JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تجربة تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية ضرورية لقدرة الدماغ على التكيف استجابة للتحديات السلوكية. على في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير هنا طريقة التي تسمح للتتبع مثل هذه التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية من خلال ترميز للصحفيين وراثيا.

Abstract

قدرة الدماغ على تغيير استجابة لتجربة أمر ضروري لوظيفة الدماغ صحية، وتشوهات في هذه العملية تسهم في مجموعة متنوعة من 1،2 اضطرابات الدماغ. لفهم أفضل للآليات التي دوائر المخ تستجيب لتجربة الحيوان يتطلب القدرة على رصد التغيرات الجزيئية التي تعتمد على الخبرة في مجموعة معينة من الخلايا العصبية، على مدى فترة طويلة من الزمن، في الحيوانات الحية. بينما هو معروف الخبرة والنشاط العصبي لتحريك التغييرات المرتبطة التعبير الجيني في الخلايا العصبية 1،2، أكثر من الأساليب للكشف عن مثل هذه التغييرات لا تسمح المراقبة المتكررة من الخلايا العصبية نفسها خلال الأيام متعددة أو لم يكن لديك ما يكفي من القرار لمراقبة الخلايا العصبية الفردية 3 ، 4. هنا، نحن تصف طريقة يجمع بين الجسم الحي في اثنين من الفوتون المجهري مع مراسل الفلورسنت المشفرة وراثيا لتتبع التغيرات التي تعتمد على تجربة التعبير الجيني في الخلايا العصبية القشرية الفردية على بالطبع من يوم إلى يوم التجربة.

واحد من الجينات التي تعتمد على تجربة راسخة هي نشاط التنظيم البروتين يرتبط بها من هيكل الخلية (قوس) 5،6. نسخ من قوس هو بسرعة والتي يسببها النشاط المكثف للغاية من قبل الخلايا العصبية 3، والبروتين الناتج ينظم الإلتقام مستقبلات الغلوتامات من وطويلة الأجل اللدونة متشابك 7. وقد تم التعبير عن قوس تستخدم على نطاق واسع كعلامة الجزيئية لرسم خريطة الدوائر العصبية المشاركة في سلوكيات معينة 3. في معظم تلك الدراسات، تم الكشف عن قوس التعبير في الموقع التهجين أو المناعية في المخ أقسام ثابتة. على الرغم من كشف هذه الأساليب التي تم ترجمة تعبير عن قوس إلى مجموعة فرعية من الخلايا العصبية مثير بعد تجربة السلوكية، وكيف تم التحقيق في أنماط لا الخلوية التعبير القوس قد تتغير مع نوبات متعددة من التجارب المتكررة أو مميزة خلال الأيام. ntent "> في الجسم الحي ثنائي الفوتون المجهري يوفر وسيلة قوية لدراسة تجربة تعتمد على التغيرات الخلوية في الدماغ المعيشة 8،9. لتمكين الفحص التعبير قوس في الخلايا العصبية الحية من قبل اثنين من الفوتون المجهري، ونحن ولدت في السابق للخبط في خط الماوس التي يتم وضعها مراسل GFP تحت سيطرة المروج قوس الذاتية 10. هذا البروتوكول يصف الاستعدادات والإجراءات الجراحية التصوير لتتبع التجربة التي تعتمد على أنماط التعبير GFP في قوس الفرق العصبية في الحيوانات الحية. في هذه الطريقة ، تم زرع Windows أولا الجمجمة المزمنة في قوس GFP الفئران فوق المناطق القشرية في المصالح. تم تصويرها ثم تلك الحيوانات مرارا وتكرارا من قبل اثنين من الفوتون المجهري بعد نماذج السلوك المطلوب على مدى عدة أيام، وهذا الأسلوب قد تكون قابلة للتطبيق عموما للحيوانات تحمل للصحفيين الفلورسنت الأخرى من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية 4.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل المعهد الوطني للصحة النفسية ورعاية الحيوان اللجنة استخدم وكانت وفقا للمعاهد القومية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. قبل العملية إعداد

  1. تنظيف جميع الأدوات في التعقيم حبة الساخنة قبل الجراحة العقيم، وتنظيف موقع الجراحة مع الايثانول 70٪، وانخفاض اخماد الملابس النظيفة. ارتداء قفازات معقمة. تخدير الحيوان مع الطازجة حل AVERTIN 1.2٪، عند 0.02 مل تعطى / ز، intraperitonially. بدلا من ذلك، تخدير بالغاز isoflurane من خلال مخروط الأنف، و 5٪ للتجنيد، 1.5٪ للصيانة، مع دائرة زبال السلبي. تحقق من مستوى التخدير باستخدام الذيل أو إصبع القدم القرصات لضمان تخدير كامل.
  2. تغطية عيون الحيوان مع مرهم معقم للعين، وحقن ديكساميثازون الطازجة (0.2 ملغ / كلغ) وكاربروفين (5 ملغ / كلغ) subcutaneouslY لمنع التورم والالتهاب في الدماغ 11. حلق شعر أكثر من الجمجمة بين الأذنين، وتعقيم الجلد مع فرك betadine وثلاثة مسحات بالتناوب من الايثانول 70٪.
  3. تحميل الحيوان في مرحلة جراحة التجسيمي مع earbars، مع التدفئة وسادة تحت الماء تداول مجموعة الحيوانات في 37 ° C. تحقق بانتظام مستويات التخدير الحيوان، واستكمال جرعة مخدر الأصلي حسب الحاجة.
  4. تضخ 200 ميكرولتر من 0.5٪ Marcaine تحت الجلد فروة الرأس لتخدير المنطقة. شق الجلد وإزالة الجلد فوق رفرف الجمجمة. إزالة السمحاق وتجفيف المنطقة مع قطعة قطن نظيفة.

2. جراحة الجمجمة نافذة المزمنة

  1. استخدام الحفر عالية السرعة الأسنان مع لدغ 0.5 مم لتوضيح بلطف 3-5 مم دائرة حول منطقة الدماغ من الفائدة. الرطب بشكل دوري في موقع الحفر مع 0.9٪ العقيمة المالحة الغبار العظام واضحة بعيدا مع قطعة قطن نظيفة. إذا كان ينزف العظام، استخدم زelfoam presoaked مع ملحي معقم لطخة على تنزف وانتظر حتى يتوقف.
  2. عند الوصول إلى طبقة العظام الماضي، رفع وإزالة العظام الجزيرة مع غرامة ذات الرؤوس ملقط. قد يكون واجه مرفقات الجافية إلى الرف السفلي من العظام إذا كان إطار يعبر خياطة العظام. يجب إزالة هذه بلطف ورفع رفرف العظام.
  3. مبلل بلطف لفة هلام الرغوة على الجافية يتعرض لتنظيف سطحها وانتظار أي نزيف الجافية لوقف خطوة حاسمة: لا تقم بالمتابعة حتى جميع النزيف قد توقف الجافية. الدم الذي يصبح محاصرين داخل إطار الجمجمة عادة ما يؤدي إلى نافذة معتمة.
  4. إذا كانت المنطقة قد تهم تحت موقع حيث الجافية سميكا خاصة، وإزالة دورا أعلاه يكون من الضروري. إذا كانت هذه هي الحالة، فصل بلطف الجافية من الحنون أدناه مع ملقط دقيق جدا، وجعل شق صغير في بلدة دورا رفع مع زوج آخر من ملقط غرامة، فهم ثم حواف قطع وبلطفتقسيم الجافية. ولكن الجافية رقيقة قوية، لذا يجب الحرص على عدم شريحة الدماغ مع حواف سليمة من دورا.
  5. شطف المنطقة مع ACSF معقمة أو ملحي معقم.
  6. إرساء ساترة زجاجية معقمة (3-5 ملم) على الجافية أو PIA خطوة حاسمة: إذا منحنيات الجمجمة المحيطة بشكل كبير، استخدم Kwiksil 12 لاصقة لملء الفراغات في دورا حيث الحنون أو لن تجعل اتصال وثيق مع ساترة في المناطق لن يمكن تصوير ذلك.
  7. استخدام هلام CYANOACRYLATE لتغطية اصقة المطاط الصناعي وحواف ساترة الزجاج. تغطية الجمجمة بأكملها تتعرض مع هلام CYANOACRYLATE، أو خليط الإسمنت والأسنان krazyglue خطوة حاسمة: عدم السماح لأي هلام CYANOACRYLATE لتلمس سطح الدماغ.
  8. تضمين رأس معدنية مصنوعة خصيصا شريط التثبيت في الطرف المقابل من الجمجمة.
  9. العودة الحيوان إلى غرفة الإنعاش الدافئة، بعد حقنة intraperitonial من كيتوبروفين، 5 مغ / كغ، FOص إدارة الألم. مواصلة مسكن ليومين آخرين بعد العملية.
  10. بعد أسبوعين من الانتعاش بعد الجراحة، تخدير الحيوان مع isoflurane (5٪ للتحريض، 1.5٪ للصيانة)، تركيبها في مرحلة المجهر حسب الطلب مع إطار وجها لتثبيت، والتحقق من النافذة الجمجمة من أجل الوضوح البصري تحت الإضاءة مع اللون الأزرق الفاتح. الأوعية الدموية في الدماغ وضوح السطح يدل عالية الجودة من النافذة في الجمجمة. إذا تم تعريف بشكل حاد الحواف الأوعية الدموية، الإطار من المرجح أن يكون صالحة للاستعمال. وأوصت لمدة أسبوعين وقت الشفاء بعد الجراحة لإتاحة الوقت الكافي للحيوان للتعافي من عملية جراحية. نوافذ الجمجمة عادة مسح وتحسين وخلال هذا الوقت، وتبقى شفافة بصريا لأسابيع إضافية لأشهر حتى إعادة نمو الجمجمة أو سماكة في دورا يحط جودة الإطار.

3. بروتوكول السلوكية والليزر المسح الضوئي ثنائي الفوتون المجهري

  1. ج الحيوانات مع واضحةسوف يتعرض لنوافذ ranial حافزا البيئية أو التعرض للدورة تدريبية السلوكية، وبعد ذلك التقط ثم في وقت التعبير GFP قوس القصوى. قبل البدء في بروتوكول السلوكية، يجب أن تبقى الحيوانات في قفص بيئة منزلية متسقة للحد من يوم إلى يوم التباين في مستويات خط الأساس التعبير قوس GFP.
  2. بدء التدريب السلوكي أو نماذج التحفيز البيئي، اعتمادا على منطقة في الدماغ من الفائدة. على سبيل المثال، يمكن أن يتعرض لبيئات الحيوانات البصرية المختلفة على مدى أيام متتالية، وتصوير كل يوم بعد التحفيز التحفيز البصري لتحديد استجابات محددة في القشرة البصرية 10.
  3. قوس GFP مضان عادة في الخلايا العصبية تصل إلى أعلى مستوياته بعد ساعتين التحفيز. قد يكون الأمثل الجدول الزمني التجريبية لتسهيل الكشف عن قوس GFP التعبير في الخلايا العصبية عند مستوياتها مضان الذروة.
  4. بعد جلسة التدريب السلوكي أو environmentaاكتمال التحفيز لتر، تخدير الحيوان مع isoflurane (5٪ للتحريض، 1.5٪ للصيانة) وجبل الحيوان في المرحلة المجهر حسب الطلب مع وجها لتثبيت الإطار تحت المجهر ثنائي الفوتون.
  5. يتم إصلاح الموقف الحيوان التوجه إلى الإطار وجها لتثبيت أن يربط مباشرة إلى مرحلة، وذلك باستخدام قضيب معدني مزروع في الجمجمة. يتم تزويد مستمر Isoflurane والأكسجين إلى الماوس من خلال مخروط الأنف. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة.
  6. ضمان حماية أجهزة كشف المجهر من الإضاءة المحيطة عن طريق إجراء مسح ثنائي الفوتون الليزر في غرفة مظلمة. استخدام الغمر بالماء 20X 25X أو (1.05 الفتحة العددية) عدسة للتصوير. أولا، في إطار البرنامج الموسع للتمنيع، مضان الإضاءة، والحصول على صورة من أنماط سطح الأوعية الدموية في الدماغ على المنطقة في المصالح مع كاميرا CCD لمحاذاة الصورة في المستقبل.
  7. بدء ثنائي الفوتون مسح بالليزر للحصول على كومة صورة 3-D. وأوليمبوس FV1000يستخدم MPE متعدد الفوتون المجهر في الإعداد لدينا. تم تعيين الإثارة موجة ذات طول ليزر ثنائي الفوتون في نانومتر 920، وتعيين قوة الليزر المنبعثة من الهدف في ما يقرب من 50 ميغاواط. تم الكشف في وقت واحد مضان المنبعثة في قنوات الأخضر والأحمر (مرآة مزدوج اللون في 570 نانومتر، والمرشحات حاجز 495-540 نانومتر في و570-625 نانومتر)، وذلك باستخدام خارجي الكشف photomutiplier نظام ثنائي القناة وضعت على مقربة من العينة. قوس GFP مضان يظهر فقط في القناة الخضراء، في حين الأنسجة لصناعة السيارات في مضان يظهر في كل القنوات 13 و 14.
  8. مداخن الصورة النمطية لها أبعاد حوالي 320x320x100 ميكرومتر (العرض العمق X X الطول)، والدقة الأفقية من 0.5 ميكرون / بكسل، ودقة رأسية من 3 ميكرون / بكسل.
  9. بعد الحصول على كومة الصورة، والعودة إلى قفص الحيوان وطنه. لا تخل الحيوان حتى السلوكية المقبل والدورة التصوير. تكرار السلوك والإجراءات التصوير عبر يوما ديزيريهأد. استخدام سطح الدماغ المكتسبة سابقا الصورة الدم السفينة لتوجيه مرة أخرى إلى الموقع نفسه التصوير.

النتائج

يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع التجربة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية في الحيوانات الحية. وإنشاء أول نافذة المزمنة الجمجمة على منطقة القشرية ذات الأهمية في ماوس يحمل مراسل الفلورسنت في التعبير الجيني. ويمكن بعد ذلك اثنين من ?...

Discussion

وطريقة التصوير في الجسم الحي وصفها هنا يمكن فحص المتكرر للقوس التغييرات التعبير الجيني في الخلايا العصبية مجموعات نفس خلال الأيام متعددة في الحيوانات الحية. انها وسيلة فعالة ومرنة للحصول على معلومات حول الديناميات اللدونة العصبية الجزيئية ذات الصلة في الخلاي?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

الكتاب أود أن أشكر L. لمعدات التصوير Belluscio الجراحة، D. كوون المساعدة للتصوير، K. ليو لتحرير الفيديو المساعدة، وماكلويد K. لجميع موسيقى خلفية. KW يعترف بدعم سخي من شعبة NIMH من برامج بحثية ضمن الجدران والجينات، والإدراك وبرنامج الذهان. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث NIMH ضمن الجدران (VC، YY، SMKW) وشعبة NIAAA من ضمن الجدران برنامج البحوث السريرية والبيولوجية (VC، RMC، DML).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم معدات شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
FV1000 المسح بالليزر متعددة الفوتون المجهر OLYMPUS FV1000MPE التصوير
تشريح المجهر Omano 555V107 جراحة
Stereotaxis مرحلة عملية جراحية لالفئران جهاز هارفارد 726335 جراحة
20X 25X الهدف أو الغمر بالماء OLYMPUS XLPL25XWMP التصوير
مرحلة المجهر مع وجها لتثبيت الإطار والعرف N / A التصوير
غرامة ملقط أدوات العلوم الجميلة 11251-20 جراحة
حفر الأسنان لدغ أدوات العلوم الجميلة 19007-05 جراحة
CCD كاميرا QImaging QICAM 12-بت التصوير

References

  1. Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
  2. Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
  3. Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
  4. Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
  5. Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
  6. Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
  7. Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
  8. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).
  9. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  10. Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
  11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
  12. Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  14. Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
  15. Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
  16. Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
  17. Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  18. Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
  19. Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

71 GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved