قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

Summary

ووصف طريقة لقياس طول جمود العاطفة أو استمرار من البوليمرات الحيوية. أسلوب يستخدم كينيسين يحركها مقايسة مزلق أنيبيب تجريبيا لتحديد طول استمرار ميكروتثبول الفردية وقابلة للتكيف مع المقايسات مزلق الأكتين مقرا لها.

Abstract

ميكروتثبول هي البوليمرات هيكل الخلية التي تلعب دورا في انقسام الخلايا، والميكانيكا الخلية، والنقل داخل الخلايا. كل من هذه المهام يتطلب ميكروتثبول التي هي قاسية بما فيه الكفاية وتمتد مباشرة إلى جزء كبير من الإطارات الخلية. ونتيجة لذلك، تم طول استمرار أنيبيب، وهو مقياس لصلابة، ودرس بنشاط على مدى العقدين الماضيين ^1. ومع ذلك، تبقى الأسئلة مفتوحة: ميكروتثبول قصيرة هي 10-50 مرات أقل من ميكروتثبول طويلة قاسية ^2-4، وميكروتثبول حتى قياس أطوال طويلة والتي تختلف استمرار بأمر من حجم ^5-9.

هنا، نقدم طريقة لقياس طول أنيبيب المثابرة. وتستند هذه الطريقة على فحص أنيبيب مزلق كينيسين يحركها ^10. من خلال الجمع بين العلامات الفلورية متفرق من ميكروتثبول الفردية مع تتبع جسيم واحد من fluorophores الفردية التي تعلق على أنيبيب، وglidinيتم تعقب مسارات غرام من ميكروتثبول نانومتر واحد مع المستوى من الدقة. طول مسارات استمرار هو نفس طول استمرار أنيبيب وفقا للشروط استخدامها ^11. يستخدم روتين تتبع الآلي لخلق مسارات أنيبيب من fluorophores تعلق على ميكروتثبول الفردية، ويتم حساب طول استمرار هذا المسار باستخدام إجراءات مكتوبة في IDL.

هذه التقنية قابلة للتطبيق بسرعة، وقادرة على قياس طول استمرار ميكروتثبول من 100 في يوم واحد من التجريب. ويمكن تمديد طريقة لقياس طول ظل استمرار مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك استمرار طول بوصفها وظيفة من طول الأنابيب الدقيقة جنبا إلى جنب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تمتد إجراءات التحليل المستخدمة لالميوسين القائم على المقايسات مزلق التمثيل، لقياس طول خيوط الأكتين استمرار كذلك.

Introduction

الهيكل الخلوي، وهي شبكة من البوليمرات الحيوية موجودة في الخلايا حقيقية النواة الأكثر، يلعب دورا في تنظيم الخلوية، والنقل داخل الخلايا، والميكانيكا الخلية. الخصائص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية من الهيكل الخلوي (أكتين في المقام الأول وميكروتثبول) تلعب دورا هاما في تحديد الخواص الميكانيكية للخلية كما في ¹² كله. منذ ميكانيكا خلية كاملة يمكن أن تميز الخلايا السليمة والمريضة ^13،14 وتشارك في الحركة الخلوية ^15، وكانت الخواص الميكانيكية للهيكل الخلية الأساسية في مكونات منطقة نشطة للدراسة على مدى العقدين الماضيين ^1.

وتتميز بالمرونة (أو تصلب) من البوليمرات الحيوية من طول استمرار، وطول البوليمر الذي ينحني من راديان واحد تقريبا تحت تقلبات الحرارية عند درجة حرارة الغرفة. وقد تم تطوير عدد من التقنيات لقياس طول استمرار ^16، لأمثلتقنيات جنيه بالموقع التي تنطوي على الانحناء البوليمر باستخدام تدفق الهيدروديناميكية، والفخاخ البصرية، أو المجالات الكهربائية ^4،17،18، وتقنيات قياس السلبي الذي تقلبات البوليمرات الحرة في حل ^5،6. القياسات بالموقع، ومع ذلك، تتطلب الاجهزة المتخصصة لتنفيذ القوات المعروفة على مقياس الميكرومتر، وقياسات الحرة تقلب يمكن أن يكون تحديا بسبب نشرها من الطائرة من تركيز المجهر المستخدمة.

في هذه المقالة، ونحن تصف، السلبي التكميلية، تقنية لقياس طول استمرار ميكروتثبول، بوليمر هيكل الخلية. والأسلوب الذي ينطوي المقايسات مزلق، والتي تضمن أن يبقى دائما البوليمر في المستوى البؤري ^19. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي fluorophores واحدة تتبع تثبت بصورة دائمة على البوليمر في المصالح، بحيث تتميز كذلك مواقع محددة على طول البوليمر.

ويرد كارتون الأسلوب في الارقام ..ه 1. كينيسين يتحرك على وجه التحديد في أواخر + من الأنابيب الدقيقة، بحيث يتم دفع ميكروتثبول مزلق في مقايسة unidirectionally. نهاية الرائدة في مجال أنيبيب، وراء كينيسين مشاركة المرفقة، حر في أن تتقلب تحت قوات الحرارية من الحل المحيطة بها. كما دفعت أنيبيب إلى الأمام، حتى نهاية يتقلب الربط إلى جزيء جديد كينيسين على امتداد شريحة زجاجية يتجمد في تذبذب معين. لأن تعلق كينيسين ميكروتثبول بقوة، يتم تقييد أنيبيب لمتابعة مسار نهاية الرائدة. ولذلك، فإن التقلبات الإحصائية المجمدة في مسار أنيبيب هي نفس التقلبات الإحصائي للنهاية خالية من الأنابيب الدقيقة ^11، وبالتالي يمكن استخدامها لحساب طول استمرار فقا إلى ²⁰

حيث L هو طول _ع استمرار أنيبيب، θ _s هو الزاوية بين الظلال لمسار مفصولة كفاف ق الطول، و<> يدل على متوسط ​​على كل زوج من المواقف مفصولة كفاف ق الطول.

الفحص مزلق نفسه يستخدم المعقدة البيروكسيديز كينيسين في ال ²¹ ملفوف لفائف ملزمة على وجه التحديد إلى شريحة زجاجية عن طريق الربط streptavidin-البيوتين. هذا المرفق يضمن أن محرك المجالات أحرار في ربط ودفع ميكروتثبول. من أجل تتبع مسارات أنيبيب، وصفت قليلة ميكروتثبول مع fluorophores العضوية ^22،23 - التسميات يجب أن تكون كافية متفرق التي لحل fluorophores واحدة باستخدام جزيء واحد المجهري مضان. يتم تعقب fluorophores واحدة باستخدام إجراءات تحليل الصور مكتوب في IDL. مسارات من كل fluorophore منضم إلى هيئة التصنيع العسكري نظرايتم الجمع بين rotubule في مسار مركب ²⁴ أنيبيب تلقائيا. يتم حساب زوايا الظل θ إلى كل نقطة على طول المسار، ومن هذه الزوايا الظل ويتم احتساب سبت> قيمة كل كفاف ق الطول. وأخيرا، وتناسب هذه البيانات إلى المعادلة. (1) بغية انتزاع طول استمرار لأنيبيب معين، أو لميكروتثبول كثيرة في نفس الفحص مزلق.

طريقة قوية بما فيه الكفاية للعمل مع ميكروتثبول أعدت في مجموعة متنوعة واسعة من الظروف (مع مختلف وكلاء استقرار أو الجزيئات الصغيرة الأخرى منضمة إلى أنيبيب، مع البروتينات أنيبيب ملزمة المرتبطة (خرائط)، أو مع مجموعة متنوعة من الحلول لزجة). في المختبر، وقد استخدمت هذه التقنية لوصف طول استمرار ميكروتثبول بوصفها وظيفة من طول على طول الأنابيب الدقيقة والأنابيب الدقيقة مع مختلف وكلاء الاستقرار. تقييد الرئيسي هو أن ميكروتثبول يجب أن لا يزال لياليupport كينيسين الحركة. منذ كينيسين هو انزيم محرك قوي، وهذا هو تقييد فضفاضة إلى حد ما. من خلال استبدال الأنابيب الدقيقة مع الأكتين وكينيسين مع انزيم الأسرة الميوسين، يمكن قياس طول استمرار الأكتين باستخدام نفس التقنية.

Protocol

1. أنيبيب الانزلاق الفحص حلول للسهم

إعداد مقايسة قبل مزلق.

1. تتبلمر ميكروتثبول 0.5 مغ المسمى قليلة مع fluorophore العضوية مشرق ^22. تركيز التسمية الهدف هو 1 ميكرون من fluorophore في أنيبيب، أو وضع العلامات من الكثافة ما يقرب من 1 في fluorophore dimers تويولين 1،500. متجر في ضوء الغرفة، ودرجة الحرارة حماية بورق الألمنيوم لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. تنقية ^{البيوتين-21} في كينيسين حوالي 1 ميكرومتر. المحل في -80 درجة مئوية في 5 ميكرولتر مأخوذة لاستخدامها في التجارب الفردية.
3. إعداد مقايسة المخزن المؤقت (AB) من imidiazole 50 مم، 50 مم كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، و 4 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl _2)، 2 مم جلايكول الإثيلين tetraacetic حمض (EGTA)، ودرجة الحموضة 6.7. تصفية العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
4. حل الأبقار مصل الزلال المعقدة البيروكسيديز (البيوتين-BSA) إلى 2 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة.المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
5. حل streptavidin (SA) إلى 10 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 20 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
6. حل α-الكازين إلى 5 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
7. حل dithiothreitol (DTT) في الماء منزوع الأيونات في 200 ملم. المحل في -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة.
8. حل باكليتاكسيل (PT) في الصف HPLC سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في 4 مم. متجر في 10 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C المدى الطويل، -20 ° C على المدى القصير. استخدام في غضون 8 ساعات من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة.
9. حل الجلوكوز في الماء منزوع الأيونات في 120 ملغ / مل. مخزن في 100 ميكرولتر مأخوذة في -20 ° C. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة.
10. ديسحل الأدينوساين ثلاثي (ATP) في الماء منزوع الأيونات في 150 مم، 7.0 درجة الحموضة. متجر في 5 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان.
11. إعداد الأسهم 100X الأكسجين الكسح ^{25 بحلول} حل 10000 أوكسيديز الجلوكوز وحدات وحدات و156،000 الكاتلاز إلى 600 ميكرولتر العازلة الفحص الإجمالي. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج إلى المواد الصلبة بيليه؛ طاف مرشح مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 10 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

2. أنيبيب الانزلاق الفحص، ونفس إعداد الحل اليوم

إعداد الحلول في 2،1-2،6 في يوم التجربة. مع الممارسة، يمكن إعداد حلول 2،2-2،6 خلال تدفق خلايا الغسيل. ما لم يذكر خلاف ذلك، والحفاظ على حلول الأسهم على الجليد.

1. إعداد AB، 1 مل من العازلة مقايسة مع 10 ميكرولتر من DTT الأسهم (AB مع DTT ملم 2). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد الحيوي BSA العازلة، 40 & مو؛ لتر من خليط 1:1 من المخزون البيوتين-BSA وAB. تبقي في درجة حرارة الغرفة.
3. إعداد BSA العازلة، خلط 645 ميكرولتر من AB مع 5.5 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل BSA في AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
4. إعداد SA العازلة، والاختلاط 57 ميكرولتر من AB مع 3 streptavidin الأسهم ميكرولتر (0.5 ملغ / مل في streptavidin AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
5. إعداد α-الكازين العازلة، خلط 200 ميكرولتر من العازلة BSA، و 50 ميكرولتر الأسهم الكازين، و 0.8 ميكرومتر ATP ميكرولتر من 15 (1 ملغ / مل α-الكازين، 0.8 ملغ / مل BSA، و 50 نانومتر في ATP AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
6. إعداد مضان مكافحة التبييض العازلة، والاختلاط 95 ميكرولتر العازلة الكازين-α، 2.5 ميكرولتر الجلوكوز المخزون، 1 ميكرولتر مزيج الأكسجين 100X الكسح، 1 ميكرولتر الأسهم باكليتاكسيل، 1 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (βME). إضافة βME تحت غطاء محرك السيارة الدخان. استخدام مضان مكافحة التبييض عازلة داخل 1 ساعة إعداد تنبيه: βME شديد السمية ورائحة فظيعة. تأكد من فتح فقط تحت غطاء محرك السيارة الدخان. متجر في زجاجةغياب الضوء؛ ضوء يحط βME وقدرتها على خفض photobleaching.

3. أنيبيب الانزلاق الفحص

1. بناء الممرات حول تدفق الأربع بين ساترة × 24 مم 60 و 22 × 22 مم باستخدام ساترة الشحوم فراغ، مقذوف من حقنة من خلال تلميح ماصة، كفاصل. يجب أن تكون كل حارة تدفق حوالي 10 ميكرولتر من حيث الحجم (حجم اللاحقة وفقا لذلك النطاق).
2. يغسل 10 ميكرولتر من العازلة الحيوي BSA في كل حارة. احتضان 5 دقائق للسماح للBSA معطف السطوح الزجاجية.
3. يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا البيوتين-BSA، مع الاستمرار في منع سطح الشريحة. استخدام ورق الترشيح أو Kimwipe لإزالة العازلة من الجانب الآخر من الغرفة تدفق، ويجري التأكد من عدم السماح فقاعات الهواء من خلال الذهاب الى غرفة التدفق.
4. غسل ميكرولتر 15 SA-العازلة في كل حارة. الانتظار 10 دقيقة، أو ساعة لتصل إلى 2. فإن streptavidin ربط BSA-البيوتين سطح محدد.
5. يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا SA مع الاستمرار في منع سطح الشريحة.
6. يغسل كل حارة مع 15-α العازلة ميكرولتر الكازين. α-الكازين يساعد منع مزيد غير محددة ملزمة للكينيسين وميكروتثبول على الزجاج.
7. تمييع كينيسين إلى 10 نانومتر في α-الكازين العازلة ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا كينيسين - α-الكازين الحل. الانتظار 15 دقيقة (أو ما يصل إلى ساعة واحدة) لكينيسين المعقدة البيروكسيديز لربط تحديدا إلى streptavidin سطح محدد. والمحرك المجالات كينيسين تظل حرة في ربط الأنابيب الدقيقة.
8. تمييع باكليتاكسيل إلى 40 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة α-الكازين العازلة، ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا الحل لتغسل كينيسين الحرة ومسبقا تحميل كل غرفة تدفق بمحلول باكليتاكسيل لمنع ميكروتثبول من depolymerizing. depolymerizes الباردة أيضا ميكروتثبول، لذلك تأكد من هذه الخطوات تحدث في درجة حرارة الغرفة مع غرفة temperatuإعادة الحلول.
9. تمييع fluorescently المسمى ميكروتثبول 1:100-1:1،000 في مكافحة التبييض العازلة مضان مع ATP مم 1. غسل ميكرولتر 15 في مسار واحد ونلاحظ في غضون 30 دقيقة.

4. جمع البيانات

1. مراقبة مزلق باستخدام المجهر مضان ميكروتثبول؛ مطلوب المجهر قادرة على حل واحد fluorophores مثل الإعداد TIRF تجارية أو بناء ^منزل-26 (الشكل 2).
   وينبغي دفع ميكروتثبول من قبل محركات كينيسين على الركيزة في حوالي 0.5 ميكرون / ثانية، اعتمادا على درجة الحرارة. إذا كان الحقل من رأي من المجهر هو 50 ميكرون، وينبغي أن تكون واضحة ميكروتثبول الفردية لحوالي 100 ثانية. تعيين شدة الإضاءة بحيث fluorophores واحد لا photobleach بسرعة أكبر من 100 ثانية. في حالة استخدام الإثارة الليزر، وهو وضع قوة حوالي 3-5 ميغاواط مناسبا.
2. جمع متواليات من الصور للتحليل. 600 الصور في5 هرتز (2 إجمالي دقيقة) يعمل بشكل جيد. استخدام تسلسل طويلة بما فيه الكفاية أن ميكروتثبول اجتياز كامل مجال للرؤية.

5. تحليل البيانات

روتين IDL، get_lp.pro يتم إرفاق. هذا الروتين بإرجاع قيمة طول استمرار بناء على كل مزلق ميكروتثبول في تسلسل الصور معين. إما تشغيل هذا الروتين في كل تسلسل الصور، وتعديل المعلمات اعتمادا على شدة الإعداد المجهر معينة، أو القيام بما يلي:

1. تتبع كل fluorophore تعلق على أنيبيب لخلق مسارات fluorophore.
2. الجمع بين جميع المسارات من fluorophores على أنيبيب نظرا إلى مسار أنيبيب الشاملة؛ تكرار لكل أنيبيب في تسلسل الصور (الشكل 3).
3. حساب الزاوية الظل الى كل نقطة على طول المسار (الشكل 4)، وحساب θ _سبت> في المعادلة. 1 من المتوسط ​​جيب تمام الزاوية من الفرق لكل زوج من نقاط مفصولة ق مسار بطول (الشكل 5). العثور على طول استمرار لأنيبيب واحد أو مجموعة من الأنابيب الدقيقة من قبل θ _سبت> لالمعادلة. 1، الترجيح نقاط البيانات الفردية في مجال التجهيزات من قبل عدد من القيم مستقلة عن كوس θ _ق التي يتم استخدامها لحساب المتوسط.

النتائج

ويرد لقطة من الفحص مزلق في الشكل 2. A الكثافة أنيبيب الجيد هو ميكروتثبول 1-10 في مجال الرؤية؛ حد كبير سوف يؤدي إلى مزيد من mistracking كما ميكروتثبول عبر بعضها البعض. ويرد مؤامرة من مسارات أنيبيب 11 من مقايسة مزلق في الشكل 2 في الشكل 3. مسارات نموذجية م...

Discussion

قياسات طول استمرار هي توصيف جيد من الخواص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية الفردية. في هذه المقالة، ووصف لنا طريقة لقياس طول استمرار ميكروتثبول. كما لوحظ في المقدمة، ويمتد هذا الأسلوب بسهولة إلى دراسة الخصائص الميكانيكية أنيبيب في مجموعة متنوعة من الظروف ببساطة من...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
إيميدازول	سيغما الدريخ	I2399
كلوريد البوتاسيوم	سيغما الدريخ	P9541
المغنيسيوم الكلوريد	سيغما الدريخ	M8266
EGTA	سيغما الدريخ	E3889
BSA	Calbiochem	126615
المعقدة البيروكسيديز BSA	الحرارية العلمية	29130
α-الكازين	سيغما الدريخ	C6780
streptavidin	الحرارية العلمية	21125
dithiothreitol	سيغما الدريخ	D0632
باكليتاكسيل	LC المختبرات	P-9600
الجلوكوز أوكسيديز	سيغما الدريخ	G2133
الكاتلاز	سيغما الدريخ	C100
الجلوكوز	سيغما الدريخ	G8270
ATP	سيغما الدريخ	A2383
2-المركابتويثانول	سيغما الدريخ	M3148	السامة. شراء كمية صغيرة.
24X60 مم رقم 1 1/2 كوب غطاء	VWR	48393-252
22X22 مم رقم 1 كوب غطاء	الذهب خاتم	3306
الشحوم عالية الفراغ	داو كورنينج-	NA
TIRF المجهر	NA	وكان المجهر TIRF المستخدمة في هذه الطريقة محلية الصنع.
IDL (البرمجيات)	Exelis	NA