تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية

Summary

تسليخ مجهري بالليزر هو الاسلوب الذي يسمح للانتعاش الخلايا المحددة من كميات ضئيلة من حمة. نحن هنا وصف بروتوكول للحصول على الجزر البنكرياسية الإنسان من العينات الجراحية لاستخدامها في الدراسات transcriptomic. لدينا بروتوكول يحسن تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا الإنسان، مما يسهل تحصيلها.

Abstract

تسليخ مجهري ليزر (LMD) هو الاسلوب الذي يسمح للانتعاش الخلايا المحددة والأنسجة من كميات ضئيلة من ^1،2 حمة. ويمكن استخدام الخلايا تشريح لمجموعة متنوعة من التحقيقات، مثل الدراسات transcriptomic أو البروتين، وتقييم أو تحليل الحمض النووي الصبغي ^2،3. تطبيق الصعبة وخاصة من LMD هو التحليل transcriptome، والتي، نظرا لعطوبية من RNA ^4، يمكن أن تكون بارزة بشكل خاص عندما يتم تشريح الخلايا من الأنسجة التي هي غنية من RNases، مثل البنكرياس. بروتوكول تسليخ مجهري التي تمكن تحديد سريع وجمع الخلايا المستهدفة من الضروري في هذا الإطار من أجل اختصار الوقت التعامل مع الأنسجة، وبالتالي، لضمان الحفاظ على RNA.

نحن هنا وصف بروتوكول للحصول على خلايا بيتا في البنكرياس الإنسان من العينات الجراحية لاستخدامها في الدراسات transcriptomic ^5. قطع صغيرة من البنكرياس من حوالي 0،5-1 جوقطعت م ³ من هوامش صحية تظهر العينات البنكرياس مقطوعة، جزءا لا يتجزأ من نسيج تك في مجمع OCT، تجميد فورا في المبرد 2-Methylbutane، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تقطيع. وقطعت أربعين أقسام المسلسل من سمك ميكرومتر 10 على ناظم البرد تحت الإعداد -20 درجة مئوية، بشكل فردي لنقل الشرائح الزجاجية، والمجففة داخل ناظم البرد لمدة 1-2 دقيقة، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

مباشرة قبل الإجراء الليزر تسليخ مجهري، تم إصلاحها في أقسام الجليد الباردة، الطازجة الإيثانول 70٪ لمدة 30 ثانية، وغسلها من قبل 5-6 الانخفاضات في الماء المثلج DEPC المعالجة الباردة، والمجففة بواسطة حضانات دقيقة واحدة اثنين في الجليد٪ 100 الباردة ثم الإيثانول من الزيلين (والذي يستخدم لجفاف الأنسجة) لمدة 4 دقائق، ثم كانت المقاطع النسيجية الهواء المجفف بعد ذلك لمدة 3-5 دقيقة. الأهم من ذلك، جميع الخطوات، ما عدا الحضانة في الزيلين، وأجريت باستخدام الكواشف الجليد الباردة - على تعديل أكثر من بروتوكول موضح سابقا ^6. التحريرأدى ilization من الكواشف الجليد الباردة في زيادة واضحة في تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا، وتسهيل الاعتراف بها. لتسليخ مجهري، وكانت أربعة أقسام المجففة في كل مرة: وضعت اثنين في أنبوب احباط الملفوفة 50 مل، لحماية الأنسجة من الرطوبة وتبييض، وتم على الفور microdissected المتبقيتين. تم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام أداة MicroBeam PALM (زايس) توظيف الضغط ليزر السيارات القذف (AutoLPC) واسطة. الانتهاء من خلايا بيتا / تشريح جزيرة من أربع cryosections لم تعد مطلوبة من 40-60 دقيقة. تم جمع الخلايا في واحدة AdhesiveCap و lysed مع 10 ميكرولتر العازلة تحلل. تم الحصول على عينة الحمض النووي الريبي كل واحد لتحليل عينات transcriptomic من خلال الجمع بين الخلية 10 microdissected، تليها استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام بيكو الصرفة RNA عزل كيت (السماك الرامح). إن هذا البروتوكول يعزز تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا الإنسان، مما يسهل الاعتراف بها سريعة ودقيقة وجollection. يمكن زيادة تحسين هذا الإجراء تمكين تشريح خلايا بيتا مختلفة ظاهريا، مع الآثار المحتملة لتحسين فهم التغيرات المرتبطة بمرض السكري من النوع 2.

Protocol

1. تجميد الأنسجة البشرية البنكرياس

1. إزالة الأنسجة الدهنية، والأوعية الدموية والأعصاب والأنسجة غير متني مع مشرط وملاقط، وقطع الأنسجة البنكرياس إلى قطع (~ مكعبات الطول 0،5-1).
2. ضع قطعة واحدة الأنسجة البنكرياس في وسط Cryomold، وتغطية ذلك تماما مع مجمع الباردة أكتوبر الأنسجة تيك. وضع Cryomold في وعاء أسفل التي تتناول ما قبل المبردة Methylbutane-2 والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل. تخزين العينة المجمدة في درجة مئوية -80

2. إعداد الأبواب المجمدة

1. ارتداء القفازات في جميع الخطوات لتجنب تمسخ من الحمض النووي الريبي.
2. تنظيف السكين ناظم البرد، حامل العينات والرسام من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ وريبونوكلياز بعيدا. وضع الأنسجة المجمدة داخل ناظم البرد.
3. انتظر حتى الأنسجة، وفرشاة سكين تصل -20 ° C. تسمية SuperFrost زائد الشرائح وقبل الباردة منهم داخل غرفة ناظم البرد أثناء انتظارلالأنسجة للوصول إلى -20 ° C.
4. تطبيق الأنسجة تيك مجمع أكتوبر على حامل العينات والأنسجة المجمدة وضع على القمة.
5. مرة واحدة يتم تجميد الأنسجة مجمع أكتوبر تيك تقليم cryoblock وإزالة أي فائض من الأنسجة تيك مجمع أكتوبر بشفرة حلاقة.
6. خفض ما مجموعه 40 ميكرومتر شرائح متتالية 10 من البنكرياس كتلة الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك فإننا نوصي قطع شريحة الأولى والمتوسطة ليتم حفظها لمحة عامة عن الرسومات القسم البنكرياس التي يمكن أن تسهل تحديد الجزر داخل شرائح أثناء عملية تسليخ مجهري.
7. نقل المقاطع من نصل السكين إلى مركز لSuperFrost زائد الشريحة عن طريق لمس المؤخر من الشريحة بإصبعك (مغطاة القفازات) في عملية الاحماء فقط المنطقة التي يجب الالتزام المقطع.
8. تجفيف دقيقة داخل أقسام 1-2 ناظم البرد في -20 ° C، وبعد ذلك كنت وضعت لهم في صندوق الشرائح وضعت على الثلج الجاف. تخزين المقاطعفي -80 ° C.
9. إذا لزم الأمر، وتنظيف شفرة سكين مع المناشف الورقية والباردة الإيثانول بنسبة 100٪.

3. جفاف الأقسام مجمدة

1. إعداد الكواشف: صب 30 مل الطازجة الايثانول 70٪، 30 مل ماء DEPC المعاملة، 2x30 مل الإيثانول بنسبة 100٪ و 30 مل الزيلين إلى 50 مل أنابيب Cellstar (الصقور)؛ البرد والحفاظ على جميع الكواشف (باستثناء الزيلين) على الجليد.
2. تنظيف مساحة العمل تحت غطاء محرك السيارة مع الإيثانول بنسبة 100٪ وRNaseZAP.
3. عملية مزدوجة cryosections على النحو التالي: إصلاح في الجليد الباردة الإيثانول 70٪ لمدة 30 ثانية، وغسل الانخفاضات التي لديها 5-6 السريع في الماء المثلج DEPC المعالجة الباردة، يذوى مرتين لمدة 1 دقيقة في الايثانول الجليد الباردة 100٪، احتضان لمدة 4 دقائق في الزيلين في درجة حرارة الغرفة (25 ° C)، والهواء الجاف لمدة 3-5 دقيقة. كرر هذه الخطوة مع زوج آخر من cryosections.
4. إدراج اثنين cryosections المجففة العودة إلى الوراء في أنبوب 50 مل Cellstar ملفوفة بورق الألومنيوم لحمايتها من الضوء والرطوبة.

<ف الطبقة = "jove_title"> 4. تسليخ مجهري ليزر من خلايا بيتا مع MicroBeam PALM، زايس

1. تنظيف المجهر مع RNaseZAP وتركيب غطاء لاصق في RoboMover.
2. تعيين الإعدادات التالية: مجموعة تصفية 09 (الإثارة: 450-490 نانومتر، والانبعاثات> 515 نانومتر)، وضع AutoLPC، 50٪ طاقة الليزر، ليزر التركيز 65٪، 100٪ سرعة الليزر، 5 ميكرومتر المسافة بين الطلقات AutoLPC، 6 عن بعد ميكرومتر إلى خط، والعمل الإرتفاع: -10100.
3. إدراج شريحة واحدة في المرحلة.
4. تحديد موقع الخلايا بيتا autofluorescent تحت التصور المجهرية (5X عدسة 10X أو).
5. التبديل إلى العدسة 40X، حدد الخلايا بيتا باستخدام أداة "حر" واختيار microdissect لهم باستخدام الليزر.
6. القبض على الأنسجة من أربعة إلى واحد cryosections المجففة AdhesiveCap.
   التعليق 1: الوقت لتشريح خلايا بيتا واحد cryosection المجففة يجب أن لا يكون أطول من 10-20 دقيقة لتجنب الجفاف من المقاطع الأنسجة التي من شأنها أن تؤدي إلىالحمض النووي الريبي التدهور.
   التعليق 2: تحقق من نجاح عملية تسليخ مجهري عن طريق التفتيش البصري بعد انتقاله إلى مرحلة الحاجز.

5. تحلل بيتا من Microdissected خلية الأنسجة اليورانيوم

1. إزالة AdhesiveCap من RoboMover.
2. الماصة 10 ميكرولتر العازلة استخراج (XB، PicoPure RNA عزل كيت، السماك الرامح) في غطاء AdhesiveCap واحتضان رأسا على عقب في 42 لمدة 30 دقيقة درجة مئوية.
3. تدور باستمرار في 10،000 XG ووضع المحللة على الثلج الجاف. تخزينها في -80 ° C حتى يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي.
4. كرر الخطوات من 3) إلى 5.) مع جميع الأقسام الأخرى.

6. RNA استخراج

1. الجمع بين جميع TEN 10 ميكرولتر لست]
2. المضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي من خلال العمل في درجة حرارة الغرفة وفقا للبروتوكول من مجموعة PicoPure عزل الحمض النووي الريبي، السماك الرامح، وذلك باستخدام نسبة 1:1 استخراج الاحتياطي (XB) إلى الإيثانول 70٪ (بما في ذلك الدناز العلاج).

7. تحليل الحمض النووي الريبي

1. استخدم 1 ميكرولتر الحمض النووي الريبي لتحليل نوعية وكمية باستخدام 2100 اجيلنت Bioanalyser (PicoChip). ويتم التقييم الكمي في إشارة إلى معيار RNA تحميل بالتوازي على الرقاقة.

النتائج

كما هو مبين في الشكل 1، أدت بروتوكول تعديل التجفيف في تحسين تألق ذاتي خلايا بيتا مقارنة مع السابق بروتوكول نشر ^6. تطبيق بروتوكول وصفها، وقد استخدم كل من 39 عينات البنكرياس جراحية لإنتاج 40 cryosections المسلسل لمدة متوسطها 31'544'704 عينة الأنسجة ميكرون / البنك?...

Discussion

وصفنا نهج يمكن الاعتماد عليها ليزر تسليخ مجهري (LMD) من عينة من الجزر البنكرياسية الإنسان الجراحية. شريطة أن يكون المجهر LMD متاح، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي مؤسسة بحثية أداء pancreatectomies جزئية، وبالتالي زيادة فرص الحصول على المواد من كلا جزيرة البشرية مواضيع 2 غير السكري ...

Materials

اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
2-Methylbutane (نظير البنتان)	ROTH	3927،1
AdhesiveCap (مبهمة، 500 ميكرولتر)	ZEISS	415190-9201-000
Cellstar أنابيب (50 مل)	غرينر الحيوي واحدة	210 261	مع تنورة الدعم
Cellstar أنابيب (50 مل)	غرينر الحيوي واحدة	227،261
اثيل pyrocarbonate (DEPC)	SIGMA	D 5758
الجليد الجاف
الإيثانول المطلق	VWR	20821.310
النتروجين السائل
رسم فرشاة
PALM MicroBeam	ZEISS
قشر واحد في الطريق قوالب التضمين (اقتطاع)، و 12 × 12 مم	ProSciTech	RR12	22x22 ملم الأعلى الداخلية، وعمق 21 مم
السماك الرامح PicoPure مجمدة RNA عزل كيت	النظم البيولوجية التطبيقية	KIT 0204
البلاستيك المشبك
موسى الحلاقة
ريبونوكلياز خالية من الدناز مجموعة	QIAGEN	79254
RNaseZAP	SIGMA	R 2020
مشرط /شفرة جراحية	قص تكنو	2800111
SuperFrost المجهر التصاق الشرائح بلس	الحرارية العلمية	J1800AMNZ	25x75x1.0 ملم
الأنسجة تيك أكتوبر مجمع	ساكورا	4583 0807000022 أو
ملاقيط	BRAUN	BD168R
الزيلين	VWR	28975.291