JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في تخطيط العضل الضغط، هي التي شنت على شريحة صغيرة سليمة من سفينة على اثنين قنية صغيرة وضغط لضغط اللمعية مناسبة. هنا، نحن تصف طريقة لقياس استجابة ارتخاء وعائي من الفأرة 3 طريق النظام الشرايين المساريقي في C57 وsGCα 1 - / - الفئران باستخدام تخطيط العضل الضغط.

Abstract

نظم مخطاط العضل الضغط هي بشكل رائع مفيد في تقييم وظيفي من الشرايين الصغيرة، ضغط لضغط بطريق مناسبة. في حالة فسيولوجية قرب المحرز في تخطيط العضل الضغط يسمح توصيف متعمقة من الاستجابات الذاتية للمؤثرات الدوائية والفسيولوجية، والتي يمكن استقراء لفي السلوك المجراة من السرير الوعائي. مخطاط العضل الضغط لديها العديد من المزايا أكثر من myographs الأسلاك التقليدية. على سبيل المثال، يمكن دراستها سفن أصغر مقاومة في الضغوط داخل اللمعة لرقابة مشددة وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، علينا أن ندرس قدرة 3 ش النظام الشرايين المساريقي (3-4 مم طويل)، preconstricted مع فينيليفرين، لايتي-الاسترخاء في استجابة لأستيل. هي التي شنت الشرايين المساريقي على اثنين قنية متصلا نظام الضاغط ومختومة أن يتم الحفاظ على الضغط المستمر من 60 مم زئبق. قطر التجويف والخارجي للسفينة هي المستمر وسجلت خبيث باستخدام كاميرا الفيديو، مما يسمح الكمي الوقت الحقيقي من تضيق الأوعية وارتخاء وعائي ردا على فينيليفرين وأستيل كولين، على التوالي.

للتدليل على تطبيق تخطيط العضل الضغط لدراسة مسببات مرض القلب والأوعية الدموية، قمنا بتقييم وظائف الاوعية الدموية التي تعتمد على البطانة في نموذج الفئران من ارتفاع ضغط الدم النظامية. الفئران تعاني من نقص في α 1 الوحيدات من محلقة يعترضه القابلة للذوبان (sGCα 1 - / -) هي ارتفاع ضغط الدم عندما على 129S6 (S6) الخلفية (sGCα 1 -/-S6) ولكن ليس عندما على C57BL / 6 (B6) الخلفية (sGCα 1 -/-B6). باستخدام تخطيط العضل الضغط، علينا أن نظهر أن sGCα النتائج 1 نقص في ضعف ارتخاء وعائي التي تعتمد على البطانة. الخلل الأوعية الدموية أكثر وضوحا في sGCα 1 من -/-S6 في sGCα 1 -/-B6 الفئران، من المحتمل contributiنانوغرام إلى ارتفاع ضغط الدم في sGCα 1 من -/-S6 في sGCα 1 -/-B6 الفئران.

تخطيط العضل الضغط هي تقنية بسيطة نسبيا، ولكن حساسة ومفيدة ميكانيكيا التي يمكن استخدامها لتقييم تأثير مختلف المحفزات على انقباض الأوعية الدموية والاسترخاء، وبالتالي زيادة البصيرة لدينا في الآليات الكامنة وراء مرض القلب والأوعية الدموية.

Introduction

وتستخدم أنظمة مخطاط العضل الضغط لقياس وظيفة فسيولوجية وخصائص الشرايين الصغيرة والأوردة والأوعية الأخرى. هي التي شنت على شريحة صغيرة سليمة من الشريان أو الوريد على اثنين قنية زجاجية صغيرة وضغط لضغط اللمعية مناسبة، والسماح للسفينة للحفاظ على معظم الخصائص في الجسم الحي (الشكلان 1 و 2). في حالة فسيولوجية قرب في مخطاط العضل ضغط يعكس السلوك في الجسم الحي من السرير الأوعية الدموية، مما يسمح التحقيق في الخصائص الذاتية (على سبيل المثال لهجة عضلي) من سفن معزولة. بعض من مزايا تخطيط العضل الضغط على تخطيط العضل الأسلاك، حيث يتم تقييم تقلص العضلات عن طريق اقتران الميكانيكية مباشرة إلى محول القوة 1، وتشمل (ط) أن الشرايين المقاومة الصغرى، التي تحدد المقاومة الشاملة وضعت في نظام الأوعية الدموية، ويمكن دراستها، في حين ومخطاط العضل سلك تقتصر على الشرايين قناة أكبر، (الثاني) ريتم تقليل قبعة من مخاطر تضر البطانة منذ أي أسلاك يجب أن تمرر من خلال التجويف السفينة، (الثالث) أن الشكل الطبيعي للسفينة يتم الاحتفاظ أفضل، و (رابعا) أن البعد سفينة يمكن دراستها في مجموعة واسعة من الضغوط أو إجهاد القص 2.

يمكن دراسة السفن الصغيرة تكون أكثر إفصاحا من دراسة الشرايين قناة أكبر للمساعدة في فهم الآليات الجزيئية الفيزيولوجيا المرضية والتي تساهم في تغير نغمة الأوعية الدموية في أمراض القلب والشرايين مثل ارتفاع ضغط الدم. على سبيل المثال، يمكن أن يظهر ضعف في وظيفة بطانة الأوعية الدموية المرتبطة تغذية الفئران حمية عالية الدهون لمدة 8 أسابيع في 2 ND-النظام الشرايين المساريقي 3 ولكن ليس في حلقات الأبهر (الشكل 3). ميزة أخرى لتخطيط العضل ضغط انقباض عضلي هو أن الجوهرية للسفينة الضغط موجود، وأن دور ووظيفة البطانة في هذه الظاهرة يمكن دراستها. هنا، ونحن أن descrمتد استخدام مخطاط العضل الضغط لدراسة تفاعل الأوعية الدموية من الماوس المساريقي 3 ش النظام الشرايين مقاومة في محيط من أكسيد النيتريك ضعف (NO)، المركب الإشارة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الحل

  1. الأسهم 500X EDTA: تزن 500 ملغ EDTA نا 2 • 2H 2 O وتذوب في 50 مل من الماء منزوع الأيونات. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  2. بوكل إزالة إستقطاب حل.
    1. إعداد محلول المخزون K10X: 3.69 غرام كلوريد الصوديوم، 18.64 ز بوكل، 0.36 G MgSO 4 اللامائية، 0.41 غ KH 2 PO 4، 0.46 G و CaCl 2 • 2H 2 O. تذوب في 250 مل من الماء منزوع الأيونات. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    2. ل100 مل بوكل النهائي إزالة إستقطاب حل 1X: ذوب 0.21 NaHCO 3، 0.18 ز الجلوكوز في 90 مل من الماء منزوع الأيونات. إضافة 10 مل من محلول المخزون K10X. إضافة 95 ميكرولتر من EDTA 500X حل. تخلط جيدا. تخزينها في 4 درجة مئوية. استخدام في غضون أسبوع واحد.
  3. إعداد الطازجة HEPES-PSS حل في يوم من التجربة (1 ليتر).
    1. 6.96 غرام كلوريد الصوديوم، 0.35 ز بوكل، 0.288 غرام MgSO 4 • 7H 2 O، 0.1605 ز KH 2 PO 4، 2.38 G HEPES. تذوب في 100 ملالماء منزوع الأيونات. إجعلها قارورة A.
    2. 0.312 غرام و CaCl 2 • 2H 2 O. تذوب في 100 مل من الماء منزوع الأيونات. احتفالا ب قارورة B.
    3. 1.25 غرام NaHCO 3، 0.991 غرام جلوكوز. تذوب في 98 مل من الماء منزوع الأيونات. احتفالا ب قارورة C.
  4. إضافة 2 مل من EDTA في قارورة 500X C. خذ 700 مل من الماء منزوع الأيونات في قارورة كبيرة. صب محتويات القارورة A، B و C في قارورة كبيرة مع vortexing لالمستمر. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.

2. العقاقير المستخدمة

  1. فينيليفرين (10 -2 M): ذوب 20.37 ملغ في 10 مل من الماء منزوع الأيونات. قسامة 1 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. تمييع متسلسل للحصول على 10 -3، 10 -4، 10 -5، و 10 -6 مول / لتر في اليوم من التجربة.
  2. أستيل كولين (10 -2 M): ذوب 18.17 ملغ في 10 مل من الماء منزوع الأيونات. قسامة 1 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. تمييع متسلسل للحصول على 10 -3، 10 -4، 10 -5، و 10 -6مول / لتر في اليوم من التجربة.

3. الفئران

تم دراسة الفئران على خلفية S6 و B6 طوال هذه الدراسة - ذكر WT وsGCα 1 - /. وsGCα 1 - / - تم إنشاؤها كما هو موضح سابقا 4،5. تمت الموافقة الإسكان والإجراءات التي تنطوي على حيوانات التجارب (الفئران) من خلال اللجنة الفرعية للبحوث رعاية الحيوان من مستشفى ماساتشوستس العام في بوسطن، MA.

4. قياس تفاعل الأوعية الدموية في الشريان المساريقي

  1. الموت ببطء الفئران مع بنتوباربيتال (200 ملغ / كغ، والملكية الفكرية). فتح تجويف البطن وتشريح الأنسجة المساريقي. عزل وتشريح الشريان المساريقي من 3 طريق النظام الحر من الضام والأنسجة الدهنية، ووضع الشريان في الجليد الباردة HEPES-PSS حل قبل معايرتها مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة. قطع حلقات من 2-3 مم طول مع عدم وجود المتفرعة من المساريقيالشريان. التفريق بين الشرايين والأوردة على مستوى السفن الصغيرة هي إشكالية عندما لا يكون هناك دم في الأوعية. ولذلك، فإننا نوصي تحديد السفينة حين انها لا تزال على حالها في الحيوان قبل تشريح بها.
  2. في ملء قنية الزجاج في الضغط مخطاط العضل غرفة (DMT نموذج 110P & 11P الإصدار 1.31، الشكل 2) مع حل HEPES-PSS بمساعدة حقنة 10 مل من خلال مدخل ومخرج الصمامات. ملء قنية وينبغي أن يتم برفق وبعناية كما الضغط المفرط يمكن أن تلحق الضرر محول هشة متصلا قنية. بعد ملء قنية إغلاق كل مدخل ومخرج الصمامات بإحكام.
  3. تحميل واحدة من نهاية السفينة على قنية حق وربط بعناية مع واحد حبلا غرامة من الخيط النايلون. مع مساعدة من حقنة، الاحمرار وملء وعاء مع حل HEPES عبر صمام مدخل. جلب قنية اليسار أقرب إلى السفينة وتحميل الطرف الآخر من السفينة على ذلك. ادراك التعادل مع الدرز النايلون. شغلغرفة مع ما يصل الى 10 مل مع HEPES حل. التحقق من وجود تسرب عن طريق دفع بلطف HEPES حل عن طريق صمام مدخل بمساعدة حقنة.
  4. تثبيت الدائرة على مخطاط العضل وتحت كاميرا الفيديو. بدء الأوكسجين والحرارة (37 درجة مئوية) في القاعة. ربط صمام مدخل مع P1 أنبوب من حل HEPES أول خزان، بينما هو صمام مغلقة. تدع أي فقاعة وتمرير حل من خلال أنبوب حتى عدم وجود فقاعات في أنبوب. فتح صمام.
  5. ربط صمام الأيسر من الغرفة مع P2 أنبوب قادمة من منظم الضغط. مرة أخرى تحقق من وجود أي فقاعات. لا ينبغي أن يكون هناك أي فقاعات أو تسرب في النظام بأكمله.
  6. انتقل إلى القائمة ضغط على لوحة ميو واجهة أو في البرنامج وقم بتشغيل مضخة في حين إيقاف التدفق.
  7. افتح البرنامج وانقر فوق تجميع. ينبغي أن ينظر إلى السفينة على الشاشة الآن (الشكل 3). السفينة هو تصور مع كاميرا تركيبها على المجهر، مما يسمح monitoriنانوغرام وتحليل لمعة السفينة، سفينة القطر، وسمك الجدار.
  8. رفع الضغط تدريجيا interluminal عبر صمام P1 من خلال تحديد الضغط P1 في لوحة ميو واجهة أو في البرنامج وأدخل القيمة الضغط على النحو التالي؛ 5 ملم زئبقي → 10 → 20 → 40 → 60 مم زئبق. سفينة يميل في بعض الأحيان إلى تحريف أو ملفوف في حين الضغط يتزايد؛ ضبط التوتر أو توتر وفقا لذلك مع مساعدة من micropositioner العمودي أو الطولي (الشكل 2). تتوازن هذه السفينة على بعد 60 ملم زئبقي و 37 درجة مئوية على الأقل لمدة 45 دقيقة. تغيير الحل حمام مرة واحدة مع HEPES قبل تحسنت خلال موازنة.
  9. تطبيق 10 مل من بوكل حل إزالة إستقطاب، prewarmed عند 37 درجة مئوية، إلى الحمام ليزيل الاستقطاب تماما خلايا العضلات الملساء وتحقيق أقصى قدر من انقباض. بعد انقباض مستقرة، وشطف الحمام مع HEPES حل 3 مرات كل 10 دقيقة.
  10. التحقق من صلاحية السفينة وسلامة البطانة بواسطة مستقرة والإنجابيردود إيبل إلى إضافة فينيليفرين (10 -5 M) والأستيل كولين (10 -5 M). شطف 3 مرات مع حل HEPES كل 10 دقيقة.
  11. إضافة فينيليفرين (10 -5 م) لpreconstrict السفينة، وعندما تم الحصول على انقباض مستقرة، إجراء منحنى استجابة تركيز-توسع الأوعية التراكمي (CRC) بإضافة متتابعة من جرعات متزايدة من الأستيل كولين (10 -9، 3 × 10 - 9، 10 -8، 3 × 10 -8، 10 -7، 3 × 10 -7، 10 -6، 3 × 10 -6، و 10 -5 م). بعد آخر جرعة، وشطف 3 مرات مع حل HEPES كل 10 دقيقة قبل البدء في CRC جديدة.
  12. تحديد قطر التجويف السلبي من خلال تطبيق كا 2 PSS مجانا + التي تحتوي على 2 ملي EGTA. من اقتفاء مسجل التدبير قطر التجويف لكل الاستجابة للجرعة (الشكل 4)، والتي سيتم استخدامها لحساب جميع المعلمات.
  13. التعبير عن جميع الردود الاسترخاء أستيل كما PERCالتغيير entage في قطر التجويف بعد preconstriction فينيليفرين مقارنة مع الفرق بين قطر خالية من الكالسيوم وقطر بعد انقباض فينيليفرين، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
  14. نسبة تمدد = 100٪ X [(د خ - د ط) / (D كا خالية - D ط)]، حيث D هو قطر التجويف قياس وX، I، وخالية من الكالسيوم دلالة بأقطار الشرياني في كل جرعة من ناهض (خ)، فينيليفرين التالية قطره الأولي انقباض (ط)، وفي كا 2 +-عازلة خالية (خالية من الكالسيوم).

5. التحليل الإحصائي

يتم التعبير عن جميع القياسات المستمرة كما يعني ± SEM. يتم تحليل تفاعل الأوعية الدموية في الشرايين المساريقي بواسطة المتكررة تدابير في اتجاهين ANOVA. في جميع الحالات، P يعتبر <0.05 ذات دلالة إحصائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

NO تشارك مركزيا في الحفاظ على توازن ضغط الدم سواء في البشر 6 و 7 في النماذج الحيوانية. وتتوسط قدرة NO للسيطرة على استرخاء العضلات الملساء الوعائية القابلة للذوبان التي كتبها يعترضه محلقة (SGC)، انزيم heterodimeric المحتوية على الهيم الذي يولد المركب 8. مؤخرا، ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الفئران هي نموذج تجريبي المفضل لكثير من المحققين، وذلك جزئيا بسبب إمكانية إدخال تعديلات وراثية، وبالتالي توليد نماذج الماوس لالفيزيولوجيا المرضية الإنسان. وضع فعال في الأوعية المقاومة الصغيرة ولكن ليس من السفن قناة أكبر يحدد إلى حد كبير تنظيم تدفق الدم في جميع أنح?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

سيكون الكتاب أن نعترف الدكاترة. بول هوانغ وديمتري Atochin للاستخدام من DMT الضغط مخطاط العضل والدكاترة. Binglan يو تشونغ لى وعن توفير الفئران التي تغذت على حمية عالية الدهون أو نظاما غذائيا عاديا.

مصدر التمويل

وأيد هذا العمل من قبل عالم التنمية المنحة 10SDG2610313 من جمعية القلب الأمريكية (لES بايز)، وإلينور ومايلز شور 50 برنامج زمالة الذكرى للعلماء في الطب من كلية الطب في جامعة هارفارد (لES بايز).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClFisher ScientificBP358
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500
KClSigmaP9333
MgSO4 Fisher ScientificM65-500
KH2PO4 SigmaP3786
NaHCO3 Fisher ScientificBP328
NaOHFisher ScientificS318
D-GlucoseSigmaG8270
EDTAFisher ScientificBP121
HEPESSigmaH3375
PhenylephrineAcros OrganicsAC20724
AcetylcholineSigmaA6625
Pressure Myograph SystemDMT

References

  1. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J. Vis .Exp. (55), e3119(2011).
  2. Arribas, S. M., Daly, C. J., McGrath, I. C. Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy. Methods Enzymol. 307, 246-273 (1999).
  3. Lei, C., Yu, B., et al. Inhaled Nitric Oxide Attenuates the Adverse Effects of Transfusing Stored Syngeneic Erythrocytes in Mice with Endothelial Dysfunction after Hemorrhagic Shock. Anesthesiology. , (2012).
  4. Buys, E. S., Cauwels, A., et al. sGCα1β1 attenuates cardiac dysfunction and mortality in murine inflammatory shock models. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297 (2), H654-H663 (2009).
  5. Buys, E. S., Sips, P., et al. Gender-specific hypertension and responsiveness to nitric oxide in sGCα1 knockout mice. Cardiovasc. Res. 79 (1), 179-186 (2008).
  6. Panza, J. A., Quyyumi, A. A., Brush, J. E., Epstein, S. E. Abnormal endothelium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension. N. Engl. J. Med. 323 (1), 22-27 (1990).
  7. Huang, P. L., Huang, Z., et al. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature. 377 (6546), 239-242 (1995).
  8. Friebe, A., Koesling, D. The function of NO-sensitive guanylyl cyclase: what we can learn from genetic mouse models. Nitric Oxide. 21 (3-4), 149-156 (2009).
  9. Ehret, G. B., Munroe, P. B., et al. Genetic variants in novel pathways influence blood pressure and cardiovascular disease risk. Nature. 478 (7367), 103-109 (2011).
  10. Buys, E. S., Raher, M. J., et al. Genetic modifiers of hypertension in soluble guanylate cyclase alpha1-deficient mice. J. Clin. Invest. 122 (6), 2316-2325 (2012).
  11. Kauffenstein, G., Laher, I., Matrougui, K., Guerineau, N. C., Henrion, D. Emerging role of G protein-coupled receptors in microvascular myogenic tone. Cardiovascular Research. 95 (2), 223-232 (2012).
  12. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010: Blood pressure and the kidney. Nat. Rev. Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  13. Michael, S. K., Surks, H. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (18), 6702-6707 (2008).
  14. Mendelsohn, M. E. In hypertension, the kidney is not always the heart of the matter. J. Clin. Invest. 115 (4), 840-844 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

76 NO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved