صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Summary

تصور الخلايا الفردية في أنسجة كثيفة معبأة، مثل خلايا شوان محطة (SCS) عند التقاطعات العصبي العضلي (NMJs)، يمثل تحديا. "متتابع الصورة تبيض" يسمح ترسيم الطوائف المنبوذة محطة واحدة، على سبيل المثال في يزدرع المثلثية العضلات القص، مريحة للأعصاب العضلات إعداد، حيث يمكن الجمع بين متتابعة تبيض مع الوقت الفاصل بين التصوير و ما بعد خاصة immunostainings.

Abstract

متتابعة الصورة تبيض يوفر طريقة غير الغازية لتسمية اللجان الدائمة الفردية في NMJ. وNMJ هي أكبر المشبك الجهاز العصبي في الثدييات وكانت بمثابة توجيه نموذج لدراسة بنية ووظيفة متشابك. في NMJs محطات الماوس محور عصبي السيارات على شكل مواقع الاتصال المملح مع مثل ألياف العضلات. ومغلفة محور عصبي السيارات ومحطة من قبل اللجان الدائمة. على مدى العقود الماضية، وقد ولدت الفئران المعدلة وراثيا لتصور العديد من الخلايا العصبية الحركية والطوائف المنبوذة، على سبيل المثال ^Thy1-1 و XFP حزب العمال التقدمي-GFP الفئران ^2، على التوالي.

على طول محاور عصبية المحرك، يتم ترتيب الطوائف المنبوذة في محور عصبي myelinating السلاميات غير متداخلة، مفصولة العقد من رانفييه، لتمكين قفزي نشر إمكانات العمل. في المقابل، محطة الطوائف المنبوذة في المشبك هي خلايا الدبقية المتخصصة، والتي رصد وتعزيز العصبي، وهضم الحطام محاور عصبية دليل تجديد. وتغطي بإحكام NMJs بنسبة تصل إلى نصف دزينة غير myelinating الطوائف المنبوذة محطة - هذه، ولكن، لا يمكن أن تحل بشكل فردي عن طريق المجهر الضوئي، كما هي على اتصال مباشر الغشاء ^3.

توجد عدة أساليب لتصور فردي الطوائف المنبوذة المحطة الطرفية. أي من هذه لا تشوبه شائبة، وإن كان. على سبيل المثال، صبغ شغل، حيث مخوزق الخلايا واحدة ذات صبغة مسرى مكروي مملوءة، يتطلب تدمير خلية العلامات قبل ملء ثانية واحدة. هذا غير متوافق مع مرور الزمن التسجيلات اللاحقة ^3. وقد تحقق متعددة الأطياف "Brainbow" توسيم الطوائف المنبوذة باستخدام التعبير اندماجي من البروتينات الفلورية ^4. ومع ذلك، هذه التقنية يتطلب الجمع بين عدة جينات منقولة وتحد من نمط التعبير من المروجين المستخدمة. في المستقبل، قد التعبير عن البروتينات "للتحويل الصور" في الطوائف المنبوذة تكون بعد آخر ⁵ بديلة. هنا نقدم الصورة تبيض متتابعة، حيث يتم تبييض الخلايا واحدة، وصورتهم التي حصلت عليها الطرح. نعتقدأن هذا النهج - نظرا لسهولة وبراعة - يمثل إضافة دائم لوحة تكنولوجيا الأعصاب، وخاصة أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي ونقل إلى أنواع الخلايا الأخرى، والمواقع التشريحية أو الأنواع ^6.

في البروتوكول التالية، ونحن من التفصيل تطبيق متتابعة تبيض واللاحقة الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر لمحطة الطوائف المنبوذة في المثلثية إإكسبلنتس العضلات القص. وقد ثبت هذا رقيقة، وتشريح سطحي بسهولة العصبي العضلي إعداد دراسات مفيدة ^ل7،8 التنمية NMJ، علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض ^9. وأخيرا، فإننا شرح كيفية إعداد العضلات القص بعد تثبيت المثلثية لأداء عالية الدقة ترتبط مبائر التصوير، أو الامتحانات التركيبية المناعية.

Protocol

1. المثلثية القص يزدرع (الشكل 1)

التوقيت: 15 دقيقة.

