A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ
In This Article
Summary
تطوير optogenetics يوفر الآن وسيلة لتحفيز الخلايا العصبية بدقة تعريف وراثيا ودوائر، سواء في المختبر و في الجسم الحي. نحن هنا وصف للجمعية وزرع من الألياف البصرية لضوئي مزمن في أنسجة المخ.
Abstract
وكانت أنماط توضيح من اتصالات الخلايا العصبية تحديا لعلم الأعصاب على حد سواء الأساسية والسريرية. وكان معيار الذهب الكهربية لتحليل أنماط الاتصال متشابك، ولكن التسجيلات الكهربية يمكن أن تكون مقترنة مرهقة والحد تجريبيا. وقد أدخلت تطوير optogenetics طريقة لتحفيز الخلايا العصبية أنيقة ودوائر، سواء في المختبر 1 و 2،3 في الجسم الحي. من خلال استغلال خلية من نوع النشاط المروج محددة لدفع السكان في التعبير أوبسين العصبية منفصلة، يمكن للمرء أن تحفز الخلايا العصبية بدقة فرعية محددة وراثيا في دوائر متميزة 4-6. الأساليب المذكورة لتحفيز الخلايا العصبية بشكل جيد، بما في ذلك التحفيز الكهربائي و / أو التلاعب الدوائية، وغالبا ما تكون الخلايا من نوع العشوائي، الغازية، ويمكن أن تلحق الضرر الأنسجة المحيطة بها. يمكن تغيير وظيفة هذه القيود متشابك العادية و / أو السلوك الدائرة. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلكلطبيعة التلاعب، والأساليب المتبعة حاليا في كثير من الأحيان حادة والمحطة الطرفية. Optogenetics يتيح القدرة على تحفيز الخلايا العصبية بطريقة غير ضارة نسبيا، وتستهدف في الخلايا العصبية وراثيا. معظم الدراسات التي تنطوي على استخدام الجسم الحي في optogenetics حاليا الألياف البصرية من خلال الاسترشاد قنية مزروع 6،7، ولكن القيود المفروضة على هذه الطريقة تشمل تلف أنسجة المخ مع تكرار الإدراج من الألياف البصرية، والكسر المحتمل للألياف داخل قنية. نظرا لحقل يزدهر optogenetics، وهي طريقة أكثر موثوقية من التحفيز المزمن هو ضروري لتسهيل الدراسات طويلة الأجل مع الحد الأدنى من ضمانات تلف الأنسجة. هنا نقدم بروتوكول لدينا تعديل في مادة الفيديو لاستكمال أسلوب فعال وأنيق وصفها في سبارتا وآخرون 8 لتصنيع الألياف البصرية على زرع وتثبيت الدائم على الجمجمة من الفئران تخدير، وكذلك جمعية ليفمقرنة البصرية يربط زرع لمصدر الضوء. عملية الزرع، مرتبطة مع الألياف البصرية إلى ليزر الحالة الصلبة، ويسمح لوسيلة فعالة لphotostimulate مزمنة الدوائر العصبية الوظيفية مع أقل تلف الأنسجة 9 باستخدام، للانفصال الصغيرة، الحبال. تثبيت الدائم للزراعة وتوفر الألياف البصرية متسقة، على المدى الطويل في الدراسات المجراة optogenetic الدوائر العصبية في الفئران، مستيقظا يتصرف 10 مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة.
Protocol
* يتم سرد جميع المواد المصنعة منها جنبا إلى جنب مع و / أو البائعين تحت البروتوكول.
1. جمعية زرع
- إعداد خليط من الايبوكسي للحرارة قابل للشفاء الألياف البصرية عن طريق إضافة 100 ملغ من تصليب إلى 1 غرام من الراتنج.
- قياس وقطع حوالي 35 مم من الألياف البصرية مع ميكرومتر 125 ميكرون الأساسية 100 من سجل ذلك مع الكاتب كربيد تلميح إسفين. وضع عمودي الكاتب إلى الألياف البصرية ونقاط في حركة واحدة أحادي الاتجاه. قطع الألياف سيضر تماما جوهر الألياف.
- وأشار الجانب المحدب إدراج السيراميك LC الطويق 127 ميكرومتر مع تحمل في الرذيلة، إلى أسفل.
