العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

Summary

وهناك طريقة لعزل الكريات البيض التهابات الأوعية الدموية الملتصقة من الدماغ من المتصورة berghei ANKA الفئران المصابة. الأسلوب الكمي يسمح كذلك توصيف المظهري من الكريات البيض المعزولة بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة وتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخلوي.

Abstract

وصفنا طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الالتهابية تمسكا من الأوعية الدموية في الدماغ من P. berghei ANKA المصابين الفئران. إصابة السلالات الحساسة الفأر مع هذه النتائج سلالة الطفيلي في استحثاث الملاريا الدماغية التجريبية، وهي متلازمة عصبية أن يجمل جوانب هامة معينة من الملاريا المنجلية المتصورة بوساطة شديد في ^1،2 البشر. أشكال ناضجة من الدم في مرحلة التعبير عن الملاريا الطفيلية البروتينات على سطح كرات الدم الحمراء للمصاب، مما يسمح لهم لربط الخلايا البطانية في الأوعية الدموية. هذه العملية يدفع عوائق في تدفق الدم، مما يؤدي إلى نقص الأكسجة والنزيف ³ و يحفز أيضا تجنيد الكريات البيض الالتهابية إلى موقع تنحية الطفيليات.

على عكس غيره من الأمراض والفيروسات neutrotopic أي ^4-6، على حد سواء الملاريا الطفيلي خلايا الدم الحمراء (pRBC) وكذلك يرتبط بها من inflammالكريات البيض atory تبقى المحتبسة داخل الأوعية الدموية بدلا من التسلل لحمة الدماغ. وبالتالي لتجنب التلوث من الكريات البيض مع المنظمات غير المعزول للالتهابات الخلايا المنتشرة، نضح intracardial واسعة من الفئران المصابة قبل استخراج الجهاز ومعالجة الأنسجة هو مطلوب في هذا الإجراء لإزالة الدم المقصورة. بعد نضح، ويتم حصاد العقول وتشريح في قطع صغيرة. وتعطلت كذلك بناء الأنسجة عن طريق العلاج الأنزيمية مع collagenase وI. D الدناز يتم طرد جناسة الدماغ ثم الناتجة عن الانحدار الذي يسمح Percoll الفصل بين الدماغ المعزول الكريات البيض (BSL) من المايلين وغيرها من الحطام الأنسجة. عد الخلايا ثم تغسل المعزولة، وذلك باستخدام عدادة الكريات والملون مع الأجسام المضادة للتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخلوي.

هذا الإجراء يسمح توصيف المظهري شاملة من الكريات البيض الالتهابية الهجرة إلى الدماغ في إعادةاالستجابة للمؤثرات المختلفة، بما في ذلك السكتة الدماغية وكذلك العدوى الفيروسية أو الطفيلية. الأسلوب يوفر أيضا أداة مفيدة لتقييم العلاجات المضادة للالتهابات رواية في النماذج الحيوانية ما قبل السريرية.

Protocol

1. إصابة الفئران مع P. berghei-ANKA

1. وقسامة من تذويب P. cryopreserved berghei ANKA pRBC.
2. كبح الدماغيه الملاريا المقاومة للالماوس المانحة BALB / ج (8-12 أسابيع من العمر) باستخدام تقنية ضبط النفس باليدين. حقن الماوس مع 100-200 ميكرولتر من استخدام الأنسولين pRBC 1 مل حقنة (إبرة 28G). بشكل روتيني، يتم حقن الفئران المانحة 1-2.
3. على بعد 4-5 أيام العدوى (PI) إزالة الماوس المانحة من القفص ووضعه على محطة عمل أو لوحة المتاح العمل.
4. كبح بلطف الماوس في نهاية الذيل وباستخدام مقص صغير قطع رأس الذيل (حوالي 1 ملم). وبدلا من ذلك، يمكن أن يقوم ثقب صغير الذيل باستخدام إبرة G 25.
5. وضع قطرة من الدم من الوريد ذيل الماوس بالقرب من نهاية شريحة المجهر بلوري النهائي.
6. ضع شريحة الثانية (رش) على زاوية 45 درجة ودعمه في قطرة من الدم. مرة واحدة في الدم ينتشر على طول الحافة، ودفع عشية رش الشريحةنلي عبر المجهر الشريحة لجعل مسحة الدم. السماح للتشويه للهواء الجاف.
7. إصلاح مسحات الدم في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية ثم وصمة عار في بالغيمزا الشرائح الطازجة لمدة 10 دقيقة.
8. شطف مع مسحة الدم المياه الجارية لمدة 1 دقيقة، السماح ليجف في الهواء وفحص الشريحة تحت المجهر (الغمر النفط 100X،). تعداد الكريات الحمراء pRBC داخل 1000 وحساب تطفلن الدم في المئة. يجب أن تصل إلى مستويات الفئران المانحة تطفلن الدم بين 2،5-5٪ قبل أن يتم نزف للإصابة حيوانات التجارب.
9. جمع الدم من الجهات المانحة عن طريق الماوس الرجعية المدارية النزيف باستخدام heparinized الدقيقة الهيماتوكريت أنبوب شعري. يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لوالتر وإليزا هول معهد متطلبات الحيوان جنة الأخلاقيات. قد اعتمادا على المتطلبات المحلية الحيوان جنة الأخلاق أن تستخدم الإجراءات الدموية الأخرى. حل الكمية المطلوبة من الدم في المتوسط ​​RPMI في تركيز النهائي من مل ⁶ pRBC/0.2 1X10. نعتبر أنوالهيماتوكريت الماوس العادي ~ 6x10 ⁹ خلايا الدم الحمراء / 1 مل.
10. تصيب C57BL التجريبية / 6 الفئران (8-12 أسابيع من العمر) عن طريق حقن الغشاء البريتونى (IP) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 مل.
11. تطفلن الدم لرصد مستويات من الفئران المصابة اتبع الخطوات من 1،3-1،8. وينبغي أن تحدد كل 2-3 أيام تطفلن الدم بدءا من اليوم 2 أو 3 بي
12. الطوقية بداية الملاريا الحادة في C57BL / 6 الفئران قد تظهر كما مظهر التقوس والفراء وقليلة النشاط. قد يكون بعض الفئران استرداد في هذه المرحلة، ولكن التقدم إلى فقدان الذات المنعكس التقويمي يشير المرض لا رجعة فيه، ويجب أن يتم التخلص الحيوانات.

2. Intracardial الإرواء من الفئران واستخراج الدماغ

1. تجميع نضح خطورة دليل النظام من خلال تأمين خزان 500 مل إلى صاحب عمود تعلق على الجزء العلوي من العمود موقفا 60 سم. الاتصال أنابيب بلاستيكية إلى نهاية الجزء السفلي من الخزان وتأمين أنابيب المشبك للتحكم في تدفق العازلة. نعلق أنابيب إلى إبرة G 23. فيلل يصل الخزان مع PBS (C ° الاحتفاظ بها في 22)، افتح المشبك والسماح لتشغيل المخزن المؤقت من خلال أنابيب لإزالة جميع فقاعات الهواء.
2. الموت ببطء P. berghei ANKA المصابين الماوس عن طريق الاستنشاق ₂ CO. تأكيد وفاة بسبب غياب دواسة، المدارية والردود في الجهاز التنفسي.
3. دبوس الماوس الموت الرحيم من قبل الكفوف هند وأمام ظهريا على لوحة تشريح الستايروفوم الواردة في علبة من البلاستيك. يمكن اعتمادا على تخدير موضعي الأخلاق الحيوانية متطلبات اللجنة أن تدار بدء مسبقة من pefusion intracardial.
4. مسح الجانب البطني مع الايثانول 70٪.
5. استخدام مقص وملقط كبير لفتح الجلد على طول خط الوسط لفضح تجويف الصدر. أضعاف، ودبوس الجلد على الجانبين.
6. عقد القص مع ملقط الغرامة وخفض الحجاب الحاجز وعلى طول جانبي القص قطع الأضلاع. والحرص على عدم إتلاف أي الأوعية الدموية الكبيرة.
7. دبوس القفص الصدري بواسطة القص المقبل فضفاضة في الرأس.
8. عقد البطينين الطرافةح ملقط غرامة والأذين الأيمن شق بعناية مع مقص غرامة.
9. إدراج إبرة 23G تعلق على نظام نضح جاذبية في البطين الأيسر والشريان الأورطي نحو تصاعدي في حين PBS قيد التشغيل. إدراج 0.5 سم فقط من طرف الإبرة.
10. يروي الماوس لمدة 5 دقائق أو حتى النفايات السائلة واضح.
11. بفصل الماوس ووضع على البطن. مسح الرأس مع الايثانول 70٪.
12. باستخدام مقص كبير، وجعل قطع فقط فوق منطقة النخاع الشوكي عنق الرحم.
13. استخدام مقص غرامة لجعل متوسط ​​الذيلية-منقاري قطع ابتداء من قاعدة الجمجمة وقشر الجلد بعيدا لفضح الجمجمة.
14. عقد رئيس، ضع شفرات مقص صغير لفي كل جوف الحجاج وتقديم قطع بين المدارات.
15. جعل خفض طولية على طول الدرز السهمي وقشر بعناية الجمجمة على كل نصف الكرة المخ الخارج.
16. باستخدام ملعقة، ورفع بلطف الدماغ ووضعه في أنبوب الطرد المركزي 10 مل تحتوي على RPMI المتوسط.

3. عزل الدماغ المعزول الكريات البيضاء (BSL)

1. العمل في مجلس الوزراء السلامة، والمكان المقطوع حديثا الدماغ على رأس مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ الخلية (40-60 حجم فتحات الشباك) في طبق بتري تحتوي على 3-5 مل من الأنسجة RPMI متوسطة الثقافة.
2. قطع أنسجة المخ إلى أجزاء صغيرة.
3. دفع قطع صغيرة من أنسجة المخ من خلال مصفاة الخلية باستخدام المكبس وضوح الشمس.
4. نقل جناسة الدماغ إلى أنبوب الطرد المركزي 10 مل وعند 250 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
5. حل بيليه في 3 مل من المتوسط ​​RPMI، تحتوي على 0.05٪ كولاجيناز D و2U/ml I. الدناز
6. تدوير الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الحطام الخلية عن طريق دفع الخليط من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر النايلون و / أو عن طريق احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
7. وضع جناسة الدماغ على وسادة مل 7 Percoll 30٪ وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج (بلا فرامل) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
8. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من الدم الحمراء الخلية تحلل العازلة واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق إلىليز pRBC تمسكا، والتي لا يمكن إزالتها من الدماغ عن طريق نضح intracardial.
9. أضف 9 مل من المتوسط ​​RPMI، وغسل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
10. إعادة تعليق BSL التي تحتوي على بيليه في 50-100 ميكرولتر من الخلايا المتوسطة RPMI ونقل إلى أنبوب إيبندورف.
11. قسامة تخفيف من 5-10 ميكرولتر من العينة خلية باللون الأزرق التريبان 01:02 لتحديد خلايا قابلة للحياة.
12. عد خلايا قابلة للحياة تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. ابتداء من اليوم بي 6، عندما P. berghei ANKA الفئران المصابة عرض علامات العصبية، يمكن استرداد 20،000-100،000 BSLs.

4. المناعي الظاهري من BSL من قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان

1. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونضح طاف بيليه و resuspend في 50 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (PBS، 1٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 2 مم EDTA).
2. إضافة ميكرولتر 1 من تنقية anti-CD16/32 الأجسام المضادة (Fcblock).
3. احتضان خلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد.
4. غسل الخلايا مع 1 مل من الاحتياطي تلطيخ. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نضح طاف.
5. إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على تلطيخ محددة مسبقا التخفيفات الأمثل من الأجسام المضادة المطلوبة الفلورسنت، أي المضادة للCD4، ومكافحة CD8، ومكافحة TCR ومكافحة NK1.1.
6. احتضان لمدة 1 ساعة على الجليد.
7. غسل الخلايا مع 1 مل من الاحتياطي تلطيخ. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نضح طاف.
8. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
9. نقل الخلايا إلى أنبوب تدفق البلاستيك الخلوي.
10. باستخدام قياس التدفق الخلوي، والحصول على ما لا يقل عن 5،000-10،000 الأحداث. وينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة الخلية غير ملوثين وعينات التعويض ملون تألقي كما هو مطلوب.
11. تحليل النتائج باستخدام البرمجيات المناسبة التدفق الخلوي.

النتائج

النتائج في الشكل. عرض النسب المئوية (2) والأعداد المطلقة للسكان BSL مختلفة تعافى من أدمغة الفئران perfused أو unperfused مكافحة الملاريا المصابين والسذاجة. كانت ملطخة معزولة BSL مع PE-المضادة للNK1.1 والأجسام المضادة APC-المضادة للTCR-β كما هو مشار إليه في نص البروتوكول. تتألف خلايا T

Discussion

عزل وتحليل BSL هو وسيلة تسمح توصيف وتقدير من الخلايا الالتهابية الهجرة إلى الدماغ استجابة لإصابة الأنسجة أو العدوى في نماذج الماوس التجريبية. إدخال خطوة نضح intracardial لإزالة المقصورة الدم قبل استخراج الجهاز والعزلة اللاحقة خلية مفيد لمنع التلوث من الخلايا الالتهابية م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
			حلول ومخازن
بالغيمزا في الميثيلين الأزرق حل يوزين دازور	ميرك ميليبور	1.09204.0500	1:10 التخفيف في الماء المقطر
RPMI متوسطة			الماوس تحظرب
الماوس تحظرب PBS			20 ملي فوسفات الصوديوم، كلوريد الصوديوم 0،149، ودرجة الحموضة 7.3
التريبان الأزرق 0.4٪	سيغما الدريتش	T-8154	01:02 التخفيف
كولاجيناز D	الكيمياء الحيوية ورثينجتون
Deoxyribonuclease (الدناز) I	سيغما الدريتش	D4263-5VL	من البنكرياس البقري
Percoll	GE للرعاية الصحية	17-0891-01	حل 30٪ في برنامج تلفزيوني
عالى النقاء تريس	إينفيتروجن	15505-020
كلوريد الأمونيوم (NH 4 CL)	AnalaR	10017
الاحتياطي انحلال الخلايا الحمراء			17 ملم تريس، 14nM NH 4 الكلورين، ودرجة الحموضة 7.2
FCS	Gibco	1009
EDTA ثنائي الصوديوم الملح	ميرك	10093.5V	0.1M، ودرجة الحموضة 7.2
			الأجسام المضادة وتقارن
مكافحة الماوس CD16/CD32 (FC بلوك)، استنساخ 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 ميكرولتر العازلة في 50 ميكرولتر تلطيخ (0.5mg/50 مل)
FITC مكافحة الماوس CD4، استنساخ H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-الماوس المضادة للNK1.1، استنساخ PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5 مكافحة الماوس CD8، استنساخ 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-الماوس المضادة للTCR-β، استنساخ H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-الماوس المضادة للCXCR3، استنساخ 220803	R & D أنظمة	FAB1685P
المعقدة البيروكسيديز مكافحة الماوس CCR5، استنساخ C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			المعدات والمواد
SuperFrost المجهر الشريحة	ومب منزل-جلاسر
ملقط تشريح، مقص	REDA INSTRUMENTE
500 مل PBS الخزان	Nalgene
المطاط أنابيب
23G إبرة	BD PrecisionGlide	302008
الخلية التي تحتوي على المعادن التفكك عدة غربال	سيغما الدريتش	CD-1
70 ميكرومتر مصفاة الخلية النايلون	BD الصقر	352350
عدادة الكريات	شركة محدودة نويباور	717810
أنابيب تدفق الخلوي	BD الصقر	352008