فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Jackson Buss; Carla Coltharp; Jie Xiao

doi:10.3791/50048

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

وصفنا قرار فائقة التصوير طريقة للتحقيق في التنظيم الهيكلي للالدائري FtsZ البكتيرية، جهاز ضروري لانقسام الخلية. ويستند هذا الأسلوب على التحليل الكمي للصور توطين photoactivated (PALM) والمجهر يمكن تطبيقها على هيكل الخلية البكتيرية البروتينات الأخرى.

Abstract

انقسام الخلايا البكتيرية تتطلب الجمعية المنسق لأكثر من عشر البروتينات الأساسية في midcell ^1،2. المركزية في هذه العملية هو تشكيل suprastructure الدائري مثل (Z الدائري) من البروتين FtsZ في خطة تقسيم ^3،4. و-Z حلقة تتكون من عدة protofilaments FtsZ واحد الذين تقطعت بهم السبل، وفهم ترتيب protofilaments داخل الدائري Z سوف تقدم نظرة ثاقبة آلية Z الدائري التجمع وظيفتها كما مولد قوة ^5،6. ظلت هذه المعلومات بعيد المنال بسبب القيود الحالية في مضان المجهري التقليدية والمجهر الإلكتروني. المجهر مضان التقليدية غير قادرة على توفير صورة عالية الدقة للZ الدائري بسبب الحد حيود الضوء (~ 200 نانومتر). كشف الإلكترون cryotomographic التصوير المنتشرة في protofilaments FtsZ C. الصغيرة الخلايا crescentus ^7، ولكن من الصعب تطبيقها على خلايا أكبر مثلكولاي أو B. الرقيقة. نحن هنا وصف تطبيق طريقة فائقة القرار المجهري مضان، Photoactivated المجهر الأقلمة (PALM)، لوصف كميا التنظيم الهيكلي للE. القولونية Z الدائري ^8.

PALM التصوير يقدم كل وارتفاع القرار المكانية (~ 35 نانومتر) ووضع العلامات المحددة لتمكين تحديد لا لبس فيها من البروتينات المستهدفة. وصفت ونحن FtsZ مع mEos2 بروتين فلوري photoactivatable، التي تتحول من الأخضر مضان (الإثارة = 488 نانومتر) لمضان أحمر (561 نانومتر الإثارة =) عند تفعيل في 405 نانومتر ^9. خلال التجربة PALM، يتم تنشيط عشوائيا واحد FtsZ-mEos2 الجزيئات ويتم تحديد المواقف المقابلة النقطة الوسطى للجزيئات واحدة مع الدقة <20 نانومتر. وأعيد بناؤها ثم صورة القرار فائقة للZ الدائري قبل التركيب المواقف النقطة الوسطى من جميع الجزيئات الكشف-mEos2 FtsZ. <ف الطبقة = "jove_content"> استخدام هذا الأسلوب، وجدنا أن لديه Z الدائري عرض ثابت من 100 نانومتر ~ ويتكون من حزمة فضفاضة من protofilaments FtsZ التي تتداخل مع بعضها البعض في ثلاثة أبعاد. هذه البيانات توفر نقطة انطلاق لمزيد من التحقيقات من التغييرات دورة الخلية تعتمد على ال ¹⁰ Z الدائري ويمكن تطبيقها على البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.

Protocol

1. تحضير العينة

تطعيم وسائل الإعلام LB مع مستعمرة واحدة من سلالة JB281 [BW25113 / pJB042 (P _لاك: FtsZ-mEos2)]. تنمو بين عشية وضحاها في شاكر في 37 ° C.
تمييع الثقافة 1:1،000 إلى الحد الأدنى من وسائل الإعلام M9 ⁺ [M9 الأملاح، السكر بنسبة 0.4٪، 2 مم MgSO _4، 0،1 CaCl ₂ مم، الأحماض الأمينية والفيتامينات MEM] وتنمو لمرحلة منتصف سجل (OD ₆₀₀ = 0،2-0،3) في وجود الكلورامفينيكول (150 ميكروغرام / مل) في درجة حرارة الغرفة (RT).
حمل الثقافة مع 20 ميكرومتر لمدة 2 ساعة IPTG (انظر الملاحظة رقم 1).
بيليه الثقافة في ميكروسنتريفوج (8،000 دورة في الدقيقة، 1 دقيقة) و resuspend في حجم مساو من M9 ^+؛ تكرار. بعد إعادة تعليق الثاني، مواصلة النمو في RT لمدة 2 ساعة.
إصلاح الثقافة التي يسببها مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4) في RT لمدة 40 دقيقة. بيليه الثقافة و resuspend في حجم مساو من PBS؛ تكرار. إذا الخلايا الحية التصوير، انتقل التثبيت والثقافة بيليه، و resuspend مع حجم مساومن M9 ^- [M9 الأملاح، السكر بنسبة 0.4٪، 2 مم MgSO _4، 0.1 مم CaCl _2، الأحماض الأمينية MEM]؛ تكرار.
تمييع الخرز الذهب 1:10 مع الثقافة معلق. تطبيق نموذج لغرفة التصوير المعدة (راجع الخطوة 2.4).

وقد تم تحسين البروتوكول الحث أعلاه (1،1-1،3 الخطوات) لنظام التعبير عن سلالة JB281: [1] ملاحظة. قد تختلف ظروف الحث مفصلة لأنظمة التعبير الأخرى أو البروتينات من الاهتمام.

2. جمعية التصوير الدائرة

جعل حل الاغاروز 3٪ (W / V) في M9 ^-. تذوب الاغاروز في 70 ° C الحرارة في كتلة مقعد بين كبار ل40min. ذاب في متجر الاغاروز C ° 50 لمدة تصل إلى 5 ساعة.
ضع شريحة microaqueduct نظيفة في النصف العلوي من غرفة التصوير مع الأقطاب أسفل. محاذاة أقل طوقا على الشريحة microaqueduct وذلك لتغطية قنوات الارواء.
تطبيق ~ 50 ميكرولتر من الاغاروز ذوبان إلى مركز من الزجاجالشريحة. أفضل هلام الاغاروز فورا على قطيرة مع ساترة، نظيفة وجافة. السماح للهلام لترسيخ RT في لمدة 30 دقيقة.
1. لتنظيف coverslips: ترتيب coverslips في حامل السيراميك ويصوتن لمدة 20 دقيقة في الدورية حمامات من الإيثانول، الأسيتون و1M KOH في وعاء زجاجي. تكرار دورة ثلاث مرات، ليصبح المجموع من 9 sonications، تليها صوتنة درهم واحد في ₂ O. تخزين coverslips تنظيف في ₂ O. جديدة DH قبل الاستخدام، وتفجير coverslips الجافة مع الهواء تصفيتها.
إزالة بعناية ساترة، وترك سادة هلام على الشريحة microaqueduct. إضافة على الفور 1 ميكرولتر من العينة خلية ثقافة (راجع الخطوة 1.6) إلى الجزء العلوي من لوحة هلام. انتظر دقيقة 2 ~، مما يسمح لاستيعابها حل عن طريق لوحة هلام. أفضل منصة هلام مع ساترة ونظيفة جديدة جافة. تجميع غرفة التصوير كله وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

3. الصورة اكتساب

تشغيل الكاميرا، والمجهر الليزر. فتح MetaMorph الناعمةوير (الأجهزة الجزيئية).
المكان المناسب الإثارة / الانبعاثات مرشحات في مسار التصوير (الشكل 1).
تعيين إعدادات الصلاحيات ليزر والاستحواذ وفقا لذلك.
1. 488 نانومتر ليزر = 15 ميغاواط (انظر الملاحظة رقم 2)
2. نانومتر ليزر-561 = 75 ميغاواط
3. 405 نانومتر ليزر = 2 ميغاواط ± محايدة مرشح الكثافة (انظر ملاحظة # 3)
قفل غرفة التصوير في المرحلة عبر محول المرحلة التكميلية.
تعيين منطقة التصوير المناسب (100x100 بكسل) التي يتم مضيئة متجانس من قبل جميع أجهزة الليزر الثلاثة.
تحديد منطقة العينة الذي يحتوي على كل الخلايا وعلامات إيمانية (الخرز الذهب) على مقربة ولكن لا تداخل.
التركيز على سطح الخلايا الأقرب إلى ساترة. الحصول على صورة واحدة مع 50 brightfield الوقت مللي التكامل ونقل التركيز 0.5 ميكرومتر في العينة (الشكل 3Ai).
الحصول على صورة فرقة مضان أخضر مع الإثارة من N-488 م باستخدام الليزر التكامل مللي 50 دوام (الشكل 3Aii).
الحصول على الفيديو في القناة الحمراء مع الإضاءة المستمر من نانومتر-405-561 والليزر نانومتر. لخلايا ثابتة، يتم استخدام إطار MS معدل 50 لقطة إجمالية قدرها 20،000 (~ مجموع دقيقة 17) مع قوة الليزر 405 نانومتر رفعت من قبل 10٪ ~ كل الأطر 1،000 (انظر الملاحظة رقم 4). لالخلايا الحية، ويستخدم إطار MS 10 معدل ولما مجموعه من 3،000 إطارات (المجموع 30 ثانية ~) في قوة ثابتة ليزر 405 نانومتر.
نقل التركيز مرة أخرى إلى السطح السفلي للخلايا والحصول على صورة أخرى brightfield كما في الخطوة 3.7.

[2] ملاحظة: كثافة مضان المتكاملة للالأخضر من خلية يتناسب طرديا مع العدد الكلي للجزيئات mEos2 FtsZ أعرب في الخلية. يجب أن تبقى قوة الإثارة 488 نانومتر والإعدادات الفرقة اكتساب مضان المستمر لجميع الخلايا بحيث النسبية FtsZ-mEos2 يمكن مقارنة مستويات التعبير في خلايا مختلفة.

ontent "> [3] ملاحظة: يتم تصوير الخلايا الثابتة مع الكثافة المحايدة (ND) تصفية (الشكل 1، المكون البصري # 5) في مكان من أجل تحقيق معدل التنشيط بطيئة بحيث يمكن لكل فرد جزيء تحديدها بدقة و تتم إزالة عامل التصفية عند التصوير ND تعيش الخلايا لزيادة معدل التنشيط، مع الحفاظ على احتمال ضعيف من جزيئين يتم تفعيلها في وقت واحد في منطقة حيود محدودة، وأسرع معدل للعيش تطبيق خلايا التصوير هناك حاجة إلى تقليل الوقت اكتساب المجموع، وبالتالي "تجميد" للZ الدائري في الوقت المناسب والحد من تأثير لل photodamage إلى الخلية.

[4] ملاحظة: تم ضبط عدد من الأطر المكتسبة لنظامنا وتعتمد على هيكل الخلوية خاصة، ووضع العلامات الكثافة، ومعدل التنشيط وعما إذا كان استنفاد تجمع كامل من fluorophores المهم للتحليل. في الخلايا الحية، من المهم الحصول على عدد كاف من تعريب في فترة قصيرة وذلك اعتبارا من منظمة الشفافية الدوليةلي ممكن لتجنب عدم وضوح الصورة بسبب حركة الهيكل الخلوي.

4. PALM صورة البناء

تحديد موقف النقطه الوسطى من كل بقعة الكشف عنها.
1. تحميل الصورة إلى كومة ماتلاب (ماثووركس، المؤتمر الوطني العراقي).
2. اقتصاص صورة إلى كومة المنطقة المحيطة خلية واحدة أن يستبعد كل الخرز الإيمانية.
3. تحديد عتبة للكشف عن كثافة البقعة التي هي فوق مستوى الخلفية، ولكن دون كثافة بقعة المتوسط. نحن مراعاة هذا التباين في مستوى الخلفية في جميع أنحاء تجربة عن طريق حساب متوسط الكثافة القصوى من تشغيل باستخدام إطار الإطار 150. ثم يتم عتبة شدة لكل إطار من القيم محرف المتوسط على التوالي.
4. طرح كل من عتبة كل إطار. ويتم تحديد المواقع المحتملين إلى ثلاثة المتاخمة بكسل مع شدة فوق العتبة.
5. تناسب كثافة مضان من كل بقعة المحتملين لGaussia ثنائي الأبعادن وظيفة [المعادلة رقم 1] باستخدام خوارزمية المربعات الصغرى غير الخطية (الشكل 2). يتم حساب الدقة توطين كل بقعة باستخدام عدد من الفوتونات الكشف عن [المعادلة رقم 2]. أي بقعة سيئة مناسبا مع دقة الترجمة يتم تجاهل أكبر من 20 نانومتر (خلايا ثابتة) أو 45 نانومتر (الخلايا الحية) (انظر ملاحظة # 5). كما يتم تجاهل أي بقعة مع كثافة أكبر من شقين من شدة نفسه، وربما يعود ذلك إلى بواعث التداخل.
6. لخلايا الثابتة، وإزالة الملاحظات المتكررة للجزيء نفسه بتجاهل أي بقعة التي الموقف هو النقطة الوسطى في غضون 45 نانومتر من أي بقعة أخرى التي سبقتها بنسبة 6 إطارات أو أقل. لالخلايا الحية، يتم الاحتفاظ كافة المواقع.
معايرة الانجراف العينة باستخدام علامة الإيمانية الحركة.
1. من المحاصيل منطقة بكسل 10x10 حول علامة الإيمانية.
2. طرح كل عتبة المحددة في 4.1.3 من كل إطار.
3. تناسب الشخصي كثافة في كلالإطار عبر الأقل على مساحة خوارزمية المناسب افتراض شكل ثنائي الأبعاد جاوس.
4. حساب تشريد النقطة الوسطى بين المواقف النسبية لإطار 1.
تصحيح الموقف من النقطة الوسطى كل جزيء فريدة حددت في 4.1 مع انحراف العينة المناسبة في احتساب 4.2. مقارنة الصور brightfield المكتسبة في 3.7 و 3.10. إذا لاحظت خلايا لنقل نسبة إلى علامات إيمانية، يتم طرح البيانات بها.
يطغى جميع المناصب تصحيح النقطة الوسطى على صورة واحدة تتألف من وحدات البكسل 15x15 نانومتر. رسم كل جزيء فريدة من نوعها في منطقة وحدة، لمحة جاوس ثنائي الأبعاد تركز على موقف النقطه الوسطى مع انحراف معياري يساوي الدقة التعريب [المعادلة رقم 2]. وهذا يؤدي إلى احتمال خريطة الكثافة، حيث كثافة بكسل ليتناسب مع احتمال العثور على جزيء في هذا بكسل (الشكل 3Aiv).
مقارنة الصور إلى صور PALM الفرقة.
1. Replot وCENTROكما هو الحال في المناصب رقم 4.4، ولكن على متن طائرة مع بكسل نانومتر 150x150 وانحراف معياري يساوي 250 نيوتن متر. هذا يولد صورة PALM الذي يحاكي صورة حيود محدودة، والتي يمكن استخدامها لمقارنة لصورة حيود محدودة الفرقة، حصلت في 3.8 (الشكل 3Aiii).
2. للتأكد من أن الكشف عن جزيئات هي ممثلة للمجتمع كله، قارن الصورة فرقة مجددة (الشكل 3Aiii، خطوة 4.5.1) مع الصورة فرقة مضان التجريبية (الشكل 3Aii، الخطوة 3.8) للتأكد من أن كل الصور تظهر هياكل لهما نفس الشكل والتوجيه والكثافة النسبية.

[5] ملاحظة: تم تحديد الحد الأدنى المطلوب من الدقة توطين تجريبيا لكل أسلوب التصوير عن طريق التآمر على توضيحات من جميع الجزيئات لعينة معينة، واختيار قطع مناسبة.

