وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Summary

نقدم تقنية الخلايا العصبية لوصفها واحد في الجهاز العصبي المركزي (CNS) من ذبابة الفاكهة الأجنة، والذي يسمح تحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية من قبل أي من الضوء المرسل أو المجهري متحد البؤر.

Abstract

في هذه المادة ونحن تصف كيفية تسمية فردي الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الجنينية من ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا عن طريق الحقن juxtacellular من محبة للدهون الفلورسنت الغشاء علامة مبادرة ديزرتك الصناعية. هذا الأسلوب يسمح للتصور شكل الخلية العصبية بقدر كبير من التفصيل. فمن الممكن لتسمية أي خلية في الجهاز العصبي المركزي: أجسام الخلايا من الخلايا العصبية المستهدفة هي تصور البصريات تحت DIC أو عن طريق التعبير عن علامة وراثية الفلورسنت مثل GFP. بعد وضع العلامات، يمكن أن تتحول إلى مبادرة ديزرتك الصناعية إلى البني وصمة عار دائمة من قبل photoconversion للسماح التصور من شكل الخلية مع الضوء والبصريات المنقولة DIC. وبدلا من ذلك، يمكن ملاحظة الخلايا مبادرة ديزرتك الصناعية التي تحمل علامات مباشرة مع المجهري متحد البؤر، مما يمكن من عرض وراثيا colocalised البروتينات الفلورية مراسل. ويمكن استخدام هذه التقنية في أي حيوان، بغض النظر عن التركيب الوراثي، مما يجعل من الممكن لتحليل الظواهر متحولة في قرار خلية واحدة.

Introduction

مورفولوجيا الخلايا العصبية المعرفة على مستوى الخلايا الفردية شرطا مسبقا أساسيا لفهم وظيفة الخلايا العصبية والاتصال CNS. وهكذا، منذ الأيام الأولى لعلم الأعصاب، وسعى الباحثون لتطوير أساليب التصنيف واحد الخلية (انظر ⁷ لعلاج التاريخية لهذه المسألة). الطرق التقليدية مثل تلطيخ جولجي تقديم قرار ممتاز من مورفولوجيا الخلايا العصبية ولكن ليست مناسبة إذا كان أحد يسعى لتسمية نوع معين من الخلايا العصبية بطريقة موجهة، وتلطيخ يحدث بطريقة عشوائية. تناولت تطوير أساليب لتلطيخ الخلايا واحدة عن طريق الحقن داخل الخلايا أو juxtacellular من الأصباغ من مسرى مكروي شرط وضع العلامات المحددة.

تقديم الطلب من واحد حقن صبغة الخلايا العصبية لذبابة الفاكهة تحديا كبيرا، نظرا لصغر حجم الكائن الحي على حد سواء والخلايا العصبية لها. ومع ذلك، وتلطيخ الخلايا العصبية الجنينية واحدة من ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية في منتصف 1980s في مختبر كوري جودمان ^15. في حين أن طريقة كانت مفيدة بارز وقدم بعض الأفكار الرئيسية في آليات للتنمية الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة على مدى 20-30 سنة الماضية (على سبيل المثال ^{2، 10)،} وقد أحجم العديد من العمال بعيدا عن ذلك، إلى حد كبير بسبب مطالبها الفنية.

وقد ساهم توفر في السنوات الأخيرة من التقنيات الوراثية لوضع العلامات العصبية في ذبابة الفاكهة أيضا إلى عدم شعبية واحدة حقن الخلايا العصبية صباغة. يمكن التعبير GAL4 الموجهة من يبني GFP غشاء المستهدفة توفير تحليل ممتاز من التشكل العصبية ^{1، 20.} ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له بعض القيود: التعبير غالبا ما لا مفر منه من GFP في خلايا متعددة يمكن أن يحجب هيكل الخلايا العصبية الفردية وخط سائق GAL4 قد لا تكون متاحة لدفع التعبير في الخلايا العصبية خاصة في المصالح. وMARCM (تحليل الفسيفساء مع معدل تقييميمكن ressible ماركر الخليوي) الطريقة ⁸ من الخلايا العصبية وصفها توفير أي أساسا على مستوى خلية واحدة، ولكن لا يمكن استخدامها بنجاح في وقت مبكر الجنين واليرقة بسبب بطء دوران من البروتين GAL80.

ونظرا لهذه القيود لوضع العلامات الوراثية، ونحن نعتقد أن الخلايا العصبية صبغة واحدة حقن الجنين في ذبابة الفاكهة لا تزال تقنية قيمة وتستحق أوسع التطبيق. لتعزيز هذا الهدف، ونحن نقدم هنا وصفا مفصلا للأسلوب. وتقدم مثالا للقوة من قبل حسابنا الأخير للمورفولوجية مجموعة كاملة من interneurons في neuromeres البطن من الجنين ذبابة الفاكهة أواخر ^14. وهذه الدراسة التي كشفت كل من تقلب المورفولوجية من أنواع الخلايا العصبية الفردية ومبادئ منظمة قسيم عصبي في الجهاز العصبي المركزي للجنين، لم يكن ممكنا مع أي وسيلة أخرى وضع العلامات المتاحة حاليا.

Protocol

وقد استخدمنا الخيارين مختلف قليلا من أسلوب الخلايا العصبية وسم واحد في مختبراتنا. الاختلافات تتعلق جمع الجنين، dechorionisation، devitellinisation والخطوات ولبة الجنين. الشكل 1 لمحة عامة عن الخطوات المشتركة والمتباينة من المتغيرات.

1. إعداد الصغرى، الإبر لتشريح الأجنة وMicropipettes لحقن صبغ

1. يتم رسمها الإبر الزجاج لتشريح الجنين من الشعيرات الدموية الزجاج (1 مم و 0.1 مم سمك الجدار) مع مجتذب سوتر (العلوم الصكوك) أو معدات قابلة للمقارنة. بدلا من ذلك، يتم استخدام شحذ الكهربائي التنغستن مم 0،15 الأسلاك التي شنت في حامل إبرة تشريح ل. (وأعطيت تعليمات لشحذ كهربائيا في ^9).
2. يتم رسمها micropipettes حقن الصبغة من الشعيرات الدموية رقيقة الجدران الزجاجية مع خيوط الداخلية (العلوم المنتجات؛ GB 100 TF 8P) مع مجتذب سوتر (العلومصكوك) أو معدات قابلة للمقارنة. غيض micropipette يجب أن يكون حادا، مع تفتق وتدريجية الموحد للعرقوب لمساعدة المرور عبر أنسجة الجنين. وmicropipette المطلوب هو "مسرى مكروي مقاومة عالية، وشارب طويل و" متنوعة، كما هو موضح في دليل p.20 من الصك سوتر الماصة كتاب الطبخ ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). عموما، يتم سحبها micropipettes قبل فترة وجيزة يتم تنفيذ الحقن لضمان البقاء على نصائح حادة ونظيفة.

2. جمع وتركيب وتشريح الجنين

1. وصف مجموعة الجنين. لقد استخدمت بنجاح في طريقة الحقن الخلايا العصبية في الأجنة من هنا مراحل 12 حتي ¹⁷ مارس. الأجنة التطوير التدريجي لبشرة خلال مرحلة 17 و يصبح من الصعب على نحو متزايد لتشريح. نهجين البديلة المتاحة للحصول على مbryos في مرحلة تنموية معينة.
   1. السماح الذباب لتضع بيضها بين عشية وضحاها على لوحات أجار عصير التفاح المغلفة مع معجون الخميرة. ضبط درجة حرارة جمع البيض لتتناسب مع الوقت المقرر للحقن في اليوم التالي. جمع كل البيض في اليوم التالي وحدد الأجنة في مرحلة المطلوب باستخدام معايير مورفولوجية ^3.
   2. السماح الذباب لتضع على لوحات أجار على النحو الوارد أعلاه، ولكن مبادلة خارج لوحة أجار مع واحد جديد كل ساعة 1،5 في 25 ° C. احتضان كل لوحة لفترة زمنية محددة، حتى الأجنة قد وصلت إلى مرحلة التطوير المطلوبة.
2. 1. Dechorionation الكيميائية. استخدام ملعقة معدنية لكشط قبالة أجار الأجنة ونقلها إلى سفينة الزجاج (على سبيل المثال طبق بتري أو تجويف كتلة) التي تحتوي على ما يقرب من 10 مل أو ذبابة الفاكهة قارع الأجراس الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الحل. إضافة بضع قطرات من التبييض المركزة وتستنهض الهمم لبضع دقائق علىدوارة منصة حتى قشور المشيماء من الأجنة. غسل الأجنة في العديد من التغييرات من قارع الأجراس / PBS حتى لا تكون رائحة التبييض المتبقية. خلال هذه يغسل، تأكد من أن الأجنة لا تتلامس مع سطح السائل. خلاف ذلك، فإنها تطفو ويصبح من الصعب يغرق للتلاعب في وقت لاحق. بدلا من ذلك، أن يتم الكيميائية dechorionation من باستخدام تقنية سلة صفها ^4.
   2. dechorionation الميكانيكية (انظر الشكل 2، الخطوات 1-4). الأجنة نقل من لوحة أجار إلى شريحة مغطاة على الوجهين شريط لاصق. تجنب نقل الأجنة أجار مع لأنها سوف تتداخل مع التصاق على الشريط. السماح لتجف الأجنة لمدة 5 إلى 10 دقائق حتى يحصل المشيماء هشة قليلا. (وفي انتظار، معطف ساترة اللازمة لdevitellinisation وقت لاحق مع الغراء - أنظر أدناه 2.3B). لمس كل الجنين بلطف مع إبرة. فإن المشيماء تقسيم مفتوحة والجنين سوف تلتزم شمال شرقedle. نقل الأجنة مباشرة إلى كتلة أجار لمنع جفاف ومحاذاة نحو 10 منهم في صف واحد، مع الجانبين بطني مواجهة.

تتم Devitellinisation والتعصيب يدويا باستخدام أي من الطريقتين الموضحة في 2.3A 2.3B و.

3. 1. نقل الجنين واحدة من dechorionated المرحلة التنموية المناسبة من طبق من حل قارع الأجراس لعدة قطرات من قارع الأجراس في سد سيليكون على شريحة المجهر معدة سلفا. (جعل السد 3 سم مربع من تلطيخ طبقة رقيقة من السيليكون تسرب على شريحة المجهر، ثم تضاف قطرة من حل بولي يسين-L-0.01٪ لوسط السد. السماح للسيليكون لعلاج لمدة 24 ساعة.) نقل الجنين مع ماصة باستور الزجاج، وضمان أن يبقى الجنين تحت سطح قارع الأجراس أثناء النقل.
      يستعدوا نهاية الخلفي من الجنين مع زوج من ملقط غرامة، في حين بلطف squeezجي الجنين مع زوج من مقص قطع القزحية الجميلة، نحو ربع في طريق العودة من نهايتها الأمامية. لا قطع الحق من خلال الجنين. والهدف من ذلك هو للقضاء فقط مفتوحة الغشاء المحي بينما تسبب أضرار قليلة في منطقة جنين. مع ملقط لا يزال في الموقف، استخدام إبرة التنغستن لتخفيف الجنين من الغشاء فتح وضعه أسفل الجانب البطنية على الشريحة. يجب أن الجنين التمسك معطف بولي يسين.
      فيليه الجنين مع إبرة التنغستن شحذ. خرم بلطف، ثم تمزق جدار الجسم على طول خط الوسط الظهرية. باستخدام إبرة، ودفع إلى أسفل على جدار الجسم بحيث تلتزم الشريحة. لمنع تلف جدار الجسم، ودفع جدار الجسم مع القناة الهضمية موسط بينه وبين الإبرة و. ثم استخدم إبرة المسيل للدموع من خلال القناة الهضمية في أهدافها الأمامي والخلفي ورفعه بعيدا. إذا رغبت، يمكن أن تنتقل الأجنة إضافية إلى الشريحة نفسها، وشرائح devitellinised، مع الحرص على عدم الاضرار الأجنة الأخرى بالفعل علىالشريحة.
   2. معطف 24 × 60 ملم مع ساترة الغراء هيبتان (انظر الجدول 1) عن طريق وضع قطرة صغيرة من الغراء في وسط الشريحة ونشرها مع ساترة × 18 مم 18 إلى طبقة رقيقة جدا. وضع ساترة على شريحة المجهر وجعل إطار من شريط لاصق من جانب واحد في جميع أنحاء أطرافها. قطع بعيدا أجار كتلة الزائدة من عقد من 10 صف الأجنة، المس بلطف الأجنة مع ساترة ساترة الغراء هيبتان. ينبغي أن تلتزم الآن إلى ساترة مع الجانبين أسفل بطني. إضافة كمية سخية من PBS لتغطية الأجنة (انظر الشكل 2، الخطوات 4-6).
      اختراق الغشاء المحي مع كوب أو إبرة التنغستن على الجانب الظهري من كل جنين قرب نهايته الخلفية. فتح الغشاء تمزق على طول خط الوسط الظهرية واسحب الجنين من الغشاء. توجيه الجانب الجنين إلى أسفل بطني في مكان آخر على الركيزة الغراء هيبتان وشرائح باستخدام نفس الأسلوب وصفها في 2.3A) (انظرالرقم 2، الخطوات 7-8). منذ سيتم شرائح عدة أجنة على الشريحة نفسها، فإنه من المفيد أن تكون دقيقة للغاية مع إما ميولهم أو إجراء رسم ميولهم على الشريحة.
4. ثم بعد التقطيع إلى شرائح، قد تكون الأجنة ثابتة طفيفة لمدة 10-15 دقيقة في الفورمالديهايد 7.4٪ في برنامج تلفزيوني، بنسبة 4 في PBS يغسل. يجب توخي الحذر الشديد بعدم توجيه الجنين في اتصال مع السطح من الحل خلال هذه العملية، حيث أن القوات التوتر السطحي سوف يدمر الجنين. هذه الخطوة ما قبل التثبيت ليست ضرورية تماما، ولكن من المفيد لمنع تقلص العضلات في جدار الجسم الأجنة ومرحلة متأخرة للمساعدة في استقرار الأنسجة الجنينية في مراحل الشباب. نضع في اعتبارنا أن التثبيت لا تجعل أنسجة الجنين أكثر غموضا نوعا ما وذلك تنازلات جودة الصورة تحت الملاحظة DIC.

3. حقن ملء Micropipettes

ملء نصف أنبوب 0.5 مل إيبندورف مع microfugeحل 0.1٪ من صلاح الغيدان صبغ carbocynanine (مجسات الجزيئية، يوجين، OR) في الإيثانول بنسبة 100٪ (تأكد من استخدام 'الجافة' EtOH المطلقة لتجنب الأمطار صلاح الغيدان). جعل ثقب ضيق في غطاء للأنبوب وضعه نهاية حادة من micropipette من خلال ثقب في الغطاء. السماح للمبادرة ديزرتك الصناعية لتصعد فوق خيوط مدة لا تقل عن 5 دقائق. (أصلي دائما ثقب في الغطاء عندما لا يشغل micropipette لتجنب التبخر من الايثانول).

المعدات اللازمة لحقن الصبغة الخلايا العصبية (الشكل 3).

المجهر. يجب استخدام المجهر المرحلة الثابتة للحقن صبغة الخلايا العصبية لتجنب الحركة الرأسية من خلال التركيز على الجنين. فإن أي حركة من هذا القبيل تهجير ماصة بعد أن تتلامس مع الجنين. لقد تم العثور على كل من Axioskop زايس FS AX50/BX50 والنماذج أوليمبوس مرحلة ثابتة لتكون مناسبة تماما لهذا الغرض. يجب أن تكون مجهزة مع عدسات المجهر المنقولة DIC ضوء لرؤية رجل أعمالإضافات قبل تلطيخ. يجب أن تكون المجهر تستقيم أيضا بدلا من نموذج مقلوب. مع المجهر تستقيم، غيض من micropipette هو على نفس الجانب من الجنين كهدف مشاهدة، بينما مع مجهر مقلوب وهما على طرفي نقيض من الجنين. الترتيب الأخير ينال من نوعية البصريات DIC. يجب تعيين ما يصل المجهر للفحص المجهري مضان، مع مجموعة مرشح مناسب لمراقبة مبادرة ديزرتك الصناعية. منذ مبادرة ديزرتك الصناعية لديها مجموعة واسعة نسبيا مع الإثارة وماكسيما في الانبعاثات و 549 565 نيوتن متر مجموعات تصفية كثيرة في هذا النطاق سوف تعمل، على سبيل المثال تلك المتعلقة اليكسا 568، Cy3، رودامين، تكساس الأحمر أو TRITC. على الرغم من أنها مريحة لتناسب مصراع التحكم الإلكتروني في مسار مصدر الضوء مضان، للسماح تشغيل الغالق دون اتصال جنب مع المجهر، ونحن أيضا وصفت على نحو فعال على الإعداد الذي تم تجهيزه فقط مع مصراع دليل. وأخيرا، تضخم عالية، وارتفاع العددية apertuمطلوب إعادة الغمر بالماء الهدف للمراقبة أثناء الحقن. وينبغي تصميم هذا الهدف للاستخدام دون ساترة. وقد استخدمنا بنجاح Achroplan زايس 100x/1.0W، أوليمبوس LUMPlan 100x/1.0W FL، FL LUMPlan وأوليمبوس / IR 60x/0.9 أهداف W.

مطلوب مياداة مجهرية لوضع ونقل micropipette خلال حقن صبغة الخلايا العصبية. وقد استخدمنا كل من مياداة مجهرية لايكا ومرحلة محمولة على محور Narashige 3-مياداة مجهرية الهيدروليكية.

مطلوب مكبر للصوت داخل الخلايا DC، مع مرفق لحقن الحالي، للحقن iontophoretic من مبادرة ديزرتك الصناعية من micropipette.

4. إجراءات حقن صبغ

1. ضع الشريحة مع الجنين شنت (ق) على مسرح المجهر حقن (الشكل 3). استخدام الهدف 10X لتحديد موقع الجنين وجعله مركز مجال الرؤية.
2. SWجي الهدف السلطة العليا في موقف عرض وتقديم الجنين في التركيز. تحديد موقع الخلية الفائدة في ظل البصريات DIC (أو باستخدام مضان إذا كانت الخلية المستهدفة عن GFP) وجعله مركز مجال الرؤية. ضمان أن يتم فتح الحجاب الحاجز مجال المجهر فقط إلى حافة مجال الرؤية، وليس خارجها. وهناك شعاع الإضاءة الضيقة مساعدة المواقع من micropipette (راجع الخطوة 4.4 أدناه). رفع الهدف حتى يتم على أعلى مستوى ممكن فوق الجنين في حين ما زالت على اتصال مع الحل رينغر / PBS.
3. وضع القطب الكهربائي حمام للمكبر للصوت في العاصمة PBS اضحة جيدا للجنين ومسار micropipette.
4. إدراج micropipette الحقن في حامله، والتي تم شغلها مع حل 0،1 LiCl M. إرفاق حامل micropipette إلى مياداة مجهرية. باستخدام عناصر التحكم مياداة مجهرية الخشنة، ليصبح micropipette في الفضاء بين غيض من موضوعية والجنين.ضمان أن تكون أعلى بكثير من مستوى الجنين. بسبب بعد مسافة قصيرة من العمل والهدف السلطة العليا، فإن micropipette أن تعقد في زاوية الضحلة من أجل جعله التركيز (انظر الشكل 3). سيكون لديك لإنشاء زاوية مناسبة عن طريق التجربة والخطأ في المقام الأول. إذا كانت الزاوية شديد الانحدار، فلن تكون قادرة على الحصول على معلومات سرية micropipette في التركيز. إذا كان ضحلة جدا، فإن رمح micropipette كريهة ضد جدار السد عقد الحل الاستحمام في المكان.
5. مركز غيض من micropipette في مجال الرؤية. لتحقيق هذا، وجلب عينيك إلى مستوى الجنين ونقل micropipette ذهابا وإيابا في المحور Y للمرحلة المجهر. عندما طرفها يعبر مسار الضوء، سوف ترى انعكاس مشرق للأشعة الضوء من ذلك. نقل غيض من micropipette قدما في المحور X بحيث انحرفت شعاع ضوء. سيكون من الأسهل لتحديد موقع micropipette في الصغيرةمجال الرؤية للهدف السلطة العليا إذا كنت تبحث عن رمح، أكثر مما طرفها. ننظر الآن من خلال العدسات المجهر وخفض تدريجيا والهدف السلطة العليا حتى رمح من micropipette يأتي في التركيز. نقل micropipette ذهابا وإيابا في المحور Y مع الضوابط مياداة مجهرية يساعد على تحديد موقعه، لانها تأتي تدريجيا إلى التركيز. عندما رمح هو في التركيز، نقل micropipette في المحور X حتى طرفها تقع في وسط مجال الرؤية. في هذه المرحلة يجب أن يكون تلميح micropipette فوق مستوى الجنين. التحول إلى الإضاءة الفلورية ودراسة تلميح للتحقق من تسرب مبادرة ديزرتك الصناعية. ضبط DC الحالي لمنع أي مبادرة ديزرتك الصناعية من تشكيل الكريستال على الحافة.
6. باستخدام عناصر التحكم مياداة مجهرية، وانخفاض في micropipette Z-المحور. إعادته إلى التركيز مع تركيز الرقابة المجهر. خفض تدريجيا إلى أسفل نحو micropipette الجنين بهذه الطريقة. في البداية، يمكنك أن تفعل ذلك مع الخشنةZ-المحور ضوابط للمياداة مجهرية والمجهر. لكن، وكما يأتي الجنين في التركيز ينبغي أن تقوم بالتبديل إلى السيطرة على المقابض بشكل جيد.
7. عندما سطح الجنين يأتي في التركيز، نقل غيض من micropipette نحو حافة مجال الرؤية، في اتجاه مياداة مجهرية. التركيز على الخلية ليتم حقنه وتأكد من انها تقع في مركز مجال الرؤية. تركيز على الطرف micropipette وتحريكه في المحور Y حتى انها تقع في نفس المستوى في المحور Y والخلية. نقل غيض من micropipette نحو الخلية في المحور X وأنتم خفضه في Z-المحور. إذا باستخدام مياداة مجهرية لايكا، وسوف تجد على الأرجح أن المرحلة المجهر تسيطر تعطيك أدق السيطرة على الحركة في محور-X من الضوابط مياداة مجهرية، بدل ذلك إلى مرحلة السيطرة كتلميح يقترب من الخلية.
8. جعل تلميح micropipette في اتصال مع الخلية وإجراء الاكتئاب على سطحه. تمر العديد من nanoamps depolariziنانوغرام الحالي لبضع ثوان. يجب أن نرى بلورة صغيرة من مبادرة ديزرتك الصناعية على تشكيل الخلية. للتأكد من أن تم وضع الخلية، لفترة وجيزة فتح مصراع لإلقاء الضوء على الجنين مع ضوء الفلورسنت، ثم التبديل مرة أخرى إلى مدينة دبي للإنترنت. إذا كان الجسم للخلية ذات الاهتمام يظهر علامات الوسم، وتطبيق الحالي لعدة ثواني. إيقاف وسحب الحالي الجنين بسرعة بعيدا عن micropipette في المحور X باستخدام عنصر التحكم مرحلة المجهر. ثم سحب micropipette من الحل. إذا لم الوسم مبادرة ديزرتك الصناعية هو واضح، قد يتم حظر micropipette وسيتطلب استبدال مع micropipette الطازجة. قد تجد أن غيض من micropipette ومتمزق الأنسجة الأخرى في طريقها إلى الخلية من الاهتمام واتسخت هذه الأنسجة بدلا من الخلية. في هذه الحالة، حاول سحب micropipette قليلا، وإعادة الاقتراب من الخلية. قد يكون من الضروري لتحل محل micropipette وحاول مرة أخرى.

9. إذا رغبت، يمكن أن تكون خلايا متعددة األفرادالتحالف المسمى في الجنين نفسه.
10. إزالة معظم من الحل في غرفة الحقن، ثم إصلاح الأجنة عن طريق إضافة 7.4٪ الفورمالديهايد / PBS لمدة 10 دقيقة ثم يغسل بنسبة 4 مع PBS. ويترك الجنين في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 4 ساعة (أو بين عشية وضحاها في C ° 4) في غرفة مظلمة ورطبة (لتجنب الوقوع أو تبيض الجاف) للسماح للمبادرة ديزرتك الصناعية في جميع أنحاء لنشر العمليات العصبية. في هذه المرحلة، قد تكون الخلايا التي تحمل علامات photoconverted مبادرة ديزرتك الصناعية أو ينظر مباشرة في المجهر متحد البؤر.

5. Photoconversion لفحص باستخدام نظارات DIC

مبدأ photoconversion هو الأكسدة (الصورة) من DAB من ضوء الفلورسنت المنبعثة من الخلية خلال الإضاءة الملون مع الطول الموجي المناسب. ويعني photoconverted الخلايا مشرق في أقصر وقت مقارنة مع الخلايا ملطخة ضعيفة. إذا وصفت عدة خلايا في واحدة العينة تختلف كثيرا فيما يتعلق معانها وهذا يمكن أن يؤدي إلى difficulties في photoconverting كل منهم في نفس النوعية (انظر الشكل 4C): في هذه الحالة يجوز لأحد أن يكون لاتخاذ قرار بشأن حل وسط بين إهمال الأضعف الخلايا (باستخدام الإضاءة قصيرة) أو قبول أن أكثر إشراقا تبدأ الخلايا في تضخم (باستخدام الإضاءة أطول) . إذا ضعيفة جدا صفت جميع الخلايا (التي تحتاج إلى إضاءة بالتالي طويلة جدا)، يمكن أن الخلفية التي تسببها الإنزيمية الذاتية تصبح مشكلة. ينبغي منذ DAB سامة يمكن التعامل معها بعناية. يمكن النفايات "إلغاء تنشيط" مع الكلور تبيض 7٪.

1. يجب أن يتم Photoconversion لكل من الجنين بشكل فردي. في الحالات التي يتم حقن الجنين واحد فقط لكل شريحة، يتم استبدال الحل PBS تغطي الجنين مع حل DAB (3 ملغ DAB / مل العازلة تريس)، وتوضع على شريحة المجهر مضان والخلية مليئة عرضها مع هدف 100X. (باستخدام المجهر تستقيم الانخفاضات موضوعي في حل DAB ويجب تنظيف عدة مرات بالماء بعد photoconversion عانتهاء rocedure، ويمكن تجنب ذلك إذا تم استخدام المجهر المقلوب). وتستخدم مجموعة Cy3 تصفية ومصباح الزئبق و100W الخلية عرضة لموجات الإثارة الأحمر حتى منتج بني رد الفعل DAB يصبح واضحا في الخلايا العصبية المسماة (فحص دوري عن طريق التحول إلى الإضاءة الساطعة مجال). الوقت الذي يستغرقه لتلطيخ DAB الأمثل هو متغير، ولكنها تتطلب التعرض للضوء الإثارة إلى ما بعد مرحلة حيث مضان قد تلاشى تماما. بعد اكتمال photoconversion، وغسل إعداد عدة مرات مع برنامج تلفزيوني. استبدال PBS مع قطرة من الجلسرين 70٪، كشط بعيدا سيليكون بشفرة المشرط، استبدال مع عصابة من الفازلين وإضافة ساترة.
2. عندما يتم شغل أجنة متعددة على شريحة واحدة، ونقل كل جنين إلى انخفاض صغير من PBS منفصلة على ساترة × 24 مم 60 مع الجانب البطني للجنين التي تواجه الزجاج. وضع إطار حول كل شريط لاصق الأجنة لإنشاء جيدا وتغطية إعداد مع PBS. الحفاظ على الشرائح في غرفة رطبة قبل photoconversion لمنعهم من الجفاف. صرف PBS تغطي الجنين مع حل DAB. ضع الشريحة على الفور مجهر مقلوب مجهزة مصباح الزئبق 100W واستخدام عامل تصفية Cy3 تعيين لإثارة مبادرة ديزرتك الصناعية، وذلك باستخدام الفأس 50 هدف. بعد photoconversion، ونقل الجنين إلى شريحة جديدة في قطرة من الجلسرين 70٪، إضافة ساترة وختم بطلاء الأظافر.

6. الفحص بواسطة متحد البؤر المجهري

1. بعد الخطوة 4،10 الأجنة نقل، إلى انخفاض صغير من PBS جديدة على ساترة × 24 مم 60. نحقق البصريات الأمثل من تصاعد الأجنة بالارض مع الجانب الظهري نحو ساترة (ولم يتبق سوى كمية صغيرة من PBS بين ساترة والجنين).
2. وضع إطار من شريط لاصق حول الجنين وتوسيع انخفاض PBS لملء هذا الإطار عند تغطيتها مع شريحة. وضع شريحة على ذلك بعناية واصلاحها مع طلاء الأظافر. يجب أن تكون الخلايا العصبية ملء الامتحانINED على المجهر (أو مضان) مبائر في أقرب وقت ممكن.

النتائج

الشكل 4 يوضح نتائج نموذجية للتقنية، ونحن هنا تصف الشكل 4A يبين مثالا لعصبون واحد مبادرة ديزرتك الصناعية التي تم شغلها photoconverted نظيفة. فإنه يوضح لطيف كمية من التفاصيل هذه الاستعدادات العرض. عندما ينظر تحت البصريات DIC السياق المكاني للخلية وصفت داخل ال?...

Discussion

واحد الميزة الرئيسية لذبابة الفاكهة كنظام نموذج هو أنه يتيح تحليل التنمية وظيفة على مستوى الخلايا واحدة. هذا مفيد خصوصا فيما يتعلق الجهاز العصبي، حيث تنوع أنواع الخلايا عالية بشكل استثنائي وظيفة ومورفولوجيا الخلايا المجاورة يمكن أن تكون مختلفة تماما.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف / المواد	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
			الكواشف
DAB	سيغما الدريخ	D-5905	2-3 مجم / مل في 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4
مبادرة ديزرتك الصناعية	مجسات إينفيتروجن / الجزيئي	D-282	1 ملغ / مل في الإيثانول
الفورمالديهايد	ميرك ميليبور		7،4٪ في برنامج تلفزيوني
الغليسيرول	روث	3783	70٪ في برنامج تلفزيوني
هيبتان الغراء	بيرسدورف AG	التشيلو 31-39-30 *	تمييع كاليفورنيا. 1-1 مع N-الهيبتان
PBS			1X
TRIS	روث	4855
Vectashield	ناقلات المختبرات	H1000
			EQUIPMENT
مبائر المجهر	لايكا	TCS SP2	لعرض وتوثيق labelings في مضان
DC - أmplifier	دراغان شركة	حجر الزاوية ION-100	لأداء labelings
Coverslips	منزل	BB018018A1	18 × 18 مم
Coverslips	منزل	BB024060A1	24 × 60 مم
تشريح مجهر	لايكا	MZ8	لإعداد وdisect الأجنة
شقة الشعيرات	Hilgenberg		القطر الخارجي 1 مم؛ غلاس سماكة 0.1 ملم
حقن الأوعية الشعرية	العلوم المنتجات	100 جيجا TF 8P
مياداة مجهرية R	لايكا		لأداء labelings
نموذج P-97	سوتر الآلات		لسحب الشعيرات الدموية
كائن الشرائح	مارينفيلد فخمة	1000000
مجهر العلمية	زايس	Axioskop 2 يذكره	لعرض labelings بعد photoconversion
مجهر العلمية	OLYMPUS	BX50	لأداء labelings
سوني كاميرا فيديو MC3255	سوني / AVT القرن	سوني MC3255	لتسجيل labelings بعد photoconversion