1. إعداد الأدوات الجراحية: 2 أزواج من ملقط، 1 زوج من مقص، 1 زوج من مقص الربيع، 1 صحن زراعة الأنسجة (10 سم). فقاعات مسبقا (حد أدنى لمدة 15 دقيقة) تبريد (4 ° C) حل رينغر مع 5٪ CO _2/95٪ O _2. ملء طبق 15-سم زراعة الأنسجة مع الثلج وتغطية ذلك مع لوحة معدنية. إعداد المجهر تشريح ووضع طبق 15-سم مع الجليد ضمن نطاق تشريح من أجل تبريد يزدرع خلال تشريح.
2. قاتل تخدير الماوس عن طريق جرعة زائدة isoflurane (أو أي وسيلة أخرى يوافق التضحية). رش الفأر مع الايثانول 70٪ لمنع التلوث من الفراء يزدرع. لتبيض SC، استخدمنا حزب العمال التقدمي-GFP الفئران، والتي يمكن أن عبرت OFP3-Thy1 أو Thy1 Membow13 مقابل التصور في وقت واحد من محور عصبي.
3. باستخدام زوج من مقص كبير، وجعل شق خط الوسط منالجلد فوق القص واثنين من شقوق موازية للالحافة السفلية من القفص الصدري.
4. باستخدام زوج من مقص كبير، وإزالة الجلد، وفتح جدار البطن، وجعل شقوق موازية للالقفص الصدري كل في طريق العودة إلى العمود الفقري. ثم تشريح قبالة العضلات الصدرية بجعل شقوق بالقرب من الإدراج في العضلات القص.
5. قطع الحجاب الحاجز مفتوح أسفل الغضروف الخنجري وتشريح قبالة الحجاب الحاجز على طول الإدراج في الساحلية.
6. عقد القفص الصدري بواسطة عملية الخنجري مع مجموعة من الملقط، بدء خفض الأضلاع قبالة العمود الفقري، في أقرب وقت ممكن إلى الإدراج الخاصة بهم. وينبغي خفض اليمين واليسار فوق القلب تتلاقى نحو القص قبضة. في محاولة لتجنب قطع الأوعية الدموية الرئيسية (وخاصة الأوردة تحت الترقوة). ويتحقق من خلال رفع رؤية أفضل بلطف إعداد متمسكا عملية الخنجري بالملقط.
7. جعل خفض عرضية أسفل القص قبضةونقل يزدرع في صحن 10-سم مع تبريد 5٪ CO _2/95٪ O _{2-فقاعات} رينغر الحل. وضع صحن 10 سم على لوحة معدنية تغطي زراعة الأنسجة 15-سم طبق مليئة الجليد. وينبغي أن يتم كل خطوات أخرى تحت المجهر تشريح.
8. باستخدام مقص صغير الربيع إزالة بقايا الغدة الصعترية، غشاء الجنب، والحجاب الحاجز (في الداخل) والعضلات الصدرية (خارج؛ الشكل 1B-D).
9. لتناسب يزدرع إلى الطبق 3.5 سم، تشريح من جميع الأضلاع التي لا تضاف إلى القص. من الأفضل القيام بذلك باستخدام مقص الربيع الصغيرة وقطع الأنسجة في الأضلاع بين (الشكل 1E).
10. يعلقون عليه المثلثية القص العصبي العضلي في يزدرع Sylgard المغلفة 3.5 سم الأنسجة باستخدام دبابيس طبق الثقافة minutien (تقصير لمم 4 <؛ الشكل 1G). يجب أن تذهب من خلال اثنين من المسامير قطع (أبيض) الغضروفية من القص. إدراج ما لا يقل عن اثنين من المسامير من خلال أضلاعه على حد سواء على الجانب الأيسر والأيمن من اليزدرع ه تهدف لقطع ليونة الغضروفية وتجنب الأضلاع تحت أو بالقرب من العضلات المثلثية. يتم استخدام أكثر دبابيس، كان ذلك أفضل (ونحن عادة استخدام 8-10). كما كنت أحدد إعداد، تأكد من أن تنتشر إلى حد ما الأضلاع، وتحديد العضلات في موقف امتدت قليلا.
11. اختياري: تصور المواقع التي تحتوي على مستقبلات أستيل متشابك عن طريق إضافة بنغاروتوكسين بالإضافة إلى الأصباغ اليكسا (تركيز 0.8 ميكروغرام / مل في 5٪ CO ₂ / O 95٪ _{2-فقاعات} رينغر الحل). احتضان يزدرع معقود في طبق Sylgard المغلفة لل15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل عدة مرات مع 5٪ CO _2/95٪ O _{2-فقاعات} رينغر الحل.

2. تبيض الطوائف المنبوذة والاختياري الزمن الفاصل بين المجهري (الشكل 2)

توقيت: 30 - 45 دقيقة + اختياري 1-5 ساعة لمرور الوقت.