5. PALM تحليل الصور

قياس Z-خاتم Widtساعة والقطر.
1. تدوير الصورة وذلك لPALM عموديا توجيه المحور طويلة من الخلية (الشكل 4A).
2. من المحاصيل في المنطقة الخلوية التي تحتوي على Z-الحلبة.
3. حساب كثافة التراكمي من خلال إبراز ملف تعريف كثافة على طول محور الخلية الطويل.
4. تناسب كثافة الشخصي لتوزيع جاوس. ويعرف عرض الحلقة كما أقصى عرض الشوط الكامل (FWHM) من توزيع جاوس المجهزة (الشكل 4B).
5. المشروع الشخصي كثافة التراكمي لل5.1.2 على طول محور الخلية قصيرة. ويعرف القطر الدائري وطول الملف الكامل للكثافة (الشكل 4C).
التآمر FtsZ الكثافة (انظر ملاحظة # 6).
1. Replot المواقف كما في النقطة الوسطى (4.4)، ولكن من دون تمويه الملف بحيث يتم إعطاء كل جزيء فريدة من نوعها بقيمة 1 والمخصصة لبكسل واحد المقابلة لموقفها النقطة الوسطى. وبهذه الطريقة، فإن كثافة كلبكسل تمثل العدد الكلي من الجزيئات المكتشفة في أن بكسل. يمكن للصورة أن تكون الكثافة PALM أيضا تصور وجود مؤامرة كفاف (الشكل 5E).
تحديد القرار المكانية.
1. نظريا، يمكن تحقيقه القرار المكانية: إنشاء PSF ممثل للعينة بأكملها باستخدام متوسط الدقة تحديد توطين جميع الجزيئات التي اكتشفت وتم حساب FWHM (المعادلة رقم 3).
2. القرار المكانية تجريبيا-المحققة: حساب متوسط التشرد بين الملاحظات تكرار نفس الجزيء.

[6] ملاحظة: استخدمنا مجموع PALM التأمل الداخلي (TIR-PALM، الشكل 1 و 5) لتقييد تفعيل وإثارة لطبقة رقيقة (~ 200 نانومتر) أعلاه واجهة خلية / الزجاج. وسوف يتم الكشف عن ذلك إلا أن الجزيئات المرتبطة FtsZ الغشاء الأقرب إلى ساترة.

النتائج

هو موضح في الشكل 3Aiv هو ثنائي الأبعاد، مما يجعل القرار فائقة للZ الدائري ولدت من أسلوب التصوير PALM المذكورة أعلاه. أدناه، ونحن تلخيص المعلومات النوعية والكمية التي يمكن الحصول عليها منها.

نوعيا، لاحظنا أن Z-الدائري هو بنية ...

Discussion

PALM الصور تحتوي على معلومات حول التهم جزيء والمواقف داخل الخلية، مما يسمح تحليل مفصل لتوزيع وترتيب جزيئات البروتين الهدف الذي من الصعب تحقيقه من خلال وسائل أخرى. أدناه الخطوط العريضة ونحن الاحتياطات التي ينبغي اتخاذها لاستخراج معلومات كمية دقيقة مع المحافظة على أهم?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

المنحة: 5RO1GM086447-02.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف / المواد	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
50 × MEM الأحماض الأمينية	سيجما	M5550
100 × MEM الفيتامينات	سيجما	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16٪ لامتصاص العرق	الإلكترون العلوم Micrsocopy	15710-S
SeaPlaque GTG الاغاروز	Lonzo	50111
50 نانومتر الذهب الخرز	المجهرية-Nanospheres	790113-010
FCS2 التصوير غرفة	Bioptechs
المرحلة محول	ASI	I-3017
مقلوب المجهر	OLYMPUS	IX71
1،45 NA، 60X الهدف	OLYMPUS
IXON EMCCD الكاميرا	ANDOR التكنولوجيا	DU897E
488 نانومتر ليزر الياقوت	متماسك
-561 نانومتر ليزر الياقوت	متماسك
405 نانومتر ليزر CUBE	متماسك

References

Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. , (2010).
Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. , (2007).
Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

71 PALM FtsZ mEos2 divisome

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: