قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Nancy J. Linford; Ceyda Bilgir; Jennifer Ro; Scott D. Pletcher

doi:10.3791/50068

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا هو كائن نموذج قوية لاستكشاف الأساس الجزيئي للتنظيم طول العمر. وهذا البروتوكول مناقشة الخطوات المتبعة في توليد استنساخه، على أساس السكان قياس طول العمر وكذلك المزالق المحتملة وكيفية تجنبها.

Abstract

الشيخوخة هي ظاهرة في ذلك من تدهور مطرد في الكائنات الفسيولوجية جميع تقريبا التي تم فحصها، مما أدى إلى انخفاض الأداء البدني وزيادة خطر المرض. الشيخوخة الفردية هو واضح في مستوى السكان وزيادة في العمر التي تعتمد على وفيات، والتي غالبا ما يتم قياس في المختبر بواسطة عمر الرصد في الأفواج كبير من الأفراد في سن المتطابقة. التجارب التي تسعى لتحديد مدى وراثية أو بيئية التلاعب في الكائنات أثر عمر نموذج بسيط نجحت بشكل ملحوظ لفهم جوانب الشيخوخة التي من الحفظ عبر الأنواع واستراتيجيات جديدة لالملهم لتمديد عمر ومنع الأمراض المرتبطة بالسن في الثدييات .

الطاير الخل، ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا، هو كائن حي نموذج جذاب لدراسة آليات الشيخوخة بسبب بقائه قصيرة نسبيا، وتربية مريحة، وعلم الوراثة السهل.ومع ذلك، التدابير الديموغرافية للشيخوخة، بما في ذلك سن محددة البقاء وفيات، هي عرضة للتغيرات غير عادية حتى طفيفة في التصميم التجريبي والبيئة، ومطلوب الحفاظ على الممارسات المختبرية صارمة لمدة من التجارب الشيخوخة. هذه الاعتبارات، إلى جانب الحاجة لممارسة السيطرة حذرا من الخلفية الوراثية، ضرورية لتوليد قياسات قوية. في الواقع، هناك العديد من الخلافات البارزة المحيطة الاستدلال من التجارب طول العمر في الخميرة والديدان والذباب والفئران التي تم ارجاعها الى التحف البيئية أو الوراثية ^1-4. في هذا البروتوكول، ونحن تصف مجموعة من الإجراءات التي تم الأمثل على مدى سنوات عديدة لقياس طول العمر في ذبابة الفاكهة باستخدام قارورة المختبر. وصفنا أيضا استخدام البرنامج dLife، الذي تم تطويره من قبل مختبر لدينا، وهي متاحة للتحميل ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / سوفت وير). dLife يسرع ويعزز الإنتاجية حسب التصميم الممارسات الجيدة إدماج التجريبية الأمثل، وتبسيط التعامل مع ذبابة وجمع البيانات، وتوحيد تحليل البيانات. وسوف نناقش أيضا كثير من المزالق المحتملة في تصميم وجمع وتفسير البيانات وعمر، ونحن نقدم خطوات لتجنب هذه المخاطر.

Protocol

نوصي تخزين الأطعمة التجريبية، ومعجون الخميرة، وأجار لوحات العنب التي تظهر في البروتوكول في C ° 4 و استخدامها في غضون 1-2 أشهر طالما العفن وجفاف لم نحدد فيها الظروف البيئية القياسية لكل من اليرقات والكبار تنظيم تنطوي صيانة الذباب في حاضنة في C ° 25 مع دورة الضوء 12:12 ساعة الظلام والرطوبة النسبية 60٪.

1. إعداد تجريبية من السلع الغذائية

للنمو اليرقات، نستخدم معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا معدلة متوسطة ^5، الذي هو مختصر في هذا البروتوكول CT.
نوصي اتباع نظام غذائي لذبابة الفاكهة الكبار (SY) التي تتكون من السكر (السكروز) والخميرة (خميرة البيرة كله مجفف بالتجميد) في قاعدة أجار 2٪، الذي سبق غليه، على أن تستكمل مع المضادات الحيوية والأدوية المضادة للفطريات، وتوزيع (10 مل لكل قنينة) ^6. وينبغي أن يسمح لترسيخ والغذاء لمدة 12-24 ساعة تتبخر قبل التخزين. لأنه لا يمكن البيئة المغذيات substanطول العمر tially أثر، والاتساق في عمليات الطبخ أمر ضروري سواء داخل تجربة وللمقارنة بين التجارب.
إذا هو وكيل الدوائية التي يمكن ان تضاف الى الغذاء الكبار، ويمكن أن تكون مختلطة في هذا الدواء دفعة صغيرة من الطعام والطبقات (2 مل) على سطح المواد الغذائية، مع قارورة تحتوي على طبقات شاهدة تتلقى السيارة وحدها.

2. إعداد عجينة الخميرة لايف

الجمع بين 5-6 مل من الماء مع 3 غرام من الخميرة الجافة النشطة وتخلط جيدا. ينبغي للاتساق عجينة الخميرة التي تكون من زبدة الفول السوداني على نحو سلس.

3. إعداد لوحة آجار العنب

إضافة حزمة من خلائط جاهزة أجار العنب في 500 مل من الماء المقطر في دورق مل 1000 واتبع التعليمات التي تظهر على الحزمة إلى حل مزيج أجار العنب.
صب بعناية طبقة سميكة من الخليط في أطباق بتري 100 ملم مع تجنب تشكيل فقاعة. حزمة واحدة من الخلطة الجاهزة وتنتج حوالي 14 جرالوحات أجار بي.
اسمحوا تبرد وسائل الإعلام في ترسيخ ودرجة حرارة الغرفة مع الأغطية لمدة 15 دقيقة. يمكن أن تظل لوحات في 4 درجات مئوية، ملفوفة في غلاف بلاستيكي، أو استخدامها على الفور.

4. جمع البيض المتزامنة

ينبغي لجميع وسائل الإعلام المستخدمة في هذا البروتوكول، أي الخميرة، لوحات أجار العنب، CT و 10٪ الغذاء SY، يكون في درجة حرارة الغرفة.

نشر قطره سم 2-3 طبقة من الخميرة لصق على لوحة أجار العنب وتوضع جانبا.
وضع مجموعة بيضة كبيرة القفص على لوحة ₂ CO-مع الجانب وصولا الى شبكة تخدير الذباب. النيتروجينية التخدير هو بديل لCO _2، وتستخدم من قبل بعض المختبرات، التي يمكن أن تسفر عن نتائج ذات جودة عالية ^7.
باستخدام القمع، ونقل 150-200 أزواج من الذباب في قفص البيض المجموعة.
وضع لوحة أجار العنب لتغطية نهاية مفتوحة من القفص وتأمين غطاء مع نهاية.
وضع القفص على جانبها حتى الذباب يستيقظون.ثم، والحفاظ على القفص، لوحة أجار العنب الجانب السلبي، في الحاضنة بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، لوحة تبديل العنب العنب مع لوحة yeasted حديثا. فقط وضع حوالي 1 سم قطر من معجون الخميرة على سطح اللوحة. تجاهل عيد ^القديس 1 لوحة العنب.
السماح لجمع الأجنة على سطح لوحة أجار العنب ل16-22 ساعة. وبمجرد القيام به، وجمع لوحة أجار العنب وتجاهل الذباب الأصل.
غسل السطح من لوحات أجار العنب مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). يمكن تعبئتها عن طريق كشط بلطف البيض مع مسحة القطن. والحرص على عدم الضرر، الصفر، أو كشط قطعة رقيقة من أجار قبالة سطح اللوحة. مع المعونة من القمع، صب البيض غسلها في أنبوب 15 مل المخروطية.
السماح للبيض تستقر في قاع الأنبوب وتصب قبالة طاف، والحرص على ألا تفقد أي البيض. يجب أن يكون حجم ما تبقى حوالي 2-3 مل.
إضافة 8-10 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب وكرر ما سبق خطوة مور 2-3ه مرات لغسل بدقة البيض حتى طاف واضحة. التخلص من الخميرة المتبقية هو المفتاح في هذه الخطوة.
بعد غسل وتجفيف جميع طاف حتى حجم 2 مل المتبقية. قسامة 32 ميكرولتر من البيض في زجاجات CT باستخدام تلميح ماصة واسعة الجوف. يجب البيض في الطرف ماصة تكون مدمجة، مع قليل من السائل لا يستنشق. ويمكن تحقيق هذا عن طريق إدراج غيض ماصة في عمق تسوية البيض والإفراج عن الغطاس بسرعة لنضح.
مكان المصنفة CT زجاجات مرة أخرى في جميع أنحاء حاضنة التنمية الطاير.

5. مجموعة من العمر المطابقة الكبار الذباب

سوف البالغين eclose عادة من يوم 9 فصاعدا. تجاهل الذباب التي ظهرت في اليوم الأول والزجاجات المكان مرة أخرى في ليلة وضحاها الحاضنة. وهذه الممارسة غير مقصود لتجنب اختيار يميرغينتس المبكر وتسمح لجمع أكبر عدد ممكن من الذباب متزامنة.
16-22 ساعة في وقت لاحق، نقل الكبار يوما الذباب الباحثس الغذائية SY 10٪ الزجاجات. إذا لزم الأمر، يمكن جمعها دفعة أخرى في اليوم التالي.
عودة يطير مرة أخرى في حاضنة والسماح الذباب لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي وزميله لمدة يومين. تسجيل يوم لنقل زجاجات SY 10٪ كما في اليوم الأول من مرحلة البلوغ.

6. الذباب الفرز وإعداد التجربة طول العمر

تخدير مجموعات صغيرة من الذباب على لوحة مخدر، ثم الذكور والإناث نوع إلى مجموعتين باستخدام الفرشاة. في حالة استخدام CO _2، فمن الأهمية بمكان للحد من التعرض لتجنب احتمال القضايا الصحية طويلة الأمد التي يمكن أن تعرض للخطر سلامة التجربة طول العمر.
الذباب الفترة من 30 من نفس الجنس في قارورة الفردية. افتراض عدم وجود الصبغيات موازن في عدد السكان وآله صحية، ينبغي لكل زجاجة تنتج نحو قارورة 3-4 من كل جنس. يجب Aliquoting الذباب في قارورة الفردية يستغرق الامر أكثر من دقيقة 3-4، بحيث، في المجموع، ويتعرض للتخدير فقط الذباب لمدة أقصاها9-10 دقيقة.
كرر الخطوات من 6،1-6،2 حتى هناك قارورة 8-10 مكررات لكل نوع الجنس والعلاج التجريبي.

7. إنشاء جداول البيانات إكسل لتتبع التجربة طول العمر

نوصي التعشءه موقف فيال بدلا من قوارير تجميع من حالة تجريبية من أجل تجنب التحيز المرتبطة الموقع فيال في الحاضنة وإخفاء هوية فيال لالمجرب. للقيام بذلك، أولا تعيين ID العشوائية العددية لكل قنينة في برنامج جدول بيانات، ثم ترتيب وقارورة في الصواني من حيث عدد ID. إذا كنت تستخدم إدارة البرامج dLife التجربة، اتبع البرنامج التعليمي على إعداد التجربة لتوليد رقم لكل قنينة.
(اختياري) إذا كنت تستخدم قارئ RFID أو قارئ الباركود بالتعاون مع dLife، إرفاق RFID أو علامة الباركود على كل قنينة وربط البطاقة مع رقم القارورة والعددية في dLife. سيقوم البرنامج التعرف على بعضها فيال عندما تفحص مع قارئوتوجيه واحد لتسجيل البيانات في الموقع الصحيح في جدول بيانات. استخدام قارئ البطاقات بالتزامن مع dLife يخفف كثيرا من البيانات في الوقت الخطأ جمع وتسجيل.

8. الحفاظ على التجربة طول العمر

قارورة ينبغي أن تحتوي على المواد الغذائية الطازجة تكون على درجة حرارة الغرفة لكل عملية تحويل.

خلال الفترة التجريبية، والذباب على نقل قوارير جديدة تحتوي على كل المواد الغذائية الطازجة 2 يوم (الشابات)، أو 3 مرات في الأسبوع (ذكور أو إناث> 3 أسابيع من العمر). وهذه الخطوة ضمان عدم تعطل البيئة التغذية للشابات من خلال وجود اليرقات. وينبغي استكمال هذا النقل بدون تخدير، والتي يمكن أن تحدث وفيات الحادة، وخاصة في كبار السن الذباب (Pletcher والملاحظات الشخصية).
خلال كل فيال نقل وتسجيل عمر، عد الذباب الميت في القارورة القديمة، والذباب الميت التي تقوم على القارورة الجديدة. تسجيل هذه المعلومات بشكل منفصل فيعمودين في جدول بيانات (إما أو جدول dLife الخاصة بك). وسوف يضمن هذا الذباب التي لا تحصى نقرا مزدوجا. (قامت القتلى +) العدد الإجمالي للوفيات ينبغي على الأقل يساوي عدد الذباب نقلها من نقل السابقة. طرح عدد من الذباب التي سبق من العدد الإجمالي للوفيات لتحديد عدد وفيات جديدة.
ويعتبر الطيران بزر الماوس الأيمن رقابة اذا تركت التجربة قبل الوفاة الطبيعية أو الوفاة من خلال الهروب من قبيل الصدفة. يجب إدخال الحيوانات الخروج من التجربة بهذه الطريقة في عمود منفصل في اليوم الذي الطاير خرجت من التجربة. لم يتم تسجيل الذباب رقابة في عداد الموتى (انظر أدناه).
تواصل كرر الخطوات 8،1-8،2 حتى آخر الناجين ميت. كما أن ندرك أن عمر الذباب، الذباب بعض قد تقع على ظهورهم والموات التي تظهر الخمول بهم. ولذلك عندما قامت عد الذباب (ميت)، اضغط على الجانب من قوارير لتحديد ما إذا كانت هناك حركات الساق. إذا كان الأمر كذلك، تساه الذباب لا تزال على قيد الحياة. في الحالة حيث لا تزال عالقة الذباب إلى الطعام في القارورة القديمة ولكن على قيد الحياة، لا ينبغي أن تحسب في عداد الموتى، وينبغي إنقاذهم من خلال استغلال مزيد من القارورة لطرد الطاير. وينبغي أن تستخدم هذه الرقابة الذباب بحذر لأنها قد تؤدي إلى التحيز التجريبية.

9. تحليل البيانات

منحنى البقاء على قيد الحياة احتمال أن يعرض الفرد على قيد الحياة إلى سن معينة، وعادة ما يتم حساب باستخدام نهج كابلان ماير (الشكل 1) ^8. يتم تحديد في عدم وجود بيانات بزر الماوس الأيمن رقابة، يمكن تبسيط الصيغة بحيث البقاء على قيد الحياة لسن معينة في عمر x (S _خ) عن طريق قسمة عدد الأفراد على قيد الحياة في بداية التعداد في وقت عمر x (N _X) على العدد الكلي من الذباب في التجربة (N _0)؛ S = N _{X X} / N _0. 9،2 منحنيات الوراثة) هي الشكل الأكثر شيوعا من عرض البيانات، وأنهاويمكن اختبار من أجل المساواة بين المجموعات باستخدام اختبار سجل رتبة. ويمكن استخلاص استنتاج معقول من عدد قليل من الأفراد 50-100 في الفوج. البقاء على قيد الحياة هو مقياس التراكمي، ومع ذلك، وبالتالي الوفيات التي ليست المتصلة بالشيخوخة، مثل تلك في وقت مبكر من الحياة، والبقاء على قيد الحياة سوف تخفض في مختلف مراحل العمر مما يجعل من الصعب التأكد من الآثار الخاصة الشيخوخة.
A التصور البيانات الثاني طريقة هي وظيفة وفيات الفئة العمرية المحددة، والتي تعرض لخطر الموت خلال كل فترة العمر ويقدم وصفا أكثر دقة للبيانات البقاء على قيد الحياة ^9،10. تدابير وفيات مستقلة من عصر إلى آخر، وشكل المنحنى وفيات مفيد لاستنتاج حول ديناميات الشيخوخة، وخاصة عندما يتم تعديل العلاجات في سن متقدمة. تقديرات الوفيات في الفئة العمرية المحددة، ومع ذلك، تفتقر كل من الدقة والدقة مع أحجام عينة صغيرة، وغالبا ما تتطلب عدة لكثير من الأفراد في مئات فوج لES موثوق بهاtimate ^11.
طرق أخرى لتقدير الاختلافات تشمل طول العمر حدودي (مثل جومبرتز) وشبه بارامترية النماذج (مثل كوكس الانحدار). يمكن لهذه النماذج أن تكون قوية ولكن ينبغي أن تطبق بحذر بسبب الافتراضات حول شكل منحنيات وفيات وطبيعة الآثار العلاج، مما قد يؤدي الى الاستنتاج غير صحيح ^11،12.