1. نقل 3.5 سم Sylgard المغلفة طبق إلى الطرافة المجهر متحد البؤر مجهزةح الأرجون ليزر (488 نانومتر الطول الموجي) والأهداف الغمر بالماء (4X، 0.13 NA؛ 20X، 0.5 NA و100X، 1.0 NA أو 60X، 0.9 NA).
2. اختياري لمرور الزمن المجهر: 3.5 سم إدراج Sylgard المغلفة طبق في حلقة التدفئة، نظام تثبيت superfusion وتحقيق درجة الحرارة (الشكل 2A). تأكد من أن أيا منها لا تلمس يزدرع، حافة الطبق أو طلاء Sylgard. تسخين العينة ل33-35 ° C. لتبيض SC دون مرور الزمن، درجة حرارة الغرفة هو أفضل، كما تظهر خلايا أقل ديناميكية بين الخطوات التبييض.
3. مع مراعاة الهدف الهواء 4X نمط تعصيب من العضلات القص المثلثية والمثلثية تجد الفرقة endplate القص. التبديل إلى الهدف غمس المخروطية 20X والبدء في البحث عن المناطق السطحية داخل الفرقة endplate (الأضلاع المغطي المناطق المرشحة جيدة). تغيير الهدف إلى هدف غمس-100X مخروط أو 60X للاطمئنان على NMJs الفردية. هو مثالي NMJ التي تغطيها عدة الطوائف المنبوذة ويقع superfic جداially (الشكل 2B). إذا كنت تنفذ الوقت الفاصل بين التصوير بعد التبييض، وتحديد ما يصل إلى 3 NMJs التي هي قريبة نسبيا معا لزيادة الغلة.
4. الحصول على صورة مبائر من قبل اللجان الدائمة NMJ الصورة تبيض الفردية (الشكل 2B). (للتصوير كامل القرار، على سبيل المثال على مجهر FV1000 أوليمبوس، استخدم 100X، الهدف NA 1.0 و التكبير 2.5، مما يؤدي إلى نايكست محدودة عينة من 0.1 ~ ميكرومتر لكل بكسل).
5. "بارك" ليزر 488 نانومتر شعاع مركزيا على نواة لاستخدام القوة القصوى SC لمدة 5 ثوان (بدلا من نمط المسح كفاءة في منطقة صغيرة من الفائدة يمكن استخدامها، مثل وظيفة "المسح الضوئي تورنادو" على مجهر أوليمبوس؛ كما نستخدم المجهر متحد البؤر، ويركز الليزر في الصورة طائرات، المتقارن، وبالتالي، في 488 نانومتر مع هدف NA 1.0، <0.5 ميكرومتر في القطر). على الخلية والقاضي تبيض نتيجة إعادة التركيز. إذا كرر الخطوة الضرورية تبيض مرة أخرى حتى مستويات GFP هي الحدد لشبه خلفية المستويات. الحصول على صورة بعد التبييض (الشكل 2C). من الأهمية بمكان التأكد من أن المنطقة هي خارج المبيض أي تداخل بين خليتين - إذا كان هناك تداخل، وسوف تبيض في الخلية الثانية يكون واضحا.
6. كرر الخطوة السابقة حتى جميع ولكن يتم تبييض SC 1 (الشكل 2D-E). و"غير مقصورة" مشاركة SC مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر الوقت الفاصل بين. إعادة بناء الخلايا واحد من الطرح من الصور، على سبيل المثال باستخدام برنامج فوتوشوب، واحد لتحديد SC الصرف والأراضي (الشكل 2F). تكون على علم بأن طرح اثنين السحراء يضيف ضوضاء (مثلا عن طريق استيرادها في "طبقات" على التوالي في فوتوشوب ثم تحديد القناة لأعلى "الاختلاف" في القائمة المنسدلة في أعلى علامة التبويب قنوات). يمكن هذا التحايل باستخدام "تمويه داخلي" وظيفة على القنوات قبل الطرح والاقتصاص من أي الخلفية التي من الواضح أنها لا تنبع منابيض الخلية. لتحسين النقيض من ذلك، يمكن أن يكون من الضروري ضبط سطوع القناتين في إطار "المستويات". الصورة الناتجة من الخلية ابيض هو فرضه على الصورة الأصلية من المشبك، شبه الملونة في هوى فريدة وجعلها شفافة للون أراضي الخلية ابيض في الصورة الأصلية (من فعل هذا لجميع ابيض والأخيرة والخلايا غير مقصورة الصورة هو مبين في الشكل نتائج 2F).
7. اختياري: قم بتشغيل مبائر الوقت الفاصل بين المجهري بعد التبييض لكن كل واحد الطوائف المنبوذة. تأخذ صورة في فترات زمنية محددة (على سبيل المثال كل 5 دقائق إلى 10). استخدام الليزر والطاقة أقل قدر ممكن. ولا يمكن تصوير ما يصل إلى 3 NMJs في الدورة نفسها.
8. عمل خريطة للNMJs الوقت انقضى من خلال اتخاذ صورة في 100X بدون تكبير، ثم صور للمنطقة باستخدام 20X والأهداف 4X (الشكل 2G-I). هناك حاجة لذلك "خارطة" للعثور على NMJs بعد المناعية في عضلة الثابتة.
9. لصورةتجهيز وتحويل الصور الفردية إلى أقصى كثافة التوقعات وحفظ بتنسيق TIFF. الجمع بين جميع Z-المتوقعة الوقت نقطة في كومة ومحاذاة في XY، على سبيل المثال باستخدام "stackreg" المساعد ¹⁰ في فيجي (حزمة استنادا إلى مصدر يماغيج البرمجيات مفتوحة؛ المعاهد الوطنية للصحة).

3. تثبيت والمناعية (الشكل 3)

التوقيت: بين عشية وضحاها.

1. نقل يزدرع في أنبوب مل رد فعل 50-التي تحتوي على ما لا يقل عن 15 مل PFA 4٪ عن طريق إزالة بعناية الدبابيس. بعد إصلاح الجدار الأمامي الصدري الذي يحتوي على العضلات القص المثلثية لل1 ساعة على الجليد. شطف الأنسجة الثابتة مع جليكاين M 0.1 في PBS (لإرواء مثبت المتبقية، وبالتالي تقليل الخلفية) لا يقل عن 10 دقيقة. ويمكن تخزين العينات في هذه المرحلة ومعالجتها في وقت لاحق.
2. نقل يزدرع الثابتة إلى 10 سم Sylgard المغلفة النسيج طبق ثقافة مليئة PBS M 0.01. قطع على شكل شبه منحرف واحد SIدي موازية لعظمة القص والآخر من خلال التحولات العظام إلى الغضروف - وهذا يحتوي على العضلات المثلثية على سطحه. إزالة الأضلاع أقل مع قطع (أي عبر القصية) الأفقي بحيث يمكن في نهاية الذيلية من العضلات المثلثية الوصول بحرية (الشكل 3A-D).
3. اضافة الى وجود إبرة تحت الجلد ودبوس في الجزء العلوي من شبه منحرف (الشكل 3E). استخدام إبرة تحت الجلد تعلق على حقنة 1 مل وملقط لإزالة العضلات المثلثية على سطح من خلال عقد بلطف على زاوية الذيلية من العضلات وباستخدام إبرة ومشرط الصغيرة. تأكد من أن يتم إجراء تخفيضات موازية لطائرة من الجدار الصدري. مرة واحدة يتم تحرير جزء من عضلة الذيلية، إدراج آخر إبرة تحت الجلد ودبوس تحت العضلات من خلال جدار الصدر - وهذا يشل إعداد ويسمح بممارسة سحب لطيف على العضلات باستخدام ملقط (الشكل 3F). كما كنت قطع TISS الضامالإدراج UE، "قشر" بعيدا العضلات من الصدر. قطع المرفقات الذيلية مشاركة مع مقص الربيع. إزالة بقايا سفينة الدهون والدم باستخدام ملقط. يجب الحرص على عدم التمزق بعيدا الأعصاب ملاحظة: استخدام مجموعات منفصلة من الأدوات والأطباق للعمل مع الأنسجة الحية والثابتة.
4. بدء المناعية (باستخدام بروتوكول قياسي) عن طريق نقل عينات الأنسجة إلى حل للحظر 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. حجم أصغر ممكن لتلطيخ هو 200 ميكرولتر باستخدام لوحة 96-أيضا.
5. الأجسام المضادة الأولية مخففة تطبيق في حل حجب، 200 ميكرولتر لكل بئر، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
6. يغسل في 0.01 M 3 مرات لمدة 10 دقيقة PBS.
7. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1-2 ساعة مناسبة في درجة حرارة الغرفة مخففة في عرقلة الحل.
8. يغسل في 0.01 M 3 مرات لمدة 10 دقيقة PBS.
9. جبل في مكافحة يتلاشى المتوسطة (مثل Vectashield) وساترة.
10. الشريحة مكان على لوحة معدنية المغناطيسي، المغناطيس مكان على رأسمن العينة للشد لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها في C. ° 4 ختم بطلاء الأظافر.

النتائج

ويرد مثال على يزدرع القص المثلثية جاهزة للطبق التصوير في الشكل 1G. هذا هو مناسبة خاصة يزدرع لفيفو السابقين التصوير NMJs والعضلات المثلثة يتكون فقط من عدد قليل من طبقات من ألياف العضلات. هذا يسمح بالحصول على صور عالية الدقة من إإكسبلنتس المستمدة من خطوط الم...

Discussion

طريقة تبيض SC المعروضة هنا هي بسيطة وسريعة وتنوعا: (ط) إنه يمكن الكشف عن واحدة SC مورفولوجيا وديناميات بواسطة المجهر متحد البؤر بناء على التحوير واحدة - وهي ميزة كبيرة عندما الجمع بين نهج سبيل المثال مع نماذج المرض التي تتطلب الأليلات إضافية . (الثاني) والطريقة السر?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة (مثال)	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
70٪ (المجلد / المجلد) الإيثانول الحل	روث	T913.1	في زجاجة رذاذ
isoflurane	Forene، ابوت		ويمكن استخدام أي مخدر أخرى يوافق قاتلة للتخدير
الفئران المعدلة وراثيا (حزب العمال التقدمي-GFP)			التي يمكن الحصول عليها من المصادر المشار اليها
المجهر تشريح مع الإضاءة الخفيفة الباردة	OLYMPUS SZ51		مجهزة مع 1500 شوت LCD KL
ملقط #2	أدوات العلوم الجميلة	11233-20
ملقط # 5	أدوات العلوم الجميلة	11295-00
مقص، والطبية الكبيرة	أدوات العلوم الجميلة	14108-09
مقص، ربيع الزاوية الصغيرة	أدوات العلوم الجميلة	15033-09
في خط سخان	وارنر الصكوك	SF-28
التدفئة الدائري ل3.5 سم الأطباق	وارنر الصكوك	64-0110 DH-35
2 التحكم في درجة الحرارة قناة النظام	وارنر الصكوك	TC-344B
superfusion مضخة نظام			مبنية خصيصا
15-سم طبق زراعة الأنسجة	Sarstedt	83.1803.003	مليئة الجليد والتي تغطيها لوحة معدنية
10-سم طبق زراعة الأنسجة	Sarstedt	83.1802.003	مع حل رينغر الاوكسيجين في
3.5 سم طبق زراعة الأنسجة	Sarstedt	83.1800.003	مليئة البوليمر Sylgard
Sylgard البوليمر	داو كورنينج	Sylgard إلاستومر سيليكون 184 كيت
مبائر المجهر	OLYMPUS	FV1000	مع الأرجون ليزر
50-مل أنبوب رد فعل	Sarstedt	62.547.254 PP
4 PFA٪ في برنامج تلفزيوني	سيجما	P6148
قنية 0.5 مم × 25 مم	Neolab	E-1510
حقنة 1 مل	Neolab	E-1496
synaptophysin العصبية الأجسام المضادة	إينفيتروجن	18-0130	أرنب
الأجسام المضادة الثانوية	إينفيتروجن	A-11012	الكسا 594
24 لوحة جيدا	Sarstedt	83،1836
0.01 متر PBS	سيجما	P4417
0.1 M جليكاين في برنامج تلفزيوني	روث	3790،1
coverslips	Neolab	E-4132
الشرائح	Neolab	E-4121
Vectashield	ناقلات مختبرات	H-1000
دبابيس minutien × 10	أدوات العلوم الجميلة	26002-20	لتقصير مم 4 <
α-بنغاروتوكسين بالإضافة إلى 594 اليكسا	إينفيتروجن (مجسات الجزيئية)	B-13423
			منع الحل
0.01 M PBS
0.2٪ تريتون-X100	روث	3051،3
10٪ مصل الماعز العادي	Abcam	ab7481
1٪ الأبقار مصل الزلال	سيجما	A7030
			قارع الأجراس فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO 2
125 مم كلوريد الصوديوم	سيجما	S7653
2.5 ملم بوكل	سيجما	P9333
1.25 مم ناه 2 ص 4	سيجما	S8282
26 مم 3 NaHCO	سيجما	S6297
2 مم CaCl 2	سيجما	21114
1 ملم MgCl 2	سيجما	63020
20 ملي الجلوكوز	سيجما	G7528
			الجدول 1. الكواشف محددة والمعدات.