RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية

Summary

من خلال الجمع بين أساليب جبل RNA كله في الموقع التهجين وعلم الأنسجة، يمكن ربط التعبير الجيني لقرارات مصير الخلية في الجنين النامية. وقد تم تكييف هذه الأساليب لelasmobranchs البحرية وتسهيل استخدام هذه الحيوانات والكائنات الحية نموذجا للدراسات الطبية الحيوية، وعلم السموم والمقارنة.

Abstract

وتقدر قيمة elasmobranchs النماذج الحيوانية البحرية للدراسات الطب الحيوي والجينومية لأنها هي الفقاريات الأكثر بدائية لديهم مناعة التكيفية ولها آليات فريدة من نوعها لتنظيم التناضح ^1-3. كما الفقاريات الفكية-المعيشة الأكثر بدائية مع الزوائد مقترن، elasmobranchs هي نموذجا هاما تطويريا، وخاصة بالنسبة للدراسات في التطور والتنمية. كما تم elasmobranchs البحرية تستخدم لدراسة علم السموم المائية وعلم وظائف الأعضاء التوتر في العلاقة إلى ⁴ تغير المناخ. وبالتالي، هناك حاجة إلى تطوير وتكييف المنهجيات لتسهيل وتوسيع نطاق استخدام هذه الفقاريات البدائية إلى التخصصات البيولوجية متعددة. هنا أقدم على التكيف الناجح لجبل RNA كله في الموقع التهجين والتقنيات النسيجية لدراسة التعبير الجيني وعلم الأنسجة الخلية في elasmobranchs.

رصد التعبير الجيني هو أداة مميزة لبيول التنمويةogists، ويستخدم على نطاق واسع للتحقيق في العمليات التنموية ^5. RNA جبل بأكمله في الموقع التهجين يسمح التصور وتوطين النصوص جين معين في أنسجة الجنين النامية. يمكن للنمط التعبير الجيني في الرسالة توفير نظرة ثاقبة ما هي العمليات التنموية والقرارات مصير الخلية الجين قد السيطرة عليها. من خلال مقارنة نمط التعبير عن الجينات في مراحل نمو مختلفة، يمكن اكتسبت نظرة ثاقبة دور كيف لتغييرات الجين خلال التنمية.

بينما جبل كامل في ليالي 'الموقع يوفر وسيلة لتوطين التعبير الجيني للأنسجة، وتقنيات النسيجية تسمح لتحديد أنواع الخلايا والأنسجة المتمايزة. البقع النسيجية لها وظائف متنوعة. وتستخدم لتسليط الضوء على بقع العام شكل الخلية، على سبيل المثال hematoxylin و eosin لتلطيخ العام للنوى والسيتوبلازم، على التوالي. يمكن تسليط الضوء على بقع معينة من الخلايا الأخرىأنواع. على سبيل المثال، وصمة عار ذكرت والأزرق alcian في هذه الورقة هو وصمة عار على نطاق واسع لتحديد mucosaccharides الموجبة. يمكن تلطيخ من الجهاز الهضمي مع الأزرق alcian تحديد توزيع الخلايا الكأسية التي تنتج mucosaccharides. الاختلافات في مكونات mucosaccharide على الببتيدات قصيرة تمييز الخلايا الكأسية حسب الوظيفة في الجهاز الهضمي ^6. باستخدام RNA جبل كامل في أساليب الموقع لوالنسيجية بشكل متزامن، يمكن ربط مصير قرارات الخلية إلى الجينات المحددة التعبير.

على الرغم من أن RNA في ليالي الموقع 'والكيمياء النسيجية وتستخدم على نطاق واسع من قبل الباحثين، والتقى تكييفها واستخدامها في elasmobranchs البحرية نجاحا محدودا ومتنوعة. هنا أقدم البروتوكولات التي وضعت لelasmobranchs واستخدامها على أساس منتظم في مختبري. على الرغم من أن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التعديل من الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين طريقة لللتكيف مع أنواع مختلفة، وصفت البروتوكولات هنا عrovide نقطة قوية للباحثين الراغبين بدءا من التكيف على استخدام elasmobranchs البحرية على استفساراتهم العلمية.

Protocol

I. RNA جبل الجامع في الموقع التهجين في Elasmobranchs البحرية

1. التثبيت والإعداد الجنين

1. يمكن الأجنة تزلج نظمت وفقا لبالارد ^7. مراحل الأمثل للكشف عن التعبير الجيني يعتمد على الأنسجة من الاهتمام. لتتبع التعبير الجيني في الجهاز الهضمي تزلج، مراحل هي 27-30 الأمثل ^7.
2. تشريح الأجنة في برنامج تلفزيوني، فصل الأجنة من الكيس المحي.
3. إصلاح في 30 مل من الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في أنبوب مخروطي 50 مل في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف. إصلاح لمدة 24 ساعة.
4. غسل الأجنة في PBT، لمدة 15 دقيقة مرتين، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة. يتم تضمين كافة الوصفات حل لجبل RNA كله في ليالي 'الموقع (الجدول 1).
5. يذوى الأجنة عن طريق الغسيل في سلسلة الميثانول بنسبة 25٪، 50٪ و 75٪ الميثانول: PBT هزاز في درجة حرارة الغرفة. مدة يغسل يعتمد على مرحلة من الأجنة. لمرحلة ما قبل نeurulation نظم الأجنة، 5 دقائق من كل غسل في سلسلة الميثانول كافية. لأجنة أقدم من المرحلة 30، يمكن أن تستغرق ما يصل الى يغسل 30 دقيقة. لتحديد إذا ما اخترقت بما فيه الكفاية الأجنة وتأقلم كل ليغسل، عقد أنبوب تستقيم في يدك. إذا كانت الأجنة تنزل الى قاع الأنبوب، ثم كنت على استعداد لغسل المقبل. إذا كانت الأجنة تطفو الى الاعلى من الحل، حل تغيير وتكرار هذه الخطوة خاصة الجفاف.
6. يغسل مرتين في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقيقة هزاز بلطف.
7. المجففة مرة واحدة لالميثانول بنسبة 100٪، يجب تخزين الأجنة في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل الشروع في البروتوكول. وقد تم تخزين الأجنة بنجاح في -20 ° C، وتستخدم ليتصاعد RNA كله لمدة تصل إلى 1 سنة.

2. توليف دقق RNA

1. توليد جزء خطية من الجين الذي التعبير الذي ترغب في الكشف عنها. ويمكن أن يتم هذا إما عن طريق التضخيم PCR أو linearizing البلازميد مع الجين الخاصمن الفائدة. لتضخيم PCR بواسطة، اختر الاشعال الذي ملزمة المواقع الجناح الجين إدراج المواقع والاحتفاظ بوليميراز RNA ملزم في المنطقة تضخيم. ليشيع استخدام البلازميدات مثل برنامج تلفزيوني أو pGEM، M15 إلى الأمام وعكس الاشعال مثالية. بدلا من ذلك، خطي البلازميد من هضم 15 ميكرولتر من الحمض النووي miniprep QIAGEN مع الانزيم الذي يشق في نهاية 5 'من الجين. استخراج وتنقية جل استخدام عدة QIAquick المناسبة.
2. عكس تدوين التحقيق RNA باستخدام 8 ميكرولتر من خطي البلازميد أو 100 نانوغرام من الناتج PCR كقالب باستخدام البلمرة RNA المناسب (انظر الجدول رقم 2 للتفاعل النسخ).
3. احتضان رد فعل عكسي لمدة 2 ساعة النسخ في 37 ° C.
4. لتأكيد رد فعل، تشغيل 1 ميكرولتر من رد فعل النسخ على هلام الاغاروز / TAE 1٪. تشغيل هلام في 100 mVolts حتى الصبغة وتشغيل فقط في هلام. وينبغي أن يكون واحد الفرقة البارزين تكون مرئية. قد القالب الحمض النووي الخطية تكون مرئية بصوت ضعيف جزء في أعلى الجزيئيلار الوزن.
5. إضافة 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية الدناز الأول للتفاعل واحتضان النسخ في C ° 37 لمدة 15 دقيقة.
6. ليعجل، إضافة 100 ميكرولتر TE الرقم الهيدروجيني 8 و 10 ميكرولتر 4 LiCl M، 300 ميكرولتر 100٪ EtOH واحتضان في -20 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
7. تدور لمدة 10 دقيقة في 4 C ° microfuge في 14،000 دورة في الدقيقة.
8. غسل بيليه مع EtOH 70٪ والهواء الجاف.
9. إعادة تعليق RNA التحقيق في 20 ميكرولتر من DH ₂ O. إضافة 80 ميكرولتر من العازلة التهجين (ينبغي العازلة التهجين قبل تحسنت إلى C ° 70). ويمكن تخزين في المخزن المؤقت التحقيق التهجين 80٪ لعدة أشهر في -20 ° C أو أكثر في -80 ° C.

3. الجنين ما قبل المعالجة والتهجين

1. إزالة الأجنة المخزنة في الميثانول بنسبة 100٪ من -20 ° C. لصغار الأجنة المضي قدما في الخطوة (3.2). لاحقا قام الأجنة (المرحلة 29/30 <) قد ترى طبقة البشرة التي 'رفع' قبالة جسد الجنين. تحت المجهر، مجرد الإساءة بعنايةالعلاج بالصدمات الكهربائية من طبقة البشرة لزيادة تغلغل التحقيق.
2. الأجنة في مكان نظيف قارورة التلألؤ الزجاج. ترطيب الأجنة في سلسلة الميثانول عكس وصف أعلاه: هزاز بلطف بواسطة كل حل ل5-30 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة: (PBT 75٪ و 50٪ و 25٪ الميثانول). الإماهة كاملة مع اثنين من يغسل PBT لمدة 10 دقيقة لكل منهما، هزاز بلطف.
3. لإزالة أي صبغة والأجنة التبييض مع بيروكسيد الهيدروجين 6٪ في PBT لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز.
4. إزالة بيروكسيد الهيدروجين عن طريق الغسيل ثلاث مرات في PBT، (هزاز في درجة حرارة الغرفة، 10 دقيقة لكل منهما).
5. علاج الأجنة مع K بروتين للسماح لاختراق من خلال التهجين التحقيق. كمية بروتين K ومدة العلاج يعتمد على النسيج ترغب في فحص وعمر الجنين. الأنسجة أكثر سطحية وأقل الأجنة تتطلب K أقصر وأقل بروتين، بينما الأنسجة العميقة والقديمة الأجنة تحتاج إلى تركيز أعلى وأطول تيم العلاجه لpermeabilize بالكامل الجنين لتهجين التحقيق. على سبيل المثال، للكشف عن SHH في الأديم الباطن أمعاء أجنة المرحلة تزلج 29، وحضنت 30 ميكروغرام / مل من K بروتين / PBT لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. شطف بسرعة الأجنة في PBT ليغسل بروتين K.
7. لإلغاء تنشيط بروتين K، POSTFIX الأجنة مع PFA 4٪، 0.2٪ في غلوتارالدهيد PBT لمدة 20 دقيقة، هزاز بلطف.
8. يغسل مرتين لمدة 10 دقيقة مع PBT.
9. 1. لالتهجين المسبق، إضافة 2-3 مل من محلول التهجين ما قبل ساخنة لأجنة، فقط ما يكفي لتغطيتها. صخرة بلطف في حمام مائي ساخن في C ° 70 ل1 ساعة.
   2. لإعداد حل التهجين، سخن RNA التحقيق إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وباردة على الجليد. تمييع التحقيق ميكرولتر 15-20 من RNA إلى 2 مل من محلول التهجين محمى جديدة، للحصول على تركيز النهائي من 0،5-1،0 ميكروغرام / مل. إزالة ما قبل hybe وإضافة إلى التحقيق المخفف RNA الأجنة. وينبغي أن تغطي الأجنة فقط عن طريق حل، وهوي ي حل أكثر التهجين إذا لزم الأمر. آمنة بإحكام غطاء قارورة التلألؤ. هجن بواسطة هزاز بلطف في حمام مائي ساخن 70 درجة مئوية في الليل.

4. أضف الغسلات التهجين والتهجين جسم

1. إزالة الحل التهجين مع التحقيق من أجنة ومكان في قارورة التلألؤ جديدة أو أنبوب إيبندورف. ويمكن تخزين التحقيق في -20 ° C وإعادة استخدامها في المستقبل. لمرحلة ما بعد التهجين يغسل والأجنة في مكان Netwell يجلس في لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا.
2. يغسل 3 مرات لمدة 30 دقيقة في كل من قبل تحسنت الحل رقم 1، هزاز في 70 ° C.
3. يغسل 3 مرات لمدة 30 دقيقة في كل من قبل تحسنت الحل رقم 2، هزاز في 70 ° C.
4. يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل من TBST، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
5. قبل كتلة مع 10٪ مصل الأغنام للحرارة المعطل في TBST ل1 ساعة، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
6. نقل الأجنة من Netwell إلى قارورة التلألؤ الزجاج النقي. إضافة لمكافحة DIGشظايا القوات المسلحة البوروندية (1:5،000) في مصل الأغنام 1٪ للحرارة المعطل / TBST إلى الأجنة. بين عشية وضحاها في صخرة C. ° 4

5. آخر التهجين جسم يغسل

1. إزالة الأجسام المضادة والتخلص منها. الأجنة مرة أخرى إلى مكان لغسيل Netwell.
2. يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل من TBST، هزاز في درجة حرارة الغرفة
3. غسل ما لا يقل عن 6 مرات عن 1 ساعة لكل منهما، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
4. بين عشية وضحاها في غسل TBST، هزاز في C. ° 4 كما تساعد خفض يغسل الجسم المضاد آخر لأسفل على تلطيخ الخلفية، وتعظيم عدد ومدة يغسل هو الأفضل. تغسل بشكل روتيني الأجنة في TBST في C ° 4، خلال عطلة نهاية الأسبوع.

6. كشف التحقيق

1. تشكل الحل الطازجة وNTMT تصفية تعقيم.
2. تجاهل حل TBST غسل الأجنة والمكان في قارورة زجاجية نظيفة التلألؤ. غسل الأجنة 3 مرات في NTMT الطازجة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة كل، هزاز.
3. إزالة NTMT غسل وإضافة مزيج التفاعلمن NBT س 1/1 × BCIP في NTMT. حيث أن هذه المواد المتفاعلة هي الحساسة للضوء، تغطية قارورة التلألؤ في احباط والصخور في درجة حرارة الغرفة.
4. رصد رد فعل كل لون 15 دقيقة حتى المطلوب هو التعبير الجيني واضحة للعيان. قد تحقيقات قوية يستغرق اقل من 10 دقيقة لتطوير. قد تحقيقات ضعيفة تأخذ 1-2 ساعة. لا تدع رد فعل تذهب لفترة طويلة جدا أو تلطيخ الخلفية سوف تبدأ في الظهور (الجنين كله يبدأ لتحويل اللون الأرجواني أو البني مملة).
5. غسل 2 مرات لمدة 10 دقيقة في كل من PBT في درجة حرارة الغرفة، هزاز.
6. POSTFIX الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪، 0.1٪ لغلوتارالدهيد 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن يكون مخزن الأجنة إلى أجل غير مسمى في تثبيتي في C. ° 4
7. تصور الأجنة مع stereomicroscope تشريح. لإنتاج الضوء الأزرق خلفية للصور والأجنة مكان في صحن مع الاغاروز 1٪ قبل تصلب / PBS.

7. ممثل عن نتائج جبل RNA I. الجامع في الموقع التهجين في elasmobranchs البحرية

وتظهر RNA جبل بأكمله في التعبير الموقع لتصور من القنفذ الصوتي (SHH) وHoxa13 في الأجنة تزلج في الشكل 1. تم العثور على التعبير عن SHH في الفقاريات العليا في الأديم الباطن القردود والأمعاء ويتم حفظها هذا النمط في التعبير تزلج (الشكل 1A) ^8،9. elasmobranchs البحرية لديها طريقة فريدة من تنظيم التناضح يستخدم الغدة تفرز الأملاح إلى المستقيم. Hoxa13 التعبير عالية في الغدة المستقيم النامية (1B الشكل) ^10. Hoxa13 دور الجين المنتج في الزخرفة الغدة المستقيم لا تزال غير معروفة.

II. البارافين التضمين وباجتزاء الأنسجة صفيحية الخياشيم

1. الحصاد وإعداد الأنسجة

1. تشريح الأنسجة المطلوب وإصلاح في 10٪ فورمالين لمدة 24-48 ساعة، هزاز في درجة حرارة الغرفة. ويمكن أيضا بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) أن تستخدم مثبت(انظر المناقشة).
2. تغسل مثبت عن طريق الغسيل في برنامج تلفزيوني، و 3 مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما. اعتمادا على حجم الأنسجة، يمكن انخفض مرات الغسيل لمدة 10 دقيقة أو إلى زيادة 1 ساعة.
3. يذوى الأجنة عن طريق الغسيل في سلسلة من الايثانول 25٪، 50٪ و 75٪ من الإيثانول: PBS هزاز في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى، فإن الوقت لكل غسل تعتمد على حجم الأنسجة. ل 0.5 الأنسجة ³ سم، احتضان كل غسيل لمدة 15 دقيقة. زيادة الوقت للحصول على أكبر قطعة. إذا هو المطلوب التخزين على المدى الطويل من الأنسجة، وغسل إضافية مرتين في الإيثانول 75٪ وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. إلا المضي قدما إلى الخطوة التالية.
4. يذوى المزيد من الغسيل 3 مرات في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما، هزاز.

2. التضمين وباجتزاء البارافين

1. توضيح الأنسجة عن طريق الغسيل 2 مرات في الزيلين لمدة 5 دقائق كل قارورة التلألؤ في الزجاج مع الأغطية غطاء المسمار. الزيلين سوف تجعل الأنسجة هشة، لذلك لا يتجاوز ما مجموعه 10 دقيقة لكان[هس]. يجب أن ننظر الأنسجة شفافة عند عقد ليصل إلى ضوء. إذا كان النسيج لا يزال مبهمة للغاية بعد يغسل اثنين، قيام غسيل إضافية في الزيلين لمدة 5 دقائق ثم المضي قدما في البروتوكول. فقط التعامل مع الزيلين داخل غطاء الدخان مع القفازات.
2. إزالة الزيلين وملء قارورة التلألؤ 2/3 كامل مع البارافين ذاب. احتضان في فرن 60 C ° لمدة 30 دقيقة. عندما وضع في القارورة البارافين، ستلاحظ البارافين يصلب على طول جانبي القارورة. ضع قارورة في الفرن والسماح للالبارافين للبضع دقائق إعادة حل. اتخاذ القارورة من الفرن ويقدم الحل السريع دوامة لخلط واستبدال في الفرن لمدة المتبقية من الحضانة.
3. البارافين تكرار حضانات مرتين أخريين لمدة 30 دقيقة.
4. احتضان في البارافين لمدة ساعة مرتين لكل منهما. تغيير وقت البارافين واحتضان بين عشية وضحاها النهائي في الفرن 60 C °.
5. في اليوم التالي، ضع الأنسجة في غرفة حمام البارافين الساخن ومكان تحت التفريغ لمدة 2-3 ساعة. وسوف يسهل هذا تسلل البارافين في الأنسجة وإزالة أي فقاعات الهواء. لبعض أنواع الأنسجة رقيقة، قد لا تكون خطوة الفراغ المطلوب، ولكن من الضروري للأجنة كاملة أو الجهاز الهضمي وغيرها من الأجهزة مع مقصورات لمعي.
6. بعد الفراغ سهلت تسلل الأنسجة الأنسجة مكان، في قالب معدني مع البارافين ذاب، وبارد على صفيحة الجليد. ترك على الجليد أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية قبل محاولة إزالة الأنسجة من العفن. ويمكن تخزين كتل من الأنسجة البارافين إلى أجل غير مسمى في C. ° 4
7. مكان كتلة البارافين في الصعود إلى مشراح وقطع 8 أقسام ميكرومتر. ينبغي طرح المقاطع على حمام الماء الساخن إلى 48 ° C والتي شنت على الشرائح الزجاجية Superfrost زائد *.
8. الشرائح الجافة بين عشية وضحاها في فرن درجة 37 درجة.
9. أقسام المحل في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.

III. زرقة الألسيان / الأحمر سريعة النووية صمة صفيحية الخياشيم الأنسجة

1. زرقة الألسيان وصمة عار لMucins

1. المكان الشرائح مع أقسام تواجه تصاعدية على أكثر دفئا الشريحة. تذوب لمدة 45 دقيقة.
2. المكان الشرائح في حامل الشرائح. وترد جميع الحلول يترتب على ذلك في أحواض داخل غطاء الدخان. تغسل الشرائح عن طريق نقل ملكيتها من الحوض مع حل لآخر. تأكد من أن مستويات حل في أحواض تغطي الشرائح، ويتم مغمورة تماما الأنسجة على الشرائح. حل البارافين عن طريق الغسيل الشرائح 2 مرات في الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
3. غسل الشرائح مرتين مع الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
4. ترطيب الشرائح في سلسلة الايثانول (75٪، 50٪، 25٪ إيثانول) الغسيل في كل حل ل1 دقيقة. يغسل في DH ₂ O لمدة 1 دقيقة.
5. وصمة عار في الحل الأزرق Alcian، ودرجة الحموضة 2.5 ل 15 دقيقة.
6. تطوير وصمة عار عن طريق الغسيل في ماء الصنبور تشغيل لمدة 3 دقائق. تراجع مرة واحدة في DH ₂ O.
7. ملون مباين النووية في حل سريع ملون مباين الأحمر لمدة 10 دقيقة.
8. يغسل في إدارة مياه الصنبور لمدة 3 دقائق وتراجع في ₂ درهم مرة واحدة O.
9. Dehydrate في سلسلة الايثانول (25٪، 50٪، 75٪، 100٪، 100٪) لمدة 20 الانخفاضات لكل منهما، أو 1 دقيقة لكل منهما. غسل 2 مرات في الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما. جبل مع تصاعد والمتوسطة DPX coverslips. السماح لتصاعد المتوسطة الجافة وتتصلب لمدة 48 ساعة في غطاء الدخان قبل التلاعب الشرائح.

النتائج

أمثلة على تلطيخ الأزرق alcian في مناطق مختلفة من L. وتظهر erinacea الجهاز الهضمي في الشكل 2. الميوسين حمض تحتوي على خلايا globlet مرئية بوضوح من خلال وصمة عار الأزرق alcian في جميع أنحاء الجهاز الهضمي. توزيع mucins حمض يختلف في مناطق مختلفة من الجهاز الهضمي، مما يعكس ...

Discussion

البروتوكولات المقدمة من الطرق الكلاسيكية لرصد وتحديد التعبير الجيني أنواع الخلايا المتمايزة، والتي تم تكييفها للاستخدام في elasmobranchs البحرية. قد تكون هناك حاجة لإجراء المزيد من التعديلات هذه البروتوكولات على التكيف مع أنواع مختلفة صفيحية الخياشيم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.