- إدراج الألياف البصرية في الطويق. يجب أن تنزلق في الألياف البصرية بسلاسة وتبرز قليلا إلى ما بعد نهاية محدبة من الطويق (الشكل 1A).
- تطبيق قطرة واحدة من الألياف الايبوكسي للحرارة قابل للشفاء البصرية إلى نهاية مسطحة والحرارة مع بندقية الحرارة حتى الايبوكسي سوداء. ينبغي للالايبوكسيملء الطويق وتسخينها وعلاج من قبل. ينبغي أن الايبوكسي علاج داخل حد أدنى 1 ~ من تطبيق الحرارة ثابتة.
- اي نظيفة من الايبوكسي على طول جانبي الطويق، لأنها سوف تعيق التواصل مع مقرنة.
- تلميع نهاية محدبة من الطويق باستخدام الألياف البصرية LC قرص تلميع (FOPD) على أوراق أكسيد الألومنيوم على منصة تلميع تلميع (1B الشكل). جعل أنماط دوران دائري والبولندية أربع درجات في الترتيب التالي: 5، 3، 1 ميكرومتر حصى 0.3.
- قطع الألياف البصرية في نهاية شقة لطول مناسب بحيث تستهدف المنطقة من الفائدة. يمكن تحديد طول باستخدام أطلس التجسيمي.
- اختبار عملية الزرع من خلال توصيله إلى الليزر عبر سلك وصلة الربط هو موضح أدناه. يتم إدراج نهاية مصقول من زرع في كم من مقرنة، وينبغي اجراء اتصالات مباشرة مع الطويق معارضة. يجب أن تكون قادرة على زرع الاحتفاظ ب 10 ميغاواط من ناتج الضوء، ويقاس على الحافة من اله زرع الألياف. وسوف يكون سيئا زرع نقطة ضعف التنسيق بالقرب من غيض من الألياف البصرية.
- تخزين يزرع النهائية (الشكل 1C) في رغوة حتى الاستخدام.
2. جمعية الألياف البصرية الحبل المقرنة
- إعداد خليط من الايبوكسي للحرارة قابل للشفاء الألياف البصرية على النحو الوارد أعلاه.
- قياس وقطع بطول مناسب من الألياف البصرية مع ميكرومتر 220 ميكرون الأساسية 200 بواسطة يحرز ذلك مع الكاتب كربيد تلميح إسفين. وينبغي أن طول الألياف تسمح الماوس على التحرك بحرية في جميع أنحاء السكن ولكن لا يسمح الماوس لمضغه من خلال الألياف.
- إدراج الألياف البصرية في طول أنابيب منفرق أطول قليلا من طول الألياف البصرية. ينبغي أن يكون لها أنابيب قطرها الداخلي أكبر قليلا من الألياف البصرية.
- ~ 25mm في قطاع احدة من نهاية الألياف البصرية وأدخله في نهاية معدنيه MM FC المتعدد الطويق الجمعية مع 230 ميكرومتر تحمل حتى تتوقف. ينبغي أن يلتزم بها الألياف البصرية من خلال ferruجنيه نهاية (الشكل 2A).
- تأمين الاتصال مع CYANOACRYLATE (سوبر الغراء) في نهاية المعادن. تغطية يتصل الحذاء رابط وتلميع نهاية الطويق مع FOPD FC. جعل أنماط دوران دائري والبولندية على أربعة درجات في الترتيب التالي: 5، 3، 1، 0.3 ميكرومتر الحصباء (الشكل 2B).
- تجريد وإدراج الطرف الآخر من الألياف البصرية إلى الطويق السيراميك LC (230 ميكرومتر معرف تتحمل) مع نهاية محدبة البعيدة. تطبيق قطرة من الايبوكسي إلى نهاية مسطحة والحرارة حتى يشفى.
- تلميع نهاية محدبة من الطويق باستخدام FOPD FC على رقائق الألمونيوم تلميع أكسيد كما هو موضح أعلاه.
- حرك كم والطويق LC عن نهاية محدبة من الطويق حتى منتصف الكم.
- مكان انكماش الأنابيب خلال أنابيب منفرق والأكمام والحرارة لتأمين وحماية الاتصال (الشكل 2C).
- اختبار وصلة الربط من خلال توصيله إلى مصدر الليزر وقياس الضوء outpالتحرير من خلال مقرنة مع الطيف. ينبغي أن فقدان ضوء الليزر الناتج بين والإخراج مقرنة قياس لا تتجاوز 30٪.
3. زراعة الجراحية
* هذا الإجراء نصائح فقط. أدوات معقمة قفازات ولكن لا تحتاج إلى أن تكون بسبب التلاعب المستمر بين أجهزة وأدوات ومعدات.
- تخدير الماوس مع خليط داخل الصفاق الكيتامين / زيلازين حقن 100 و 10 مغ / كغ على التوالي باستخدام إبرة قياس 30-.
- حلق فروة الرأس مع كليبرز. مسح فروة الرأس مع الكحول 70٪ الآيزوبروبيل تليها Betasept مسح (4٪ محلول كلورهكسيدين) لمدة دقيقة، وتكرار مرة واحدة.
- ضع الماوس في تلاعب sterotaxic وتأمين الرأس، وضمان أن الجمجمة هي المستوى. تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع جفاف والألم بعد الجراحة. الحفاظ على التخدير باستخدام volatized isoflurane (1-3٪ المخفف مع الأكسجين تبعا للحالة الفسيولوجية للمذكرة التفاهمحد ذاتها، التي ينبغي رصد مستمر من قبل ردا على قرصة الذيل).
- من خلال إجراء شق خط الوسط من فروة الرأس، ويعرض الجمجمة من مدارات العين لامدا. دفع جانبا النسيج الضام عند الضرورة.
- استخدام المشابك سيرافين لابعاد الجلد والحفاظ على الوصول إلى الجمجمة (الشكل 3A).
- حفر نمط متقلب في جميع أنحاء سطح الجمجمة مع اختيار الأسنان. غسل الحطام بعيدا مع ملحي معقم. يجف تماما.
- تطبيق بيروكسيد الهيدروجين (3٪) إلى الجمجمة تعرض مع مسحة القطن لثانية 2-3 ~ لخلق micropores. يغسل عدة مرات ويجف تماما. وبدلا من ذلك، يمكن مشدود المراسي في الجمجمة، كما هو موضح في سبارتا وآخرون. (2012).
- مرة أخرى، وجود نمط متقلب حفر في جميع أنحاء الجمجمة مع اختيار الأسنان ويغسل بمحلول ملحي الحطام. يجف تماما.
- باستخدام أداة دوارة، وجعل ثقب صغير لدغ حج القحف (<1 مم في القطر) مع قمة الحفر العقيمة(تعقيمها) فوق المنطقة ذات الاهتمام، والتي تحددها الأطلس التجسيمي لمعايرة bregma وامدا. يجب الحرص على عدم كسر أو تلف أي الجافية الأنسجة. يغسل الحطام ويجف تماما.
- إدراج الطويق الألياف البصرية (زرع) في ماسك التحقيق والاتصال الذراع التجسيمي.
- وضع الزرع في المكان مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام باستخدام ذراع التجسيمي (الشكل 3B). إذا إدخال الألياف البصرية في أنسجة المخ، ينبغي تقدمت ببطء الألياف بمعدل 2 مم ~ / دقيقة. ينبغي أن يقوم على الطويق الجمجمة المتبقية.
- إعداد خليط من الاسمنت الأسنان. يجب أن يكون الخليط اللزوجة منخفضة بما فيه الكفاية لتطبيق بسهولة عبر الجمجمة. وسوف تكون قابلة للاستخدام خليط لمدة 2-4 دقيقة.
- باستخدام مسواك العقيمة، وتطبيق طبقة رقيقة من الاسمنت حتى الأسنان عبر الجمجمة وعلى الجزء السفلي من عملية الزرع. ينبغي للقاعدة طبقة من الاسمنت الأسنان تغطية أكبر قدر مساحة على الجمجمة كماممكن. لا تدع الاسمنت الأسنان تتلامس مع الجلد من الفأرة. وهذا يؤدي إلى صعوبة في زيادة خياطة وكذلك تهيج في الماوس. إذا كان الأسمنت الأسنان لا تأتي في اتصال مع الجلد، واتركه حتى يجف جزئيا بحيث يمكن مقشر طبقة من الاسمنت قبالة كامل قبل الإعداد.
- اتركه حتى يجف تماما.
- تطبيق طبقات من الاسمنت حتى الأسنان لتشكيل التلة الصغيرة أكثر من الجمجمة وحول زرع، مما يسمح كل طبقة لتجف تماما (الشكل 3C). ~ ترك 3-5 ملم من نهاية محدبة من الطويق من الاسمنت نظيفة للسماح للاتصال، على نحو سلس دون عائق.
- خياطة فروة الرأس على كومة من الاسمنت الأسنان وحول زرع باستخدام العقيمة، خيوط الحرير تستخدم مرة واحدة مضفر (6-0) مع إبرة C22. إزالة بعد 7 أيام. اختياري: استخدام بوند البيطرية للربط إضافية بعد خياطة. تأكد من استخدام الحد الأدنى من التعليم والتدريب المهني بوند. يمكن أن يؤدي إلى زيادة شديدة تلف الجلد بسبب الخدش.
- فوراذ بعد الجراحة، ينبغي حقن تحت الجلد مع الماوس Ketprophen (5 ملغ / كغ) لتقليل الألم بعد الجراحة. وينبغي تكرار هذا 24 ساعة في وقت لاحق. تطبيق المسكنات الموضعية (Bupivicaine) والمضادات الحيوية (Neosporin) على الجلد وخياطة حول قاعدة عملية الزرع.
- ضع الماوس في قفص على بطانية التدفئة للتعافي من التخدير. ضع الماوس في العقيمة، قفص الانتعاش بعد العملية الجراحية. يجب القفص الانتعاش لا يحتوي على أية الفراش من أجل الحفاظ على درجة الحرارة وتجنب الاختناق. يمكن إرجاع الماوس إلى قفص أو قفص الأصلي جديد مستيقظا مرة واحدة.
جمعية زرع السليم الألياف البصرية مقرنة والنتائج في فقدان الحد الأدنى من الفوتون بين مصدر الضوء ونهاية الألياف البصرية في منطقة الفائدة. يجب الألياف البصرية جيدا مصقول نقل الضوء في موحدة، متحدة المركز الدائرة (الشكل 2D). مع الحذر وغرس خياطة، ويسبب أي تهيج زرع مرئية للالماوس، ويمكن أن تبقى في مكانها لفترة طويلة الأجل دراسات (الشكل 3D،> 1 شهر، الملاحظات غير منشورة) دون أي تدهور كبير من الألياف البصرية أو كمية الضوء المنقولة. يمكن زرع غير لائق أو خياطة يسبب تهيج ويمكن أن تؤدي إلى خدش من خلال الماوس فروة الرأس به، ويعرض الاسمنت الأسنان، أو الكسر من الطويق من الاسمنت الأسنان بسبب التلاعب المستمر. ويمكن الاطلاع على الرسم التخطيطي للنظام تجميعها في الشكل 4.
الشكل 1. جمعية الألياف البصرية القابلة للزرع. (أ) يتم إدراج الألياف البصرية في الطويق، جاحظ طفيف بعد نهاية محدبة دلت عليه رأس السهم. (ب) غير مصقول نهاية محدبة من الطويق باستخدام FOPD على درجات أدق تدريجيا من أوراق تلميع. (ج) الانتهاء من اختيار الألياف القابلة للزرعجيم. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. جمعية مقرنة الألياف البصرية المستخدمة في حبل الألياف البصرية مفصل دوار لعملية الزرع. (أ) الخلاف الألياف الضوئية من خلال الجمعية الطويق. (ب) يتم إدراج الجانب الطويق للجمعية في درجات FOPD ومصقول باستخدام أدق تدريجيا من الورق تلميع. (ج) تم تجهيز كم الطويق على الطويق والمضمون مع أنابيب الحرارة يتقلص. (د) ينبغي أن مقرنة الألياف البصرية الانتهاء إنتاج الضوء متحدة المركز مع فقدان الحد الأدنى من الفوتون.
الشكل 3. زرع الجراحية والألياف البصرية. (أ) كامل سطح craniuتتعرض م ويتم مسح النسيج الضام. (ب) عقد زرع الألياف البصرية في موقف مع الذراع التجسيمي. (ج) يتم تطبيق إصلاح الأسنان الاسمنت الألياف البصرية إلى زرع الجمجمة. (د)> 1 بعد شهر الزرع، وتلتئم الجلد حول زرع وليس هناك أي علامات الاحمرار.
الشكل 4. رسم تخطيطي لنظام وظيفي
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Discussion
Optogenetics هي تقنية جديدة تسمح قوية غير مسبوقة خلال مراقبة الخلايا العصبية فرعية محددة. يمكن استغلال هذا لتعديل الدوائر العصبية التشريحية بدقة والزمنية، مع تجنب العشوائية من نوع الخلية والآثار الغازية من خلال التحفيز الكهربائي الكهربائي. غرس الألياف البصرية يسمح للتح?...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Acknowledgements
نود أن نعترف بأن وصفت أصلا هذه التقنية من قبل سبارتا وآخرون، 2012 و قد تم تكييفه بسهولة لاستخدامها في المختبر.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| اسم الكاشف أو معدات | شركة | كتالوج # | تعليقات |
| LC الطويق كم | منتجات الألياف الدقيقة (PFP) | SM-CS125S | 1.25 مم ID |
| FC MM ما قبل تجميعها رابط | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 ميكرومتر الطويق |
| ميلر FOPD-LC القرص | PFP | M1-80754 | لLC الحلقات |
| منفرق أنابيب | PFP | FF9-250 | 900 ميكرومتر التطوير التنظيمي، 250 ميكرومتر معرف |
| MM LC عصا الطويق 1.25 مم | PFP | MM-1270-FER2007C | التجويف 127 ميكرومتر ID |
| MM LC عصا الطويق 1.25 مم | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 ميكرومترالتجويف ID |
| للحرارة قابل للشفاء الايبوكسي، وتصليب الراتنج | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC / PC وSC / PC رابط القرص تلميع | ThorLabs | D50-FC | لFC الحلقات |
| السلطة البصرية الرقمية والطاقة متر | ThorLabs | PM100D | الطيف |
| تلميع الوسادة | ThorLabs | NRS913 | 9 "× 13" 50 Durometer و |
| أكسيد الألومنيوم اللف (تلميع) ورقة: 0.3، 1، 3، 5 ميكرومتر فريك | ThorLabs | LFG03P، LFG1P، LFG3P، LFG5P | |
| معيار الألياف تكسية الصلب المتعدد | ThorLabs | BFL37-200 | انخفاض OH، 200 ميكرون الأساسية، 0.37 NA |
| تجريد أداة الألياف | ThorLabs | T10S13 | يرتدون / شركةفي: 200 ميكرومتر / 300 ميكرومتر |
| السيليكا / السيليكا الألياف البصرية | Polymicro تكنولوجيا | FVP100110125 | عالية OH، UV المحسن، 0.22 NA |
| 1X1 مفصل دوار الالياف البصرية | دوريسي العدسات | FRJ_FC-FC | |
| الالياف البصرية أحادية Patchcord | دوريسي العدسات | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| أنبوب الانكماش الحراري، 1/8 بوصة | الحليفة للإلكترونيات | 689-0267 | |
| الحرارة بندقية | الحليفة للإلكترونيات | 972-6966 | 250 واط؛ 750-800 ° F |
| يميل القطن تطبيقها | البروتستانتي الطبية منتجات الشركة | 806-WC | |
| VetBond الأنسجة لاصقة | فيشر العلمية | 19-027136 | |
| فلاش الاكريليك أسنان قاعدة | ييتس Motloid | ColdPourPowder + Liq | |
| BONN مصغرة إيريس مقص | INTEGRA Miltex | 18-1392 | 3-1/2 "(8.9cm)، على التوالي، 15 مم شفرات |
| جونز هوبكنز بلدغ المشبك | INTEGRA Miltex | 7-290 | 1-1/2 "(3.8 سم)، ومنحني |
| MEGA-عزم الدوران الكهربائية مختبر للسيارات | ناقلات | EL-S | |
| النمر الأزيز الكرة رقم 1 | كلاركسون مختبر | 77،1006 | |
| البنفسجي الأزرق ليزر نظام | CrystaLaser | CK473-050-O | الطول الموجي: 473 نانومتر |
| الليزر التيار الكهربائي | CrystaLaser | CL-2005 | |
| دومون # 2 الملقط الثقب | Fالمعهد الوطني للإحصاء أدوات العلوم | 11223-20 | |
| مسبار | أدوات العلوم الجميلة | 10140-02 | |
| 5 "المرقأة مستقيم | Excelta | 35-PH | |
| ملزمة مع الأساس المرجح | ALTEX إلكترونيات | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved