية E14 0.05٪ 60 42 70٪ 350 0.8٪

الجدول 2. نتائج ممثلة من أنسجة وخلايا مخ الفأر ES.

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية) هي التي تم تحديدها مؤخرا الحاضر التعديل جينية في كميات كبيرة في بعض أنواع خلايا الثدييات. طريقة المقدمة هنا هو لتحديد توزيع الجينوم على نطاق مؤسسة حمد الطبية-5. نستخدم عاثية T4-β ناقلة الغلوكوزيل لنقل الجلوكوز إلى شاردة الهندسة يحتوي عل...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (CH GM071440 لوNS051630/MH076090/MH078972 إلى PJ).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم شركة كتالوج # تعليق
الكواشف
5M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) Promega V4221
0.5M حمض pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Promega V4231
1M Trizma قاعدة (تريس) pH7.5 إينفيتروجن 15567-027)
HEPES 1M، pH7.4 إينفيتروجن 15630
كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) 1M Ambion AM9530G
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما D8418
توين 20 فيشر BioReagents BP337-100
DBCO-SS-PEG3-البيوتين المتقارن انقر فوق أدوات الكيمياء A112P3
1،4-Dithiothreitol، عالى النقاء (DTT) Superpure إينفيتروجن 15508-013
QIAquick كيت إزالة النكليوتيد QIAGEN 28304
الدقيقة الحيوية سبين 6 عمود بيو راد 732-6222
Dynabeads MyOne إينفيتروجن 650-01
Streptavidin C1
QIAGEN تنقية PCR MinElute كيت QIAGEN 28004
عالى النقاء الاغاروز إينفيتروجن 16500500
UDP-6-3-N الجلوكوز نشط الحافز 55013
خميرة
β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) نيو انغلاند بيولاب M0357
معدات
صوتنة الجهاز Covaris
سطح المكتب الطرد المركزي
ماء الحمام فيشر العلمية
جهاز تشغيل هلام بيو راد
NanoDrop1000 الحرارية العلمية
Labquake أنبوب شاكر Barnstead
Labquake أنبوب شاكر Thermolyne
الفصل المغناطيسي حامل Promega Z5342
و qubit 2،0 مقياس التألق إينفيتروجن
الإعداد كاشف 10 X β-GT رد الفعل المخزن المؤقت (HEPES 500 مم درجة الحموضة 7.9، 250 ملم MgCl 2) 2 X ضم وتجليد والغسيل (B & W) العازلة (10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA، 2 M كلوريد الصوديوم، توين 0.02٪ 20) .

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , 245-254 (2003).
  2. Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
  3. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
  6. Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
  7. Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
  8. Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
  9. Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
  10. Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
  11. Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
  12. Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
  13. Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
  14. Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
  15. Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
  16. Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
  17. Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
  18. Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
  19. Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
  20. Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
  21. Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

68 5 Hydroxymethylcytosine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved