استخدام البروتين عكس صالحة المرحلة (RPPA) لاستكشاف البروتين في التعبير التغير فردية سرطان الخلايا الكلوية

Summary

RPPA تمكن من التعبير البروتين مئات العينات، وطبع على الشرائح النيتروسليلوز لاستجوابه في وقت واحد، وذلك باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى. وقد تم تطبيق هذه التقنية لدراسة تأثير عدم التجانس العلاج من تعاطي المخدرات داخل الخلايا الكلوية سرطان واضحة.

Abstract

حاليا لا يوجد علاج العلاجية لسرطان الخلايا المتنقل الخلايا الكلوية واضحة، أشيع البديل من هذا المرض. ويعتقد أن العامل الرئيسي في هذه المقاومة العلاج ليكون التعقيد الجزيئي للمرض ^1. وقد تم استخدام العلاج الموجه مثل مثبط التيروزين كيناز (TKI)-sunitinib، ولكن فقط 40٪ من المرضى سوف تستجيب، والغالبية العظمى من هؤلاء المرضى الانتكاس بعد 1 ² سنة. على هذا النحو مسألة المقاومة الذاتية والمكتسبة في مرضى السرطان الكلوي الخليوي هي وثيقة الصلة ^3.

من أجل دراسة مقاومة TKIs، مع الهدف النهائي المتمثل في تطوير فعالية وعلاجات شخصية، مطلوب الأنسجة متتابعة بعد فترة محددة من العلاج المستهدف، وهو نهج قد أثبتت نجاحها في ⁴ سرطان الدم النخاعي المزمن. لكن معقد تطبيق مثل هذه الاستراتيجية في سرطان الخلايا الكلوية من مستوى عال من بعدم التجانس بين أوراسكوم تليكوم القابضة وintratumoral، الذي هو سمة من سمات سرطان الخلايا الكلوية ^5،6 وكذلك الأورام الصلبة الأخرى ^7. راسخة عدم التجانس Intertumoral بسبب الخلافات transcriptomic والجينية حتى في المرضى الذين يعانون من عرض مماثل، ومرحلة الصف من الورم. وبالإضافة إلى ذلك فإنه من الواضح أن هناك شيء عظيم المورفولوجية (intratumoral) عدم التجانس في RCC، التي من المرجح أن تمثل عدم التجانس الجزيئية أكبر. رسم خرائط تفصيلية وتصنيف الأورام من قبل مجلس قيادة الثورة التحليل الصرفي والدرجات المجمعة فورمان يسمح للاختيار المناطق ممثل للتحليل البروتين.

تحليل البروتين على أساس من RCC ⁸ هو جذابة نظرا لتوفر على نطاق واسع في مختبرات علم الأمراض، إلا أن تطبيقها يمكن أن يكون مشكلة بسبب محدودية توافر الأجسام المضادة المحددة ^9. ونظرا لطبيعة طخة نقطة صالحة للبروتين عكس المرحلة (RPPA)، والنوعية الأجسام المضادة يجب أن به قبل التحقق من صحة، على هذا النحو رقابة صارمة على الجودة من الأجسام المضادة المستخدمة هي ذات أهمية قصوى. على الرغم من هذا القيد الشكل طخة نقطة لا تسمح التصغير الفحص، مما يسمح لطباعة مئات العينات على شريحة واحدة النيتروسليلوز. ويمكن بعد ذلك يتم تحليل الشرائح المطبوعة بطريقة مماثلة لتحليل الغربية مع استخدام الأجسام المضادة المحددة الهدف الرئيسي والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى، والسماح لمضاعفة. ويمكن بعد ذلك الفرق التعبير البروتين في عينات جميع على شريحة يتم تحليلها في وقت واحد من خلال مقارنة المستوى النسبي للمضان بطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية.

Protocol

1. تحديد عدم التجانس ورم المورفولوجية والجزيئية

1. الأورام إزالتها من الفريزر -80 درجة مئوية ويحرص على الثلج الجاف.
2. تقسيم أورام في أجزاء من حوالي 1 سم ^3. خريطة الموقع الأصلي للورم كل قسم بالنسبة لبعضها البعض والتسمية مع اسم فريد. عينات متجر في cryovials الفردية في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
3. معطف العينات في أكتوبر وقطع في ناظم البرد -22 ° C. في
4. ملطخة العينات باستخدام أسلوب hematoxylin و eosin counterstaining.
5. تحليل المجهري لمقاطع المجمدة للتأكد من أنها ذات طبيعة ccRCC، ورم قابلة للحياة والدرجات (الدرجة المنخفضة، وارتفاع درجة أو مختلطة منخفض / عالي الجودة، مما يشكل تحديا للتمييز الدرجات فورمان 1 إلى 4 على القسم المجمدة). الشكل 1 أ و ب (H & E تلطيخ عالية الدرجة المنخفضة والمختلط).
6. اختيار ما يصل إلى 4 عينات من كل منطقة مختلفة شكليا داخل كل ورم لاستخراج البروتين.

2. استخراج البروتين من عينات الأورام

1. قطع عينة الورم من أكتوبر
2. مكان 50-75 ملغ من الأنسجة إلى 2 مل أنابيب مع 990 ميكرولتر من العازلة تحلل [50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 5 ملي EGTA (الرقم الهيدروجيني 8.5)، 150 مم كلوريد الصوديوم] تستكمل مع أبروتينين (سيغما A6279) (10 ملغ / مل)، الفوسفاتيز كوكتيل المانع 2 (سيغما، P5716)، الفوسفاتيز كوكتيل المانع 3 (سيغما، P0044) وكوكتيل مثبط البروتياز (روش، 11836153001).
3. إضافة واحد الصلب الكرة مم 5 لكل أنبوب والتجانس في 50HZ لمدة 5 دقائق باستخدام مرتين في TissueLyser، والتحقق من مستوى التجانس بعد كل فترة 5 دقائق.
4. نقل إلى أنبوب عينة متجانسة جديدة مل 2 باستخدام ماصة ترك الكرة وراء الصلب.
5. إضافة 10 ميكرولتر من تريتون X-100 إلى كل عينة قبل الطرد المركزي في 13000 XG لمدة 30 دقيقة في C. ° 4
6. نقل supernatants لأنابيب microcentrifuge الطازجة.
7. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA (الشكل 2).
8. تركيزات البروتين في تطبيع 1 ملغ / مل.

3. التحقق من صحة الأجسام المضادة

1. إعداد عينات البروتين (المستخرج من خطوط الخلايا أو الأنسجة المناسبة) لطخة غربية وتعمل على هلام SDS-PAGE 10٪.
2. نقل العينات إلى غشاء النيتروسليلوز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
3. منع الغشاء في المخزن المؤقت أوديسي ليثيوم كو حظر (50:50 المخفف في PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت أوديسي ليثيوم كو حظر (50:50 المخفف في PBS) في مصنعين أوصت التخفيف عادة 1 في 1،000.
5. احتضان الغشاء في ليلة وضحاها في الأجسام المضادة الأولية C. ° 4
6. تشكل 0.1٪ PBS-Tween20 (PBS-T؛ 1 مل Tween20 / 1L PBS).
7. يغسل الغشاء في PBS-T في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (X3).
8. تمييع fluorescently-صفت الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت أوديسي حظر (50:50 المخفف في PBS) 0.01٪ SDS 1:10،000 في تخفيف (1.5 μl/15 مل).
9. احتضان الغشاء في الثانويةالأجسام المضادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف - من المهم لحماية الغشاء من الضوء حتى يحين الوقت الذي فقد مسحها ضوئيا في نهاية المطاف.
10. يغسل الغشاء في PBS-T في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (X3)، والحفاظ على الأغشية في الظلام.
11. يغسل الغشاء في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (X3) لإزالة Tween20 المتبقية، وحفظ الغشاء مرة أخرى في الظلام.
12. تكمن غشاء مسطح على قطعة من ورق الترشيح في الظلام، والسماح للهواء الجاف - السماح ليجف الغشاء قد يعزز إشارة والحد من الخلفية ولكن جعله عديم الفائدة للتجريد وإعادة التحقيق.
13. مسح الغشاء على الماسح الضوئي أوديسي LiCor. الحفاظ على غشاء في الظلام حتى يحين الوقت الذي تم فحصه.
14. فقط تحديد الأجسام المضادة التي تولد فرقة واحدة في الغالب الوزن الجزيئي الصحيح. ويبين الشكل 3 أمثلة على الأجسام المضادة المقبول وغير المقبول للاستخدام مع RPPA.

4. RPPA الحزب الثوري المؤسسيnting

1. تم رصد لست] البروتين على الشرائح الزجاجية النيتروسليلوز المغلفة (Fastslides-WHATMAN) باستخدام II MicroGrid الروبوتية نصاب. الشرائح المستخدمة الواردة على 2 منصات التي رصدت العينات. شوهد كل لوحة مع عينات مماثلة، في هذه الحالة 100 عينة. الأشكال الأخرى المتاحة تشمل 1 و 8 و الشرائح لوحة 16. ارتفاع عدد منصات أصغر عدد العينات التي يمكن رصدها على كل.
2. وقدم سلسلة من التخفيفات 2-أضعاف خمسة من كل عينة وشوهد بعد ذلك في ثلاث نسخ كل (مما أدى إلى ما مجموعه 15 نقاط لكل عينة).

5. RPPA البروتين الكشف

1. الشرائح العازلة الرطب في LiCor الزائدة حظر (50:50 المخفف في PBS). احتضان RT في ل1 ساعة على منصة هزاز.
2. إعداد 800 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت LiCor حظر (50:50 المخفف في PBS) في تركيزات المطلوب والحفاظ على الجليد.
3. تحميل الشرائح في إما (ط) كليب إطار شريحة واحدةأو (ب) من 'FastFrame' الشريحة الخليج 4 حامل بحيث يتم تشكيل ختم ضيق بين الشريحة وغرفة الحضانة.
4. إزالة العازلة المتبقية من الآبار والأجسام المضادة الأولية اضافة 600 ميكرولتر من الآبار الخاصة.
5. ضع الشريحة في مربع وغرفة رطبة مختومة واحتضان بين عشية وضحاها على منصة هزاز عند 4 ° C.
6. تشكل 0.1٪ PBS-Tween20 (PBS-T و 100 ميكرولتر توين 20/100 مل PBS).
7. إزالة الشرائح من غرفة باردة وإزالة الأجسام المضادة الأولية بعناية من كل بئر.
8. اضافة 600 ميكرولتر من PBS-T وغسل الشرائح على منصة هزاز في RT لمدة 5 دقائق (X3).
9. إعداد fluorescently-صفت الأجسام المضادة الثانوية من تمييع في المخزن المؤقت أوديسي حظر (50:50 المخفف في PBS) 0.01٪ SDS في التخفيف 1:2،000 (1 ميكرولتر / 2 مل) في المقام الأول.
10. إزالة العازلة من الآبار واضافة 600 ميكرولتر الأجسام المضادة الثانوية fluorescently-المسمى إلى الآبار الخاصة. احتضان الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف - انهمن المهم لحماية الغشاء من الضوء حتى يحين الوقت الذي فقد مسحها ضوئيا في نهاية المطاف.
11. إزالة الأجسام المضادة الثانوية من يغسل جيدا لفترة وجيزة (X3) في 600 ميكرولتر PBS-T في درجة حرارة الغرفة. إزالة الشريحة من الناقل، ونقل إلى وعاء مناسب وغسل ما يزيد PBS-T لمدة 15 دقيقة، والحفاظ على الأغشية في الظلام.
12. إزالة PBS-T وكذلك الغشاء غسيل مع PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإزالة بقايا توين-20، مع الغشاء مرة أخرى في الظلام.
13. تجفيف Fastslide في 50 ° C الفرن لمدة 10 دقيقة ثم مسح على الماسح الضوئي أوديسي ليثيوم تبليغ الوثائق. إبقاء الشريحة في الظلام حتى يتم فحصه.
14. مسح الشريحة بحوالي 680 نانومتر نانومتر و/ أو 800 اعتمادا على الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة المستخدمة. لاللونين الكشف دائما استخدام للغاية عبر الأجسام المضادة الثانوية كثف لتقليل تفاعل الصليب. الاختيار الدقيق للأجسام مضادة الابتدائية والثانوية أمر ضروري لكشف اللونين. من الأهمية بمكان هو اختيارالأنواع المضيفة مختلفة (على سبيل المثال الأرانب والماوس) لأجسام مضادة الأساسيان. هذا التمييز من قبل الأجسام المضادة يسمح الثانوية المضادة للأرنب ومكافحة الفأر التي وصفت مع صبغ مع أطياف الانبعاثات تمييزها بسهولة.
15. يتم حفظ ملفات الصور وملفات TIFF. الشكل 4 (صورة من الملفات الممسوحة ضوئيا).

6. تحليل البيانات

1. إطلاق البرنامج MicroVigene (VigeneTech، كارلايل، MA، الولايات المتحدة الأمريكية).
2. فتح. TIFF ملف الصورة الذي يحتوي على فحص الشريحة RPPA.
3. حدد ملف قالب محدد مسبقا والتي سيكون لها الشبكة لتراكب على الصورة من الشريحة RPPA.
4. انقر فوق الزر تحديد مناطق (ROI) فوائد، لإظهار الشبكة.
5. وضع الشبكة على البقع RPPA. الشكل 6A (صورة الشبكة على الصورة).
6. انقر فوق الزر تحديد الكل لتسليط الضوء على كل ROI.
7. انقر فوق البحث عن جميع. سوف MicroVigene AUTOMالعثور على atically ROI، والعثور على بقع، طرح الخلفية، إزالة أي غبار وتحديد المواقع.
8. انقر فوق منحنى التخفيف الزر عرض لإظهار النتائج لجميع العينات على الشريحة RPPA.
9. انقر فوق حفظ البيانات التخفيف.
10. كما يتم طباعة كل عينة عبر نقاط 5 لكل والتخفيف من ثلاث نسخ هناك 15 نقطة لتحليل، مما يقلل من احتمال حدوث أخطاء وتحسين نوعية منحنى المناسب. MicroVigene تنتج 4-المعلمة اللوجستية، سجل طراز "Supercurve" خوارزمية (الشكل 6B)، الذي يشتمل على جميع المواقع لإنتاج منحنى السيني من مستضد الضد حركية ملزمة. الافتراض هو أن الأجسام المضادة نفس المستضد حركية ملزمة تجري في كل بقعة العينة، حتى في عينات مختلفة، وبالتالي من خلال اتخاذ جميع البقع على مجموعة لتناسب منحنى استجابة مشتركة يمكن أن تزيد من ثقة منحنى المناسب ^10،11
    Y = A + ((BA) / (1 + E (ج * د-LN (X)))
    حيث x هو dilutioن عامل وY هو كثافة الإشارة.
    يمكن العينات التي تم تحليلها نسبيا باستخدام قيمة Y0، والتي في تحليلنا مساويا لقيمة Y في منتصف قيم س رسم الخرائط بعد تلك على وsupercurve.
11. تصدير البيانات في Microsoft Excel ومؤامرة Y0 كما في الشكل 7.
12. تم حساب الفرق Intratumoral البروتين بشكل منفصل عن المعالجة غير المعالجة والمرضى الذين عولجوا في إطار ANOVA. وتمت مقارنة توزيع الفرق الجمع بين البيانات من جميع البروتينات من خلال اختبار تحليل مان ويتني (MWT). وتمت مقارنة الفروق الفردية Intratumoral لبروتينات من قبل تجارب F حيث الافتراضات الحياة الطبيعية ومتماثل التفاوت عقدت على التوالي تقييمهم باستخدام Lillefours والاختبارات Fligner؛ كاذبة معدل اكتشاف (FDR) تم تطبيق التصحيح ^12. تم اختبار الفرق بين البروتين التعبير عينات المرضى دون علاج والمعالجة لكل طالب باستخدام بروتين تي الاختبار حيث طبيعتها وافتراض متماثل التفاوتوالتقى ثانية، وإلا تم تنفيذ MWT؛ تم تطبيق FDR على القيم ر الاختبار وMWT مجتمعة ^12. وقدرت أهمية التعبير البروتين والفرق ارتباط بيرسون للبروتينات باستخدام نهج القياسية [R مرجع] وFDR تطبيق ^12.

النتائج

ويمكن رؤية مثال على شريحة RPPA الممسوحة ضوئيا في الشكل 4 (ط) مع كل من 680 و 800 نانومتر القنوات مبين. فصل الصور عن طريق الطول الموجي، الشكل 4 (الثاني) تمكن كل لوحة على الشريحة RPPA لتحليلها وتحديد بروتين تعبير الفرد الشكل 4 (ثالثا). كما يمكن أن يرى في

Discussion

طريقة RPPA المقدمة هنا يمثل بديلا إنتاجية عالية لأسلوب الإنتاجية لطخة غربية تستخدم على نطاق واسع ولكن منخفضة نسبيا للتحليل البروتين. الأسلوب يسمح مئات العينات لتكون شبه كمي تحليل ومقارنة السماح في نفس الوقت للمقارنة المباشرة من البروتينات الرئيسية في مجموعة واسعة من...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم
أبروتينين	سيجما	A6279
الفوسفاتيز كوكتيل المانع 2	سيجما	P5726
الفوسفاتيز كوكتيل المانع 3	سيجما	P0044
البروتيني المثبط كوكتيل	روش	11836153001
تريتون X-100	تريتون X-	T8787
ليثيوم كو أوديسي حجب العازلة	ليثيوم كور	927-40000
TissueLyser	QIAGEN	85600
MicroGrid II الروبوتية نصاب	Biorobotics
FastFrame 'الشريحة الخليج 4 حامل	WHATMAN	10486001
FAST الشرائح - 2 وسادة	WHATMAN	10485317
IRDye 680LT الماعز المضادة للماوس مفتش	Licor	926-68020
IRDye 800CW الماعز المضادة للأرنب مفتش	Licor	926-32211